抗原抗体反应及应用 (2)
抗原抗体的反应原理
抗原抗体的反应原理
抗原抗体的反应原理是生物学中的一个核心概念，它涉及到生物体内复杂的免疫应答机制。
简单来说，抗原抗体反应是免疫系统识别和清除外来入侵者（如细菌、病毒等）或体内异常细胞（如癌细胞）的过程。
抗原是一种能刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）在体内或体外发生特异性结合的物质。
它可以是来自外部的微生物（如细菌、病毒）或其产物，也可以是体内自身产生的异常物质（如癌细胞）。
抗原具有特异性，即只能与相应的抗体或淋巴细胞结合。
抗体是由免疫系统产生的，能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白。
当抗原进入人体后，免疫系统会识别并产生相应的抗体。
抗体与抗原的结合是高度特异性的，即一种抗体只能与一种特定的抗原结合。
这种特异性结合是抗原抗体反应的基础。
抗原抗体反应的过程包括两个阶段：首先是抗原与抗体的特异性结合，这是一个快速而可逆的过程；其次是形成的抗原-抗体复合物的进一步处理，如被其他免疫细胞吞噬、降解或进一步激活免疫反应等。
抗原抗体反应的原理在医学上有广泛的应用，如诊断疾病（如免疫检测、抗原检测等）、治疗疾病（如免疫治疗、疫苗接种等）和研究生物学问题（如分子生物学、免疫学等）。
通过深入了解抗原抗体反应的原理，我们可以更好地理解免疫系统的功能和机制，从而为医学研究和应用提供更好的理论基础和实践指导。
免疫学临床应用
（二） 抗原或抗体的检测方法
凝集反应 沉淀反应 补体参与的抗原抗体反应 免疫标记技术
（一）凝集反应（agglutination）
颗粒性抗原（红细胞、细菌、 乳胶颗粒等）与 抗体特异性结合，形成肉眼可见的凝集块。
1 、直接凝集(direct agglutination) 玻片凝集、试管凝集
2、间接凝集（indirect agglutination） 可溶性抗原包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与相应 抗 体混合出现的凝集现象。
3、细胞因子检测
可用于鉴定分离的淋巴细胞亚群，监测某些疾病状态的细胞免疫功 能。IL-2、IL-2R、rIFN 、TNF等检测。
①免疫学方法：ELISA、RIA等。
②细胞生物学方法 ③分子生物学方法，如聚合酶链反应（PCR）法等
4、体内免疫细胞功能测定：皮肤试验
（1）迟发型超敏反应：旧结核菌素试验（ OT试验 ） 皮试（+）——有一定的细胞免疫能力 皮试（—）——细胞免疫功能缺损
免疫重建(immunoreconstitution)
将免疫功能正常个体的造血干细胞或淋巴细胞移植 给患有免疫功能缺陷的个体，使后者的免疫功能全部 或部分得到恢复。
一、免疫增强疗法和免疫抑制疗法
二、特异性免疫治疗和非特异性免疫治疗
三、主动免疫治疗（active immunotherapy） 和被动免疫治疗（passive immunotherapy）
（三）计划免疫
二、新型疫苗的发展 三、疫苗的应用
1、抗感染 2、抗肿瘤 3、计划生育 4、防止免疫病理损伤
复习题
一、名词解释 凝集反应、沉淀反应、ELISA、人工主动免疫、 人工被动免疫、类毒素、LAK细胞、TIL细胞
二、问答题 1、简述抗原抗体反应的特点。 2、何谓免疫标记技术？简述三大免疫标记技术 的原理和应用。 3、试比较人工主动免疫与人工被动免疫。
临床免疫学抗原抗体反应
第二章抗原抗体反应本章考点1概.述2抗.原抗体反应原理3抗.原抗体反应的特点4抗.原抗体反应的影响因素5抗.原抗体反应的类型第一节抗原抗体反应原理抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原决定簇（表位）和抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性。
这种特性是由抗原、抗体分子空间构型所决定的。
除两者分子构型高度互补外，抗原表位和抗体超变区必须密切接触，才有足够的结合力。
抗原抗体反应可分为两个阶段：第一阶段为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应；第二阶段为可见反应阶段，这一阶段抗原抗体复合物在适当温度、电解质和补体影响下，出现沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合介导的肉眼可见的反应，此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。
在血清学反应中，以上两阶段往往不能严格分开，往往受反应条件（如温度、电解质、抗原抗体比例等）的影响。
（一）抗原抗体结合力抗原抗体是一种非共价的结合，不形成共价键，需要四种分子间引力参与。
1静.电引力：又称库伦引力。
是因抗原、抗体带有相反电荷的氨基与羧基基团间相互吸引的能力，这种吸引力的大小和两个电荷间的距离平方成反比。
