《免疫吸附法与护理》PPT课件

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酶联免疫吸附分析PPT课件

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测量时,抗原(抗体)先结合在固相载体上,但仍保留其免疫活性,然后加一种抗体(抗原)与酶结合成的偶联物(标记物),此偶 联物仍保留其原免疫活性与酶活性,当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后, 根据颜色反应的程度进行
(一)双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
获得待分析物的未标定抗体
测量时,抗原(抗体)先结合在固相载体上,但仍保 留其免疫活性,然后加一种抗体(抗原)与酶结合成的偶 联物(标记物),此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性, 当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后, 再加上酶的 相应底物, 即起催化水 解或氧化还 原反应而呈 颜色。
ELISA原理
其所生成的颜色深浅与欲测 的抗原(抗体)含量成正比。

硝基酚半乳糖苷(ONPG)
显色反 测定波 应
橘红色 492 黄色 460 棕色 449 兰色 425 蓝绿色 642
黄色 红色 黄色 深蓝色
荧光
黄色
400 500 405 420 360,450
420
ELISA的种类和变化 将抗原或抗体固定化的过程称为包被(coating)。
该抗原的定性或定量测定 由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系,所以抗原抗体反应具有高度的特异性。 因此,加入底物后显色反应较弱。 4、加样
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
(二)间接法
间接法是检测 抗体最常用的方法, 其原理为利用酶标 记的抗抗体以检测 已与固相抗原结合 的受检抗体,故称 为间接法。
包被固相载体: 用已知抗原包被
固相载体
加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合
洗涤,除去无关的物质
加底物 显色
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定

实验四酶联免疫吸附试验ELISA演示精品PPT课件

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2、洗板:甩掉板孔中的溶液,每孔加入稀释好的洗涤液200μl,静置3分钟倒掉,再在吸水纸上拍干,重复 3次。
3、每孔加酶标单抗100μl,置37℃温育30分钟。 4、洗板:洗涤3次(方法同步骤2)。切记每次在干吸水纸上拍干。 5、显色与终止:每孔先加底物A液、再B液各1滴(50μl),混匀。室温(18-25 ℃)避光显色10分钟后。 6、终止:每孔加终止液1滴(50μl) (0.25% 氢氟酸),终止反应。 7、10分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定OD值。检测样本的OD值≥0.35为阳性 8、结果判定:试验成立的条件是:阴性对照孔平均OD630值与阳性对照孔平均OD630值之差≥0.4。 S=样品孔OD630值,N=阴性对照孔OD630值 如果S/N比值≤0.6,样品判定为PRV抗体阳性。 如果S/N比值≤0.7但> 0.6,样品重测。 如果S/N比值> 0.7,样品判定为PRV抗体阴性
双抗体夹心法(Sandwich ELISA): • 将已知抗体吸附于固相载体,酶标记一抗 • 检测液相中的可溶性抗原
竞争法(Competitive ELISA) : • 将已知抗体或抗原吸附于固相载体,酶标记抗原或抗体 • 检测液相中的可溶性抗原或抗体
阻断法(Block ELISA) : • 将已知抗原吸附于固相载体,酶标记单克隆抗体 • 检测液相中的可溶性抗体
✓ 酶联免疫吸附试验:可溶性抗原或抗体 ✓ 酶免疫组化法: 组织中或细胞表面的抗原。
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, EL或抗体检测液体(血液、细胞液) 中未知抗体或抗原的方法。
2.原理
(1)利用抗原与抗体的特异反应将待测物
实验方法
1.抗原的处理: 2.包被抗原: 取酶标板,加入100μL/孔的抗原稀释液

