虎杖中醌类物质的提取分离与鉴定

虎杖中蒽醌类物质的提取、分离及鉴定

（吕培银）

【药物简介】

虎杖，又名阴阳莲、斑杖、苦杖、酸汤杆等。可在春、秋两个季节采挖，除去须根，洗净后，趁鲜切短段或厚片，晒干。微苦，微寒。归肝、胆、肺经。利湿退黄，清热解毒散瘀止痛，止咳化痰。用于湿热黄疸，淋浊，带下，风湿痹痛，痈肿疮毒，水火烫伤，经闭，癥瘕，跌打损伤，肺热咳嗽。虎杖中主要含有蒽醌类、二苯乙烯类、黄酮类、香豆素类以及一些脂肪酸类化合物。药理作用包括抗炎、抗病毒、抗菌、调血脂、抗血栓、改变血流变、扩张血管、保护心肌、抗氧化、抗肿瘤，改善阿尔茨海默症及预防艾滋病等。

【实验目的】

一、学会撰写实验方案。

二、掌握中药材有效成分回流提取的方法和操作。

三、掌握pH梯度萃取法分离不同酸度游离羟基蒽醌的原理和操作。

四、掌握硅胶柱层析的操作方法。

五、掌握羟基蒽醌的理化检识和薄层检识方法。

【实验原理】

羟基蒽醌类化合物及二苯乙烯类成分均可溶于乙醇，所以可以采用乙醇回流提取法，利用羟基蒽醌类苷元与苷的溶解度差异可以用乙醚捏溶的方法分离游离的蒽醌衍生物苷元和蒽醌苷类。根据游离羟基蒽醌类化合物含有酚羟基数目和位置不同，不同表现出酸性强弱不同，利用梯度pH萃取法分离不同酸性强弱的有蒽醌衍生物。硅胶吸附柱色谱法的原理是物质的吸附性具有差别，属于物理吸附。

碱梯度萃取虎杖中主要蒽醌的方法，优点是简单快捷，但很难提取到单一的蒽醌，往往夹带有酸性接近的蒽醌，要通过多次重结晶或色谱再分离，才能获得单一蒽醌，收率低。柱色谱法虽然能分离到单一蒽醌，但是该法耗时间费溶剂，难以形成规模生产。【1】化学检识的原理是羟基蒽醌类在碱性溶液中发生颜色改变，会使颜色加深，多呈橙、红、紫红色以及蓝色。该显色反应与形成共轭体系的酚羟基和羰基有关。

【实验用品】

实验材料：虎杖（100g）、95%的乙醇、乙醚、5%NaHCO3溶液、5%Na2CO3溶液、2%NaOH溶液、硅胶、石油醚、乙酸乙酯、MgAc2乙醇溶液。

仪器设备：1L烧瓶、回流冷凝管、水浴锅、纱布、烧杯、蒸发皿、漏斗、分液漏斗、铁架台、抽滤装置、薄层板、离心管等。

【实验内容】

提取：1.乙醇回流提取法：将虎杖研磨成粉，取虎杖粗粉100g置于1L烧瓶中，搭好回流冷凝装置，加95%乙醇回流提取两次，分别是500ml，1h ; 300ml，0.5h。用四层纱布过滤，合并滤液。滤液减压回收乙醇至糖浆状(约40ml)，趁热转入烧杯或蒸发皿中，并用少量乙醇洗涤烧瓶，洗液并入烧杯中，水浴浓缩至稠膏状，得到乙醇总提取物。乙醇总提取物加50mI乙醚充分搅拌捏溶，倾出乙醚层。再同法提取4次，合并乙醚溶液。乙醚液用滤纸自然过滤，得到总脂溶性成分。

2.传统的水煮醇沉淀法：称取虎杖药末100g，用2000ml (1000、500、500ml)水煮沸提取3次，每次煮沸1h，并注意补充水量.过滤，合并水液，浓缩至100ml，加乙醇至含醇浓度为70%，静置4h，过滤。滤液置100ml量瓶中，加70%乙醇