两个电荷距离越近，静电引力越大；2范.德华引力：这是原子与原子、分子与分子相互接近时分子极化作用发生的一种吸引力，是抗原、抗体两个大分子外层轨道上电子相互作用时，两者电子云中的偶极摆动而产生的引力。
这种引力的能量小于静电引力；3氢.键结合力：是供氢体上的氢原子与受氢体上氢原子间的引力。
其结合力较强于范德华引力；4疏.水作用力：水溶液中两个疏水基团相互接触，由于对水分子的排斥而趋向聚集的力。
当抗原表位和抗体超变区靠近时，相互间正负极性消失，周围亲水层也立即失去，从而排斥两者间的水分子，使抗原抗体进一步吸引和结合。
疏水作用力是这些结合力中最强的，因而对维系抗原抗体结合作用最大。
图10抗原与抗体的结合力（二）抗原抗体的亲和性和亲和力亲和性指抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定簇之间相适应而存在的引力，它是抗原抗体间固有的结合力。
抗原抗体反应
第二节 抗原抗体反应的特点
1.特异性 2.比例性 3.可逆性 4.阶段性
一、 特异性（specificity）
1、概念：一种抗原分子通常只能与其刺激机体后
产生的抗体结合，这种抗原与抗体结合 反应的专一性称为特异性。
特 异 性 示 意 图
2、决定因素： 由抗原决定簇和抗体分子超变区之间
空间结构的互补性决定的。
Avidity
• The overall strength of binding between an Ag with many determinants and multivalent Abs
Keq =
104
Affinity
106 Avidity
1010 Avidity
二、抗原抗体的结合力
不形成牢固的共价键，通过非共价键结合 这种弱的结合力涉及几种分子间的作用力
3、根据所形成的沉淀物及抗原抗体比例 关系绘制反应曲线。
看书上76表7-1
5、一组概念
最适比(optimal ratio)：是指形成沉淀物最多， 上清液清晰，几乎无游离抗原或抗体的抗原抗体 浓度比。 等价带(equivalencezone)：形成沉淀物最多的 抗原与抗体分子比例合适的范围。 带现象：在等价带前后，由于抗体和抗原过量， 形成的沉淀物少，上清液中可测出游离的抗体或 抗原的现象。 带现象包括 前带(prozone)抗体过量时称为。
1、概念：是指抗原与相应抗体结合成复合物后，在 一定条件下可解离为游离抗原与抗体的特 性称为抗原抗体结合的可逆性。
2、原因：抗原抗体的结合是分子表面的非共价键 结合，因此形成的复合物不牢固。
3、抗原抗体反应动态平衡式如下：
4、决定抗原抗体解离的因素
抗原抗体反应
抗原抗体反应
第2页
• 4、前带现象:抗原抗体反应该抗体量过时,不出现 可见反应。
• 5、后带现象:抗原抗体反应该抗原量过剩时,不出 现可见反应。
• 1929年Heidelberger利用等量抗体检测浓度递增抗 原，当抗原浓度较低，抗体浓度相对较高时，沉淀 反应不显著；当抗原浓度增加到与抗体浓度百分比 适当时，沉淀反应显著；继续增加浓度时，沉淀反 应反而减弱。据此绘出双对应答曲线，曲线高峰区 域，抗体、抗原浓度呈最适比，沉淀反应显著，称 等价带。高峰区域左侧，因为抗体浓度过高，沉淀 反应不显著，称前带；高峰区域右侧，因为抗原浓 度过高，沉淀反应也不显著，称后带。抗体浓度过 高所致结果称前带现象，抗原浓度过高所致结果称 后带现象，统称为带现象。1977年Green把此现 象称为钩状效应（hook effect），包含前后带现象 。
抗原抗体反应
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抗原抗体特异性是指抗原分子上抗原决
定簇和抗体分子超变区结合特异性，由二者 之间查问结构互补决定。抗体分子VH 区和 VL 区上各自含有三个高变区共同组成抗原 结合部位，该部位形成一个与抗原决定簇互 补槽沟，决定了抗体特异性。所以，在抗原 抗体反应免疫学试验中，能够用已知抗原或 抗体来检测对应抗体或抗原。但较大分子蛋 白质常含有各种抗原表位。假如两种不一样 抗原分子上有相同抗原表位，或抗原、抗体 间构型个别相同，皆可出现交叉反应。
抗原抗体反应
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二、抗原抗体反应特点
• 抗原抗体反应特点主要有三性：即特异性、
百分比性、可逆性。
（一）特异性：
是抗原抗体反应最主要特征，这种特异性 是由抗原决定簇和抗体分子超变区之间空间 结构互补性确定。这种高度特异性在传染病 诊疗与防治方面得到有效应用。伴随免疫学 技术发展进步，还将在医学和生物学领域得 到愈加深入和广泛应用，比如肿瘤诊疗和特 异性治疗等。
抗原与抗体的作用机理及其应用
抗原与抗体的作用机理及其应用抗原和抗体是非常重要的生物学概念，在许多领域都有广泛应用。
它们是免疫系统中的两个关键组成部分，旨在保护身体免受疾病的侵袭。
本文将探讨抗原与抗体的作用机理及其应用。
一、抗原与抗体抗原是指任何能够诱导人体免疫系统产生应答的物质。