免疫吸附ppt课件

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结 语(2)
IA有效地清除抗体,已应用于自身免疫 性疾病或同种异体抗原(HLA,VIII因子 等)致敏的病人获得了满意的结果
提高吸附剂的选择 性和特异性是今后研 究的课题,研究专病吸附柱或一个柱同 时吸附多种致病因子是今后发展的方向
IA毕竟不是病因性根治性疗法,存在自 身不足与局限性,价格昂贵
成本不高
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吸附剂的分类
生物亲和型 物理化学亲和型
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6
免疫吸附示意图
血泵
枸缘酸盐
血泵
缓冲液 pH7.0
洗脱液 pH2.2
免疫吸附柱
分级纯化
废物
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生物亲和作用
抗原 抗原抗体结合
DNA
抗DNA抗体*
血型物质 抗血型物质抗体*
胰岛素
抗胰岛素抗体
凝血因子VIII 抗因子VIII抗体*
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体外清除自身抗体(3)
神经系统 疾病
重症肌无力
Guillain-Barre 系统性疾病
SLE 类风湿性关节炎
皮肌炎
结节性多动脉炎
内分泌、代谢疾病
耐胰岛素性糖尿病
其它
伴有抗精子抗体的不孕症
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体外清除自身抗体(4)
肾(或其它器官)移植
移植前
清除抗 HLA抗体,降低PRA 减少急性排斥反应,提高肾存活率
免疫吸附(Immunoadsorption)
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1
提要 前言 IA剂的条件及分类 IA技术 临床应用 结语
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2
前言
1979年,Teman第一次将IA技术应用于 临床,IA已逐渐成为BP领域的一个重要 分支,日益受到人们广泛关注。

酶联免疫吸附实验ppt课件

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作纵坐标,以平滑线连接各标准品的坐标点。通 过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。 3、若标本OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后 重测,计算浓度时应乘以稀释倍数。 4、试剂盒灵敏度:最小可测人TNF-a达4pg/ml。
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第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时,甩尽孔内液体,每孔加洗涤 液350μl,静止30秒后甩尽液体,在厚迭吸 水纸上拍干,洗4次。
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工作液 100ul/孔,封住板孔, 37℃孵育60分钟。
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第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外,加入1:100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条,其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外,分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中,标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔,37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外,加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液(4)用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀,按说明稀释至 所需浓度,再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况,将标本做适当倍数稀释(可 做预实验,以确定稀释倍数)。

免疫吸附治疗PPT医学课件

免疫吸附治疗PPT医学课件
适应症与A蛋白相似
疗效略有差异
IgG
IgM
IgA
白蛋白↓
Ig-Therasorb 60%~80% 50%
50%
20%
A蛋白
60%~80% 20%~40% 20%~40% 15%
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苯丙氨酸吸附(PH-350和PH250吸附)的适应症及疗效
自身免疫性疾病
• 多发性硬化症 • 格林- 巴利综合征 • Miller- Fisher 综合征 • 类风湿性关节炎 • 系统性红斑狼疮 • 慢性脱髓鞘性神经根炎
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A蛋白吸附的适应症及疗效
3 血液病:
• 免疫性溶血性贫血、伴有白细胞抗体的白细胞减少 症、伴有免疫复合物的过敏性紫癜: 可清除相应抗 体起治疗作用。
• 冷球蛋白血症: 可使常规治疗无效的混合型冷球蛋 白血症患者的皮肤溃疡及关节疼痛减轻或消失。
• 多发性骨髓瘤: 通过清除患者体内明显升高的免疫 球蛋白及轻链蛋白等, 改善血液粘滞度、防治重要 器官( 如肾脏) 受损。
治疗的敏感性,使药物疗效增加,副反 应减少,从而缩短疗程,降低复发率。
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免疫吸附将成为治疗学中 除药物、手术以外 适用于疾病谱的 第三条治疗途径
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脉粥样硬化性闭塞性疾病 • 心脏移植后预防冠心病复发 • 视网膜血管动脉硬化性闭塞
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丙乙烯聚合物吸附的适应症
• 黄疸 • 术后肝功能损害 • 重症肝炎
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其他吸附
• 内毒素吸附治疗革兰阴性杆菌性败血症 • 用抗人β2MG抗体的单链片段制成吸附
剂, 用于清除透析患者体内的β2MG, 防 治与β2MG相关的淀粉样变和腕管综合 征 • 对细胞因子有选择性的吸附剂与装置(CFX) 用于吸附T NF- a、IL- 6 和IL- 10 , 治疗 全身炎症反应综合征和败血症 • 胆红素吸附、过剩放射性核素吸附、肝 炎病毒标志物吸附等

酶联免疫吸附试验ppt课件

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二、免疫标记技术的基本原理、类型
及应用
实验目的

掌握ELISA直接法的操作过程。 掌握免疫标记技术的分类、原理及应用。

实验原理示意图
包被抗原
实验材料
试剂:

器材:

封闭液 6ml 洗液(PBS-Tween20) 1瓶 样品稀释液(PBS) 4.5ml 兔血清 (已包被) 酶标抗体(HRP-Ab) 1.5ml 底物 4.5ml 终止液(H2SO4) 2ml
OPD见光易变质,与过氧化氢混合成底物应用 液后更不稳定,须现配现用。
TMB(四甲基联苯胺)


TMB经HRP作用后其产物显蓝色,目视对比鲜明。
TMB性质稳定,可配成溶液试剂,只需与H2O2溶液混和
即成应用液,可直接作底物使用。

酶反应用HCL或H2SO4终止后,产物由蓝色变成黄色,
可在比色计中定量,最适吸收波长为405nm。
酶标板(已包被) 1块 锡 纸 1张 200l pipette 1把 Tip 若干 试管 7支 1ml吸管(配胶帽) 1支 培养箱43℃ 1台/室 吸水纸 若干 记号笔 1支
实验步骤
1.
包被:用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(正常兔血清)稀释至蛋白质含 量为10g/ml。100 l/well加入聚苯乙烯板酶标板中,4℃ over night。次 日,弃去孔内溶液。
?10ugml封闭的作用?包被时所用的抗原或抗体浓度较低吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙封闭就是让包被时所用的抗原或抗体浓度较低吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙从而防止非特异性吸附影响结果的准确性
酶联免疫吸附试验 (ELISA直接法)

免疫吸附新技术的介绍 ppt课件

免疫吸附新技术的介绍 ppt课件


神经科: ➢ 重症肌无力 ➢ 格林-巴利综合症 ➢ 慢性多发性脱髓鞘
神经根炎 ➢ 进行性系统性硬化
免疫吸附临床应用状况(4)
心血管科:
➢ 重症高脂血症 (家族性)
➢ 脂代谢紊乱导 致心脑血管病
➢ 闭塞性动脉硬 化
➢ 扩张性心肌病
风湿科:
➢ 重症风湿病, 类风湿性关 节炎
➢ 皮肌炎
➢ 结节性多动 脉炎
免疫吸附新技术的介绍
Edison.Xu
常用的血液净化技术
➢ 透析:Dialysis:血透(HD):序贯透析,单纯超滤 高效透析,高流量透析
腹透(PD): CAPD,IPD,CCPD,NPD,APD ➢ 血液滤过:Hemofiltration(HF),CAVH,CVVH ➢ 血液透析滤过:Hemodiafiltration(H.D.F)
的作用。
IA的不足
➢ IA不能完全替代原发病的治疗 ➢ 近期疗效显著,令人鼓舞,长期疗效有待观察 (会不会复发,有没有反跳,能不能根除,交换的量,疗程,
治疗的间隙等有待研究)
➢ 侵入性的治疗,要维持一个体外循环,不可避免 的存在一定的风险和副作用
➢ 价格昂贵,需要治疗的对象多,能够承受费用的 病员少
➢ 不少问题有待进一步研究:
❖ 组织内已结合的致病物质是否能被充分清除 ❖ 免疫球蛋白补体会不会过多的被清除 ❖ 氨基酸,白蛋白,抗体会不会丢失……..
I.A的副作用
➢ 畏寒,寒颤,发热 ➢ 过敏:麻疹,过敏反应,喉头水肿 ➢ 胃肠道:恶心,呕吐,腹泻 ➢ 骨骼肌肉:肌肉酸痛,关节痛,骨骼痛 ➢ 呼吸:气促,胸闷,呼吸困难,哮喘 ➢ 心血管:高血压,低血压,心悸,心律不齐,心绞痛 ➢ 神经:头痛,震颤,抽搐,昏迷,焦虑不安 ➢ 其他:神经痉挛,疲劳感,潮红,出汉,排尿困难