至刻度，摇匀，备用。同法做3批。【2】

分离：1.pH梯度萃取法：留下2mL乙醚提取液做薄层检识对照，剩下的乙醚提取液移入合适大小的分液漏斗中，用碱性由弱到强的碱液依次萃取。用5%NaHCO3溶液(测PH值)萃取三次，分别80、40、40ml。合并萃取液(碱液)。萃取液加热挥尽乙醚，小心滴加HC1至pH=2，放置析出沉淀，抽滤并水洗至中性，得到沉淀Ⅰ。乙醚液用5%Na2CO3溶液(测pH值)萃取5 次，每次40ml，合并萃取液。萃取液同上一步操作得到沉淀Ⅱ。乙醚液用2%NaOH溶液(测pH值)萃取5次，每次20ml，合并萃取液。萃取液同上的操作得到沉淀Ⅲ。剩下的乙醚液可以丢弃。

2.硅胶柱层析法分离沉淀Ⅱ：

1）装柱：取100~200目柱层析硅胶30g ，按湿法装样，溶于100ml石油醚-乙酸乙酯( 1：2 )混合溶液中，边搅拌边装柱，打开活塞，待沉降匀实，（也可以待沉降匀实后再打开活塞）保持硅胶界面平整，保持溶液至硅胶界面0.5-1cm ，关闭活塞，开始上样。

2）上样：取沉淀Ⅱ0.01g于试管中，加入2mL石油醚-乙酸乙酯( 1：2 )混合溶液溶解。取硅胶0.5g于蒸发皿中，使用胶头滴管滴加样品溶液，边加边搅拌，置水浴锅中挥干溶剂，得拌样硅胶。打开硅胶柱活塞使液面与硅胶界面柱一致，通过硅胶柱上方漏斗加入拌样硅胶，界面平整后加入1g空白硅胶。（空白硅胶起保护作用）

3）洗脱：用石油醚-乙酸乙酯( 1：2 ，约100ml )为洗脱剂洗脱，分段收集，每份7mI ，约5份，标记各流份准备薄层检识。为避免顺序错乱，可以先把离心管按顺序标号，再按照顺序收集样品。

鉴定：1.薄层检识：使用10*10cm硅胶G-CMC-Na板一块湿法铺板，105℃活化0.5小时，对照品为大黄素、大黄酚溶液，样品为乙醚总提物，沉淀I、I、I、柱层析洗脱各流份。展开剂为石油醚-乙酸Z酯=1：2 ，20ml，加两滴乙酸显色。首先可见光观察，接下来紫外光观察，，最后NH3熏蒸后观察。根据显色分析实验结果。

2.化学检识：沉淀1、2、3的乙醇溶液各取约2ml ，分别滴加MgAc2乙醇溶液数滴，观察颜色变化。

【注意事项】

1.虎杖中蒽醌类化合物的种类、含量与虎杖采集季节和贮存时间有关系。由于游离蒽醌类衍生物部分有升华性，所以新鲜的原药材蒽醌类成分含量高，如果是贮存时间长的饮片，则蒽醌类成分含量低，实验选材要注意。

2.HCl酸化时产生大量CO2气体，小心防止气体产生时内容物溢出。

3.当用碱液萃取Z醚溶液时，碱水层变为红色，发生了Borntrager 反应，加酸后溶液变为黄色。

4.使用乙醚要注意安全，绝对禁止明火。

【实验拓展】

虎杖中游离蒽醌类化合物提取工艺条件优化研究：选用提取时间、提取温度、提取次数和加水倍数作为考察因索，采用工艺流程从虎杖中提取游离蒽醌类物质，通过正交表试验，筛选虎杖游离蒽醌的提取工艺条件。结果虎杖游离蒽醌提取最佳条件为乙醇浓度70%，