它可以是蛋白质、多糖体、脂质、核酸等生物大分子，也可以是简单的小分子。
通常被认为是抗原的是蛋白质和多糖体，这些物质通常比较容易被免疫系统识别和反应。
抗体是人体免疫系统对抗原的免疫应答，它是由B淋巴细胞分泌的一种特定蛋白质。
每种抗体都与特定的抗原相结合，形成一个抗原-抗体复合物。
抗体可以分为五种类型：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。
IgG是最常见的，占所有抗体的75%以上。
二、抗原-抗体反应的机理抗原-抗体反应是基于互相配对的原则，每个抗体能够与一个特定的抗原结合，在结合的过程中，抗原和抗体之间的“钥匙-锁”的作用非常重要。
抗体的结构非常独特，它们由一个Y形结构组成，每个Y端都有一对相同的抗原结合位点。
抗原结合位点是一系列氨基酸残基，它们的序列非常特定，通常只与一种特定的抗原相匹配。
当抗原进入人体时，它会被免疫系统识别并产生反应。
这样，B淋巴细胞开始分泌抗体。
一旦抗体遇到它与之匹配的抗原，它们会立即结合成复合物。
这样一来，抗原-抗体复合物就被认为是外来物质，它们由巨噬细胞或其他免疫系统细胞清除。
三、抗原与抗体的应用1. 感染诊断：抗体与特定感染病原体结合的能力可以用于诊断疾病。
常见的诊断方法是ELISA（酶联免疫吸附法），这是一种基于特定抗体与病原体抗原结合的技术，常用于检测 HIV、肝炎病毒、结核等疾病。
2. 血型识别：人类红细胞表面有大量的血型抗原，不同的血型抗原所对应的抗体也是不同的。
因此，通过检测某人的血液中是否含有一定类型的抗体，我们可以判断他们的血型。
3. 免疫治疗：抗体可以用于治疗各种疾病。
例如，单克隆抗体可以用于治疗某些癌症、风湿性关节炎等自身免疫性疾病。
抗原抗体杂交原理及应用
抗原抗体杂交原理及应用抗原抗体杂交（Antigen-Antibody Hybridization）是一种基于特异性抗原与抗体之间相互结合的原理，通过将具有互补性的抗原和抗体结合在一起，来检测目标分子的存在和浓度。
这种技术被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物工程等领域。
抗原抗体杂交的原理是基于抗原与抗体间的专一性和互补性相结合。
抗原是一种能触发免疫系统产生特异性抗体的分子，通常是蛋白质或多糖体。
抗体是机体免疫系统生成的一种针对特定抗原的蛋白质，具有亲和力和专一性。
抗原与抗体之间的形成是通过特异性的非共价键结合力，如氢键、离子键、范德华力等。
通过这种结合作用，抗原与抗体可以形成稳定的抗原抗体复合物。
在抗原抗体杂交的实验中，常使用的方法是通过将抗原和抗体标记上标记物，如酶、放射性同位素、荧光物质等，来检测是否存在目标分子。
具体步骤如下：1. 准备抗原和抗体：纯化或合成目标抗原，然后选取特异性高的抗体。
2. 标记标记物：将酶、放射性同位素或荧光物质标记到抗原或抗体上，使其能够发出可观察的信号。
例如，可将酶标记的抗体添加到抗原溶液中形成抗原抗体复合物。
3. 条件处理：对抗原抗体复合物进行条件处理，如洗涤、加热、离心等，以去除非特异性结合的物质，提高特异性。
4. 检测信号：根据标记物的类型，可选择相应的检测方法来检测抗原抗体复合物的形成。
例如，对于酶标记物，可通过添加底物并观察颜色的改变来检测；对于荧光物质，可使用荧光显微镜观察发光信号。
抗原抗体杂交的应用范围广泛，主要包括以下几个方面：1. 生物医学研究：抗原抗体杂交在生物医学研究中起着重要作用，可用于检测和定量目标抗原的存在和浓度，如检测病毒感染、细胞表面分子、药物浓度等。
2. 临床诊断：抗原抗体杂交技术可以用于临床诊断，如检测血清中的特定抗原或抗体，诊断疾病，如乙肝、艾滋病等。
3. 食品安全：抗原抗体杂交技术可用于食品安全检测，如检测食品中的微生物污染物、残留农药等。
抗原抗体反应及应用
第七章抗原抗体反应及应用不论天然的还是人工合成的分子，只要能被机体的免疫系统识别的都可以诱导机体的免疫应答，产生相应的抗体。
大多数抗体和抗原本身是既有免疫原性(诱发产生特异抗体)，又有反应原性(与特异的抗体相结合)。
抗原与抗体的特异性反应不仅可以在体内进行，而且可以在体外进行。
一切利用血清学技术方法所进行的各种测试都是基于这一根本的特性。
抗体反应技术的应用之广泛已经远远超出了免疫学、医学、甚至生命科学的范围，成为—类微量，灵敏，快速的检测分析方法。
本章着重介绍抗体制备，抗体抗原反应原理及技术方法的应用。
第一节抗体的制备环境中的大部分生物(包括病原生物)及其产物分子和一些化合物对哺乳动物的免疫系统而言是外源抗原，这些抗原能通过侵染或其他的途径刺激免疫系统，产生以抗体为主的体液免疫应答。
同样用抗原人工免疫实验动物，可以获得含有特异性抗体的血清，称为抗血清(antiserum)，因血清中抗体是多个抗原决定簇刺激不同B细胞克隆而产生的抗体，所以称多克隆抗体(polyclonal antibody)。
一个B细胞克隆所分泌的抗体即为单克隆抗体。