培训课件酶联免疫吸附试验ELISA操作注意事项ppt课件

培训课件酶联免疫吸附试验ELISA操作注意事项ppt课件
关于温育,在实际测定操作中一定要注意以下几 点:
(1)要保证在设定的温度下有足够的反应时间。
一般来说,加完样本或反应试剂后,将微孔板从室 温拿至水浴箱或温箱中时,孔内温度从室温升至 37℃,需要一定的时间,尤其是在室温比较低以及 非水浴的状态下,这段升温时间可能还比较长,而 在临床实验中,很少有人注意这个问题,通常是将 微孔板一放入温箱即开始计时,这样就很容易造成 在实际测定中温育时间不够,弱阳性样本测不出来 的问题。
(3) 压住按钮,同时提起移液器,使吸嘴贴容器 壁擦过。
(4) 松开按钮。
(5) 按弹液枪的养护及注意事项
吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指,绝不允许突然松 开,以防溶液吸入过快而冲入枪体内腐蚀柱塞造成漏气。
移液枪应轻拿轻放,不能将已吸有液体的移液枪平放或倒 置,以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。
(2)试剂盒中的洗涤液如需在使用时对所提供的 浓缩液稀释配制,稀释时所用的蒸馏水或去离子 水应保证质量。
3 加样本及反应试剂
在ELISA实验中一般有3次加样步骤,即加样品 、加酶结合物、加底物和显色剂。
加样必须注意的关键点是:
(1)加样不可太快,要避免加在孔壁上部,不 可溅出和产生气泡。加样时如有气泡,抗原抗 体不能有效地结合会导致弱阳性甚至假阴性。
洗液:非离子型洗涤剂
酶反应的底物: H2O2,为受氢体; 显色剂:邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS,
为供氢体。
终止液为硫酸。
2 试剂的准备
(1)在实验开始前,将试剂盒先从冰箱中取出, 在室温下放置30分钟以上,再进行测定,以使试 剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的,主要 是为了缩短升温时间,使反应孔内的温度能较快 地达到所要求的高度,以满足测定要求。
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而免疫吸附从根本上克服了血浆置换的问题, 由于它是 抗原抗体特异性结合,故选择性较高;同事它是通过血浆处 理后重新输回患者体内,无血浆成分丢失,且不影响同事进 行的药物治疗,价格相对便宜。其治疗强度可以根据病情的 需要进行调整。免疫吸附也不需要置换液,故消除了通过血 液制品传染疾病的问题。
琼脂糖凝胶 葡聚糖 二氧化硅凝胶 聚乙烯醇珠 树脂等
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五、适应症
肾脏和风湿免疫系统疾病 系统性红斑狼疮和狼疮性肾炎、抗 肾小球基底膜病、Wegener肉芽肿、新月体肾炎、局灶节段性 肾小球硬化、溶血性尿毒症综合征、免疫性肝病、脂蛋白肾 病、冷球蛋白血症、类风湿性关节炎、单克隆丙种球蛋白血 症、抗磷脂抗体综合征等。
过敏反应 治疗前各种滤器要充分预冲,并且预冲时注意检查 吸附柱。治疗过程中出现上述症状时给予糖皮质激素和抗组胺 类药物、吸氧等对症治疗,必要时终止免疫吸附治疗,严重者 出现休克时按过敏性休克处理。
溶血 查明原因,并予以纠正,如为凝血,及时更换。
出血 多为抗凝剂过量所致。
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凝血 包括免疫吸附器、透析器内凝血和留置管凝血,多与术 前肝素使用剂量不足,或患者处于高凝状态,或伴有高脂血症 有关。术中密切观察跨膜压变化,调整肝素追加量。如跨膜压 短时间内迅速升高,可临时追加肝素量。若出现滤器破膜,应 立即更换。
重症药物或毒物的中毒 化学药物或毒物、生物毒素、对于高脂 溶性而且易与蛋白结合的药物或毒物,可选择血浆灌注吸附, 或与血液透析联合治疗效果更佳。
其他疾病 扩张性心肌病、β2微球蛋白相关淀粉样变、银屑病、 甲状腺机能亢进等。
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六、禁忌症
1.对免疫吸附器的膜或管道有过敏史。 2.严重活动出血或DIC,药物难以纠正的全身循环衰竭。 3.非稳定期的心、脑梗死、颅内出血或重度脑水肿伴有脑疝 4.存在精神障碍而不能很好配合治疗者
选择双腔(或三腔)静脉导管行深静脉置管,或16号(小儿 选17号)穿刺针直接进行动、静脉穿刺,建立循环血路。
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3.抗凝
一般采用全身肝素化方法,首次肝素剂量为0.5-1mg/kg, 以后每30分钟追加肝素8-10mg。灌流结束前半小时停用肝 素。因个体差异,肝素剂量应视患者个体情况而定,一般 体外循环凝血时间应保持在45-60分钟。根据治疗需要也 可选用局部肝素或低分子肝素抗凝。
而达到治病的目的。IA在风湿病、肾脏病、神经
系统疾病、血液病和心血管疾病中应用。目前IA
已成为一 项重要的血精选液ppt净课件 化技术。