用免疫动物的B细胞与骨髓瘤细胞融合，在体外可以分离出许多单个B细胞克隆，以此方法可制备单克隆抗体(monoclonal antibody)。
随着分子生物学技术的发展，已经可以用抗体基因文库(antibody combinatorial library)筛选制备单克隆抗体。
应用基因工程技术，根据需要对抗体进行改造，获得基因工程抗体(engineering antibody)，以及催化性抗体(catalytic antibody 或abozyme)等的全新的抗体。
一、抗血清的制备1．免疫动物(1)抗原：免疫动物是制备抗血清的第—步。
免疫所用的抗原可用病毒、细菌或者其他蛋白质抗原，如果使用半抗原如小分子激素等，必须与大分子载体连接，连接剂见表7—1。
抗原的用量视抗原种类及动物而异，—次注射小鼠可以少至几个微克，免、羊甚至更大的动物每次注射的量就相应增加，从几百μg／次至几mg／次。
抗原抗体反应及其应用
抗原 + 抗体
(亲水胶体) (亲水胶体)
抗原抗体复合物 电解质 可见反应
(疏水胶体)
(沉淀)
二、抗原抗体反应的类型
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抗原抗体反应的类型
反应类型 沉淀反应 凝集反应 补体参与反应 中和反应 免疫标记
抗原 可溶 颗粒 细胞 毒素等 标记
抗体 无标记 无标记 无标记 无标记 或 标记
补体 无 无 有 无 无
副流感病毒
23
2、放射免疫技术及其应用
用放射性同位素标记技术来检测抗原抗体反应的高灵敏度方法。 反应特点：灵敏，精确；不稳定 ；安全性差
标记Ag或Ab
标记物纯化
抗原抗体反应
现临床实验室 应用较少
测定其放射活性
抗原抗体复合物沉淀
广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、 小分子药物和肿瘤标志物的定量分析等
Ab - Ag
洗涤 Ab酶
Ab - Ag - Ab酶
② 间接夹心法
Ag 酶标板吸附抗体
Ab － Ag 1Ab
洗涤 2Ab酶
Ab －Ag－1Ab－ 2Ab酶
Ab － Ag－ 1Ab 底物
显色反应
28
酶联免疫吸附实验——夹心法
29
3、酶免疫技术的应用
ELISA 应用的范围很广，而且正在不断地扩大。 临床实验室主要应用于： 1、传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、乙肝三对、 丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮 状病毒等； 2、细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等； 3、也用于一些蛋白质的检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿 瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）
13
抗体和大多数抗原同属蛋白质。在通常的血清学反应条件下均带有负电荷， 使极化的水分子在其周围形成水化层，成为亲水胶体，因此蛋白质不会自行凝 集出现沉淀。当抗原与抗体结合后，表面电荷减少，水化层变薄;而且由于抗原 抗体复合物形成后，与水接触的表面积减少，由亲水胶体转化为疏水胶体。此 时在电解质(如NaCl，的作用下，使各疏水胶体之间进一步靠拢、沉淀，形成可 见的抗原抗体复合物。
抗原抗体相互作用原理解析
抗原抗体相互作用原理解析抗原抗体相互作用原理解析导语：抗原和抗体是免疫系统中至关重要的成分，它们之间的相互作用在疾病诊断、医学研究以及疫苗开发等领域起着重要的作用。
本文将详细解析抗原抗体相互作用的原理，包括抗原和抗体的定义、结构、相互作用方式及其应用。
一、抗原和抗体的定义1. 抗原：抗原是引起免疫系统产生免疫应答的物质，可以是蛋白质、多肽、糖类、脂质等。
抗原通常呈现在病原体（如细菌、病毒等）表面，并被免疫系统识别。
抗原可以激活B细胞和T细胞，引发特异性免疫应答。
2. 抗体：抗体是由B淋巴细胞分泌的免疫球蛋白，也称免疫球蛋白或γ球蛋白。
抗体能够识别和结合抗原，形成抗原-抗体复合物，从而中和、清除病原体或起到调节免疫应答的作用。
二、抗原抗体的结构1. 抗原结构：抗原具有特定的结构，分为内源性抗原和外源性抗原。
内源性抗原由机体自身产生（如自身抗原），外源性抗原来自外部环境（如细菌蛋白）。
抗原分子通常具有呈递位点（epitope），是抗体识别和结合的关键位点。
2. 抗体结构：抗体是由两类多肽链组成的，包括重链和轻链。
每条链包含一个可变区和一个恒定区。
抗体的可变区决定了其特异性，能够与特定抗原结合。
抗体的恒定区决定了其效应，包括中和病原体、激活免疫细胞等。
三、抗原抗体的相互作用方式1. 亲和力：抗原与抗体的相互作用是通过亲和力来实现的。
亲和力是指抗原和抗体之间结合的力量大小。
亲和力取决于抗原和抗体的结构、电荷及溶剂环境等因素。
2. 特异性：抗原和抗体之间的相互作用是高度特异性的。
抗体能够识别并与特定抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
这种特异性是由于抗体的可变区和抗原的呈递位点的相互匹配。
3. 互补性决定区：抗原与抗体之间的结合是通过互补性决定区（CDR）实现的。
CDR是抗体可变区的一部分，具有高度可变性。
CDR可以与抗原的呈递位点形成紧密结合，从而形成稳定的抗原-抗体复合物。
四、抗原抗体相互作用的应用1. 诊断：抗原抗体相互作用在疾病诊断中起着重要作用。
抗原抗体反应及应用
共同决定簇
决定簇相似
交叉反应
抗原与抗体反应中量的关系
当抗体与抗原结合时，如果是颗粒抗原，则出现凝 集现象；如果是可溶性抗原，则产生沉淀作用。这些可见 现象的出现是以抗原与抗体反应特异性和亲和力为基础的， 同时也是抗原抗体反应的继发过程。
四、阶段性
第一阶段：特异性结合阶段，反应快，不可见
第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集、 沉淀和 细胞溶解等现象
抗原抗体结合力
静电引力 （electrostatic forces） 范德华引力:作用最小 （van der Waals interactions） 氢键:最具特异性 （hydrogen bond ） 疏水作用力:作用最大 （hydrophobic interactions）
抗原抗体结合力示意图
小于静电引力。
3.氢键结合力
供氢体上的氢原子与受氢体原子间的引力。在抗原抗 体反应中，羧基、氨基和羟基是主要供氢体，而羧基 氧、羧基碳和肽键氧等原子是主要受氢体，能的大小
取决于方向即氢键具有高度的方向性，因此范德华力
更具有特异性。氢键结合力与供氢体和受氢体之间距 离的6次方成反比，键能约20〃9kJ/mol。
3.亲水胶体转化疏水胶体
一、抗原抗体结合力
抗原和抗体的结合虽然是互补性的特异性结合，但并不形 成牢固的共价键，只是通过非共价键结合，结合方式类似
蛋白质和细胞受体或酶与底物之间的结合。抗原与抗体这
种弱的结合力涉及下列几种分子间的作用力。
l. 静电引力
抗原和抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互 的引力，称为静电引力 ，又称库伦引力 。例如，抗体分
子上带电荷的碱性氨基酸的游离氨基(--NH3+和酸性氨基
抗原抗体反应及应用 (2)
-NH2/-SH MBS法、SMPT法、SMBT法
佐剂的使用：佐剂与抗原按1：1比例混合乳化
信阳农业高等专科学校生物技术系
动物的选择
抗原与免疫动物的种属差异越远越好。
对蛋白质抗原，大局部动物皆适合常用的是山羊 和家兔；甾体激素免疫多用家兔；酶类免疫多用 豚鼠。
抗血清量的需要：大动物如马、骡等可获得大量 血清〔一头成年马反复采血可获得10000ml以上 的抗血清〕；但有时抗体需要是不多，选用家兔 或豚鼠即可。
HAT的RPMI1640〕
信阳农业高等专科学校生物技术系
单抗制备的技术
抗原提纯与动物免疫 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 细胞融合 HAT法筛选杂交瘤细胞 阳性细胞的筛选、单克隆化与保存 单克隆抗体的制备与纯化
信阳农业高等专科学校生物技术系
抗原提纯与动物免疫
抗原纯度越高越好，尤其是初次免疫抗原。
信阳农业高等专科学校生物技术系
动物采血法
颈动脉放血法：这是最常用的方法，对家兔、山 羊等动物皆可采用。
心脏采血法：此法多用于豚鼠、大鼠、鸡等小动 物。此法采血技术应熟练，穿刺不准容易导致动 物急性死亡。
静脉屡次采血法：家兔可用耳中央静脉，山羊可 用颈静脉。这种放血法可隔日一次，有时可采集 多量血液。
信阳农业高等专科学校生物技术系
免疫途径
一般采用多点注射，一只动物注射总数约为 8~10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部两 侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，免疫效果较好； 亦有肌肉、腹腔、静脉注射途径。 ➢ 腹腔、肌肉、皮内、皮下注射适合使用任何 抗原，刺激局部淋巴结发生免疫应答； ➢ 静脉注射适合可溶性抗原及分散的单细胞悬 液，不使用佐剂，免疫应答主要发生在脾脏。
信阳农业高等专科学校生物技术系
抗原抗体反应及应用
抗原抗体反应及应用抗原抗体反应是一种生化反应，促进身体对抗病原体的自我保护能力，并在医学实践中被广泛应用。
本文将介绍抗原抗体反应的基本原理，其应用领域以及优缺点。
抗原抗体反应是一个复杂的生化过程，其中抗体与抗原结合以形成抗原抗体复合物。
抗原在细胞膜、细胞质或者体液中存在，并被识别并结合到抗体上。
抗体是一类特异性免疫球蛋白，由B细胞产生，可识别和结合特定的抗原，从而使抗原和抗体形成复合物。
一旦抗原与抗体结合，抗原抗体复合物可以引导免疫系统去清除该抗原，促进炎症反应，保护机体不受感染。
在医学诊断和治疗中，抗原抗体反应是广泛应用的生化工具。