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二、类 型
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Hale Waihona Puke 3三、配体四、载体
蛋白A
特定的抗原(DNA)
特 定 的 抗 体 ( 抗 人 LDL 抗 体 、 抗 人 IgG 抗 体 ) 、 C1q 、 聚赖氨酸、色氨酸、 苯丙氨酸等
神经系统疾病 重症肌无力、Guillain-Barre综合征等。
血液系统疾病 特发性血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少 性紫癜、血友病等。
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血脂代谢紊乱 严重的家族性高胆固醇血症、高三酰甘油血症等。
肝衰竭 重症肝炎、严重肝衰竭尤其是合并高胆红素血症患者等。
器官移植排斥 肾移植和肝移植排斥反应、群体反应抗体(PRA) 升高、移植后超敏反应等。
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七、操作流程
由于免疫吸附疗法存在不同的吸附剂类型和不同的治疗模 式,其操作程序也有不同,应参照不同治疗方法、不同吸附 柱及不同的机器设备的相关说明书进行。下面介绍DNA免疫吸 附柱的操作流程:
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1.治疗前评估
医院资质 建议在三级甲等医院的血液净化中心进行。
术前常规检查血常规、出凝血指标、血清白蛋白、血清球蛋 白、血电解质;肝功能、肾功能、及与原发病相关的特异性 指标等。
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4、吸附
1、血液流量从50-80mL/min逐步增加到100-150mL/min。
2、吸附时间一般为120-150分钟。若有必要继续治疗,需更换 第二个吸附柱。
3、密切观察各种滤器情况,血液颜色,注意有无溶血的发生, 如有凝血情况应及时更换吸附柱。
4、密切观察患者生命体征,包括每30分钟测血压、心率等。
5、达到治疗量后,进入回收程序,观察并记录患者生命体征、
病情变化、治疗参数及治疗经过。
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5、吸附后处理
吸附结束时,宜 采用空气回血法 或生理盐水回血 法回血。
必要时可使用鱼 精蛋白中和肝素 .
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6、免疫吸附示意图:
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八、并发症及处理
低血压 多由体外循环引起,对本身存在低血容量的患者,在 上机前酌情补充必要的胶体和晶体溶液。
穿刺局部血肿、气胸、腹膜后出血 肝衰竭患者凝血功能差, 可酌情于治疗前输血浆、凝血酶原复合物等补充凝血因子。治 疗中注意肝素且量。术中、术后要卧床休息,减少穿刺部位的 活动,或局部止血。
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IA疗法在清除血浆致病因子的同时,还能改善机体的免疫 能力。该技术的可治疾病谱正在日益扩大,其临床应用范围 远远超出血浆置换,疗效也更好。IA与血浆置换均是通过清 除体内致病因子而达到病情的缓解,因此两者临床适应也基 本相同。两者相比较,血浆置换存在选择性差,治疗剂量小 、已丢失血浆中大量重要的凝血物质及凝血因子I(纤维蛋 白原),影响和不安着的凝血功能和机体的其他功能以及可 能传播传染性疾病(病毒性肝炎、AIDS等)等缺点,所以其 有效性和治疗强度受到限制。
免疫吸附法与护理
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一、概 念
免疫吸附(Immunoadsorption,IA)疗法是近年来发
展起来的一种新技术,用于治疗一些传统方法难
以奏效的疾病。所谓免疫吸附是通过体外循环,
联结抗原(或抗体)基质从溶液中吸附并去除同
种对应的抗体(或抗原)的方法。这种方法通过
吸附除去内源性和外源性致病因子,净化血液从
由有资质的肾脏专科医师综合评估患者适应症和禁忌症,确 定患者是否应进行血浆吸附及选用何种吸附器。
向家属或患者交代病情,签署知情同意书。
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2、吸附前的准备
将吸附柱动、静脉端与无菌血路管道连接后垂直固定,动脉 端朝下,静脉端朝上。
用5%的葡萄糖注射液500mL灌注吸附柱和管道,静置30分钟后 ,再用3000mL肝素生理盐水(内含肝素10-15mg/500mL)自下 而上对吸附柱和管道进行预冲,预冲流量为50-100mL/min, 预冲时用手轻拍并转动吸附柱,直至排尽空气。
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