例如，许多皮肤测试和血液检查都基于抗原抗体反应的基本原理。
一些经典的应用领域包括：1. 疾病诊断：许多疾病都通过测定患者血液、尿液或其它体液中的特定抗体来诊断。
例如，在艾滋病的检测中，人体是否有HIV抗体的结果是决定感染的关键。
2. 疫苗开发：疫苗的开发需要了解病原体抗原与抗体之间反应的性质。
以流感疫苗为例，疫苗内含特定的流感病毒抗原，因此它们诱导了机体产生特定的抗体，提供对流感病毒的免疫保护。
3. 治疗检测：在很多情况下，患者是否对某种疾病治疗有效依赖于抗体的产生。
例如，在微生物感染后，B细胞通常会产生降低病菌数量的抗体。
4. 体外诊断：还可以利用抗原抗体反应开发出便捷、快速、灵敏的体外诊断工具，诊断医疗所需的抗体复合物数量。
尽管抗原抗体反应在医学领域中发挥着重要的作用，但其也有缺点。
首先，抗原抗体反应是一种非特异性的反应，它在识别抗体时有时会产生“误报”。
第二，使用抗原抗体反应进行疾病诊断需要取样，样品来源和质量等因素都会影响检测结果的准确性，许多情况下需要多次测试来确认确诊结论。
最后，抗原抗体反应检测也存在着一定的技术限制，许多新兴方法包括PCR和免疫贴法不断完善。
综上所述，抗原抗体反应是一种广泛应用于医学诊断和治疗的生物学工具。
尽管其有缺点，但其准确性大大提高了其在测量和检测特定标志物和疾病诊断中的作用，因此这种方法在未来仍将继续发挥其重要作用。
抗原抗体反应原理的应用
抗原抗体反应原理的应用1. 什么是抗原抗体反应抗原抗体反应是指抗原与抗体之间的特异性结合作用。
抗原是能激发机体产生特异性抗体的物质，可以是病原体、细胞表面分子、药物、化学物质等。
抗体是机体针对抗原产生的一类蛋白质，可以识别并结合特定的抗原，从而引发免疫反应。
抗原抗体反应是免疫系统中重要的机制，广泛应用于疾病的诊断、治疗和科研领域。
2. 抗原抗体反应原理抗原与抗体的结合是通过抗原-抗体互相作用的特定结构域来实现的。
在抗原分子上，有一些特定的结构域，称为抗原决定簇（epitope），与抗体分子上的特定结构域，即抗体结合位点相互匹配。
抗体结合抗原的过程涉及多种非共价相互作用，包括离子键、氢键、疏水作用和范德华力等。
3. 抗原抗体反应在疾病诊断中的应用抗原抗体反应在疾病诊断中具有广泛的应用。
以下是几个常见的应用例子：3.1 免疫层析检测法免疫层析检测法是利用抗体和抗原特异结合的原理进行疾病标记物检测的一种方法。
例如，妊娠试纸可以通过检测孕酮和人绒毛膜促性腺激素（hCG）等抗原来确定是否怀孕。
该方法简单、快速、便携，被广泛用于体外诊断。
3.2 免疫荧光检测免疫荧光检测（immunofluorescence）利用抗原与荧光标记的抗体结合来检测抗原的存在和分布。
这种检测方法可以用于病原体的诊断，例如，通过检测细胞表面的特定抗原来确认某种病毒或细菌的感染。
3.3 酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）利用酶标记的二抗与特定抗原或抗体相互作用，通过测量酶的催化反应来定量检测抗原或抗体的含量。
ELISA方法在临床实验室中广泛应用于疾病的诊断，如乙肝病毒抗原和抗体的检测。
3.4 免疫组织化学染色免疫组织化学染色是通过特定抗体与抗原结合的原理来检测组织切片中特定抗原的存在和分布。
这种方法常用于肿瘤诊断，可以通过染色来判断是否存在某种肿瘤相关抗原的表达。
临床免疫学：抗原抗体反应
• 前带(prezone)：抗体过量
• 后带(postzone)：抗原过量
三、可逆性（reversibility）
• 是指抗原与抗体结合成复合物后，在一定 条件下可解离为游离抗原与抗体的特性
第二节抗原抗体反应的原理
一、空间互补关系: • 抗原表位与抗体超变区分子间的结构互补
性与亲和性 • 抗原表位与抗体超变区密切接触 • 高度互补使抗原抗体之间有足够的结合力 • 亲水胶体转化为疏水胶体
二、抗原抗体结合力：抗原抗体是非共价键 结合，弱结合力
●静电引力(eletrostatic forces):是抗原抗体分子 中带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互的引力 ,两个电荷距离越近,静电引力越大.
• 抗原大都是多价，抗体多 为二价，等价带结合时， 抗体的两个Fab段可分别与 两个抗原分子表面的抗原 表位结合，相互交叉连接 成具有立体结构的巨大网 格状聚集体，形成肉眼可 见的反应物。
• 等价带（equivalence zone)：抗原抗体比例合适的 范围
• 最适比(optimal ratio):抗原抗体复合物形成最多 ，上清液中几乎无游离的抗原与抗体存在
●范德华引力(vander Waals forces):抗原和抗体相 互接近时,由于分子的极化作用而出现的引力 .
●氢键结合力(hydrogen bonding forces)：供氢体 上的氢原子与受氢体原子间的引力
●疏水作用力(hydrophobic forces)：两个疏水基团 在水溶液中相互接触时,由于对水分子排斥而趋向 聚集的力.
第四节 抗原抗体反应的影响因 素
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单抗制备的原理
• MAb是单一B细胞克隆产生的，其特异性是针对一个抗原决定簇的，它是B细胞克隆的 标志。
• 为使B细胞在体外能长期存活，Kǒhler和Milstein于1975年创建了杂交瘤方法。其基本 原理是：将分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能长期体外培养但不能分泌抗体的瘤细 胞融合，筛选出既能分泌抗体又能长期体外培养的杂交瘤细胞，然后单克隆化，并扩 大培养，从而进行单抗生产。
2011春夏
动物采血法
• 颈动脉放血法：这是最常用的方法，对家兔、山羊等动物皆可采用。 • 心脏采血法：此法多用于豚鼠、大鼠、鸡等小动物。此法采血技术应熟练，穿刺不准
容易导致动物急性死亡。 • 静脉多次采血法：家兔可用耳中央静脉，山羊可用颈静脉。这种放血法可隔日一次，
有时可采集多量血液。
2011春夏
2011春夏
抗血清的鉴定
• 效价鉴定： • 效价又称滴度（titer），是表达抗血清中特异性抗体相对含量的一个半定量指标， 即在一定条件下结合一定量抗原的抗血清的稀释度。
• 亲和力鉴定： • 亲和力（affinity）指抗血清与相应抗原结合的强度，是描述抗体特异性的重要指标 ，常用亲和常数K表示。
2011春夏
改型抗体
• 结构： • 将鼠单抗的CDR移植至人源抗体可变区，替代人源抗体CDR，故又称CDR移植抗体 。
• 特点： • 抗体CDR直接决定抗体的特异性，改型抗体使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合 特异性，同时减少其异源性。
2011春夏
双特异性抗体
• 结构特点： • 由异源性的H2＋L2构成，具备结合两种不同抗原的特点，又称双功能抗体。
• 单链抗体scFv由VH－连接肽－VL组成，它质量很小，作为异种蛋白抗原性较小， 组织穿透力强，是目前研究最活跃的基因工程抗体之一，可用噬菌体转染细菌大 量制备。
• 其他小分子抗体还有：Fab、Fv，单域抗体（VH），最小识别单元（CDR）等。
2011春夏
基因工程抗体的种类及其特性
种类
基本结构
相对分子 鼠源性 质量(kD) 成分
染色体 DNA
2011春夏
阳性细胞的筛选、单克隆化与保存
• 筛选 • ELISA、Dot-ELISA、凝集试验、免疫印迹、免疫荧光试验
• 单克隆化 • 有限稀释法 • 荧光激活细胞分拣法（FACS）
• 保存 • 冰冻保存，温度越低越好，研究显示，液氮保存的细胞株活性仅有轻微下降。
2011春夏
单克隆抗体的制备与纯化
抗血清的纯化与保存
• 试血、采血：加强免疫后2－3次，可通过耳静脉或眼球采血，进行抗血清效价测定， 当效价达到理想高度，可以心脏直接采血或动脉放血。待血凝后用针筒或吸管吸取血 清。
• 抗血清纯化：盐析、层析(离子交换、分子筛、亲和层析)。 • 保存：低温冻存，冻干、加保护剂（叠氮化钠NaN3或BSA）4℃保存。
人－鼠嵌合抗体
鼠源V区/Fab＋人源 C区/Fc
150
25%~30%
改型抗体
以鼠源CDR替换人源 CDR
150
15%
双特异性抗体
异源性H2/L2
Fab
完整L链和部分H链
小
Fv
分
子 单链抗体
抗 体
单域抗体
最小识别单元
VH非共价连接VL VH－连接肽－VL
VH 单一CDR
2011春夏
150 50 25 26 12.5 ﹤2
• 单抗的纯化方法与多抗相同。
2011春夏
7.1.3 基因工程抗体
• 基因工程抗体是利用DNA重组技术，在基因水平上对Ig分子进行剪接、修饰，甚至是 人工合成后导入受体细胞表达，而制备的一种新型抗体。
• 根据基因工程抗体的结构不同，可以分为： • 人－鼠嵌合抗体 • 改型抗体 • 双特异性抗体 • 小分子抗体
• 筛选出阳性细胞株进行抗体制备，有两种方法： • 增量培养法：即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体，如大瓶 培养法、中空反应器法。 • 最普遍采用的是小鼠腹腔接种法：将杂交瘤细胞接种到弗氏佐剂处理的BALB/c小 鼠腹腔中去，通常在接种一周后即有明显的腹水产生，抗体含量较高且杂蛋白较 少，每只小鼠可收集5~10ml的腹水。
2011春夏
7.2.1 抗原抗体反应原理
• 抗原抗体反应可分为两个阶段： • 抗原与抗体发生特异性结合，此阶段仅需几秒至几分钟，不出现可见反应。 • 可见反应，此阶段抗原抗体复合物在环境因素的影响下，进一步交联集聚，表现 为凝集、沉淀、中和、溶解、补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。
• 抗原抗体反应原理： • 抗原抗体间的作用力 • 亲水胶体转化为疏水胶体
2011春夏
单抗制备的技术
• 抗原提纯与动物免疫 • 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 • 细胞融合 • HAT法筛选杂交瘤细胞 • 阳性细胞的筛选、单克隆化与保存 • 单克隆抗体的制备与纯化
2011春夏
抗原提纯与动物免疫
• 抗原纯度越高越好，尤其是初次免疫抗原。 • 选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c（巴比塞）健康小鼠，鼠龄在8~12周，雌雄不限
，可同时免疫3~4只小鼠。 • 免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而
异，以获得高效价抗体为最终目的，免疫间隔一般2~3周。 • 末次免疫后3~4天，取出脾脏组织，制成单细胞悬液。
2011春夏
骨髓瘤细胞与饲养细胞的制备
• 选择瘤细胞株应用最多的是源自BALB/c小鼠的Sp2/0骨髓瘤细胞株，要求是次黄嘌呤鸟 嘌呤核苷酸转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）缺陷型（HGPRT-，TK-）。融合 时应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于95％）。
2011春夏
7.1.5 单抗的医学应用
• 单克隆抗体的均一性和生物活性单一性，使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标 准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下： • 单克隆抗体具有灵敏度高、特异性好的特点，可用于各类病原体的诊断，这是单 克隆抗体应用最多的领域。 • 对肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原进行检测，用于肿瘤的诊断、分型及定位。
2011春夏
HAT法筛选杂交瘤细胞
• 哺乳动物DNA合成的两条途径：
do novo pathway 从头合成途径
磷酸核糖
叶酸
焦磷酸
尿嘧啶 氨基蝶呤（A）
核苷酸
salvage p athway
胸腺嘧啶（T）
胸腺嘧啶激酶 （TK）
核
替代合成 途径
次黄嘌呤（H）次苷黄酸嘌转呤移鸟酶嘌（呤HG核
苷 酸
PRT）
• 抗体特异性鉴定： • 常用琼脂双扩散法鉴定抗体特异性。
2011春夏
7.1.2 单克隆抗体的制备
• 单克隆抗体（monoclonal antibody，MAb）——由单一B细胞克隆合成并分泌的一 种组成均一的免疫球蛋白分子，简称单抗。 • 单抗制备的原理 • 单抗制备的材料 • 单抗制备的技术 • 单抗制备流程图
• 多克隆抗体(polyclonal antibody)：抗血清中抗体是多个抗原决定簇刺激不同B细胞产 生的抗体，所以称为多克隆抗体。
2011春夏
抗原的准备
• 半抗原与载体偶联制备完全抗原
• 常用的连接反应及双功能连接剂
连接基团 连接方法（连接剂）
碳二亚胺（EDC）法、混合酸酐（MA） -NH2/-COOH 法、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）法
• 本章小结 • 课后思考题
7.1.1 抗血清的制备
• 抗原的准备 • 免疫动物
• 动物的选择 • 免疫途径 • 免疫剂量与周期 • 动物采血法 • 抗血清的纯化与保存 • 抗血清的鉴定
2011春夏
抗血清与多克隆抗体
• 抗血清(antiserum)：用抗原人工免疫实验动物，可获得含有特异性抗体的血清，称为 抗血清。
第七章 抗原抗体反 应及应用
本章提要
• 抗体的制备与应用 • 抗血清的制备 • 单克隆抗体的制备 • 基因工程抗体 • 催化性抗体 • 单抗的医学应用
• 抗原抗体反应 • 抗原抗体反应原理 • 抗原抗201体1春夏反应特点
• 常见免疫分析方法 • 沉淀反应 • 凝集反应 • 免疫标记技术 • 补体参与的抗原抗 体反应 • 免疫分析灵敏度
• 在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，需加入饲养细胞，常用的饲养细胞为小鼠腹腔 细胞，可用冷冻果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出腹腔液即可，其中多为巨 噬细胞。
2011春夏
细胞融合
• 细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，其基本步骤如下： • 骨髓瘤细胞与脾脏细胞混合（ 1:2～1:10 ）培养，培养液中小牛血清、各种离子和 营养成分需严格配制，以保证融合效率； • 加入40％（W/V） PEG1000~2000使细胞融合； • 1min后滴加4.5ml培养液；间隔2min滴加5ml培养液，尔后加培养液50ml稀释，消 除PEG的作用。
2011春夏
免疫剂量与周期
• 免疫剂量： • 抗原用量视抗原种类及动物而异，一般大动物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约0.5 ~1mg/只，小动物约0.1~0.6mg/只。
• 免疫周期： • 初次免疫后，再经2～3次以上的加强免疫，一般3～4周间隔适合大部分动物，小 动物10～14天，大动物2月左右。
2011春夏
• 检测淋巴细胞的表面标志，用于区分细胞亚群和细胞分化阶段。 • 应用单克隆抗体和免疫学技术，可对机体的多种微量成分进行测定，以便判断健
康状态、检出疾病、指导诊断和治疗等。 • 鼠源性单抗作为体外诊断试剂是满意的，但用于人体可能会引起过敏反应甚至危及生
命。目前虽然已通过人－鼠细胞杂交及人－人细胞杂交进行了一些探索，但还不能商 品化生产，因此制备人源单克隆抗体是目前亟待解决的问题。