第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列分析
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DNA序列测定的原理和方法PPT课件
原理
终止
核苷酸链
延伸
ddNTP dNTP
2021/3/12
5
2021/3/12
图3 循环测序反应原理示意图
6
循环测序反应产物的纯化
电泳与结果分析
2021/3/12
7
循环测序 反应产物
沉淀
洗涤
2021/3/12
除BigDye Terminators
8
测序仪氩离子 激光能量
氢化荧光素 供体染料
二氯罗丹明 受体染料
bigdyeterminatorsbigdyeterminatorsbigdyeterminators的基本原理与测序步骤的基本原理与测序步骤核苷酸链ddntpdntp终止延伸循环测序反应产物沉淀洗涤除bigdyeterminators测序仪氩离子激光能量氢化荧光素供体染料二氯罗丹明受体染料激光扫描镜头计算机计算机循环测序反应循环测序反应cyclesequencingreactionscyclesequencingreactions模板用量大大减少
DNA序列测定的原理和方法
郭鹏
2003.10.05
2021/3/12
1
➢ 方法
双脱氧链终止法（Sanger法）和化 学降解法（Maxam-Gilbert法）
双脱氧链终止法
2021/3/12
2
➢ 双脱氧链终止法的测序原理
双脱氧链终止法的测序 基础是以双脱氧核苷三磷 酸(ddNTP)为循环测序反 应的链终止剂。
✓ 换用其它测序试剂盒，如dRhodamine Teriminators试剂盒 等。
✓ 即使通过上述改变，某些模板仍可能无法测序，此时，应将 2其021构/3/12建成较小的DNA片段克隆，以降低DNA模板GC含量13 。
基因工程基本原理
与目的DNA两侧的区域互补） 靶序列（DNA模板）五部分组成。
基因工程基本原理
7
基因工程基本原理
8
1. 耐热DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶的特点
Taq DNA聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌YT-1中分离纯化而得。
1) 具有5’-3’聚合酶活性和5’-3’核酸外切酶活性 2) 最适反应温度为80℃ 3) 最适pH8.0和最佳反缓冲液 Tris·HCl 4) 最佳二价阳离子Mg2+ ，其浓度取决于dNTP浓度（2 mM） 5) 具良好的热稳定性：在90℃下连续反应30分钟仍有约50%的酶活
基因工程基本原理
22
4. 定量PCR（quantitative PCR，Q-PCR）：
是应用一种标准作对照，估计出一种特异性靶DNA 或RNA分子相对含量的技术。
基因工程基本原理
23
介绍：基于PCR的分子标记技术
基因工程基本原理
24
遗传标记
➢ 遗传标记（Genetic marker）指可识别的等位基因。 它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因 此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗 传标记。
5’
3’
HO-
-OH
3’
5’
基因工程基本原理
14
引物的设计：
1. 引物长度：一般20bp左右。 2. 引物的碱基组成：一般G+C占50-60%，尽量避免数个连续排列的
嘌呤或嘧啶。一对引物之间不能有2个以上的碱基互补，特别是3’端； 引物本身避免有回文序列。 3. 酶切位点的设计：PCR扩增中，对引物5’端碱基的要求较低，可在引 物的5’端加上特殊序列，如限制性酶切位点。 4. 复性的温度：引物与模板复性温度和所需时间取决于引物的碱基组 成、长度、溶液中引物的浓度。复性温度一般低于引物本身的实际变 性温度（Tm）5度。Tm=（G+C）X4＋（A+T）X2。复性温度通常 在55-72度之间，提高复性温度可提高引物与模板结合的特异性。
基因工程基本原理
7
基因工程基本原理
8
1. 耐热DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶的特点
Taq DNA聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌YT-1中分离纯化而得。
1) 具有5’-3’聚合酶活性和5’-3’核酸外切酶活性 2) 最适反应温度为80℃ 3) 最适pH8.0和最佳反缓冲液 Tris·HCl 4) 最佳二价阳离子Mg2+ ，其浓度取决于dNTP浓度（2 mM） 5) 具良好的热稳定性：在90℃下连续反应30分钟仍有约50%的酶活
基因工程基本原理
22
4. 定量PCR（quantitative PCR，Q-PCR）：
是应用一种标准作对照，估计出一种特异性靶DNA 或RNA分子相对含量的技术。
基因工程基本原理
23
介绍：基于PCR的分子标记技术
基因工程基本原理
24
遗传标记
➢ 遗传标记（Genetic marker）指可识别的等位基因。 它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因 此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗 传标记。
5’
3’
HO-
-OH
3’
5’
基因工程基本原理
14
引物的设计：
1. 引物长度：一般20bp左右。 2. 引物的碱基组成：一般G+C占50-60%，尽量避免数个连续排列的
嘌呤或嘧啶。一对引物之间不能有2个以上的碱基互补，特别是3’端； 引物本身避免有回文序列。 3. 酶切位点的设计：PCR扩增中，对引物5’端碱基的要求较低，可在引 物的5’端加上特殊序列，如限制性酶切位点。 4. 复性的温度：引物与模板复性温度和所需时间取决于引物的碱基组 成、长度、溶液中引物的浓度。复性温度一般低于引物本身的实际变 性温度（Tm）5度。Tm=（G+C）X4＋（A+T）X2。复性温度通常 在55-72度之间，提高复性温度可提高引物与模板结合的特异性。
基因工程的主要技术原理课件
或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’ 端分别加上几个C或G，成为粘性末端。
接上人工接头
粘性末端
末端转移酶 CCC
CCC
基因工程的主要技术原理课件
基因工程%的mRNA时 所需要的克隆数目。
ln (1-p) N= ln (1- 1n)
蛋白B 转录激活domain
DNA binding domain 蛋白A
上游激活序列（UAS） 转录机 GAL4效应基因
基因工程的主要技术原理课件
不能转录
（2）如果蛋白A与蛋白B能相互结合
GAL4的DB domain与AD Domain也能 靠近，所以能启动效应基因的转录。
蛋白A
蛋白B
DNA binding domain 转录激活domain 激活转录
基因工程的主要技术原理课件
（2）载体与基因组DNA大片段的连接 直接连接、人工接头或同聚物加尾。
① 粘性末端直接连接 载体与外源DNA大片段的两个末端 都有相同的粘性末端。 如：Sau3A与BamHI的酶切末端。
②人工接头法（adapter） 人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。
基因工程的主要技术原理课件
第二章 基因工程的主要技术原理
基因工程的主要技术原理课件
五 .分子杂交技术
1、Southern blot
原理和方法:
双链DNA
限制性内切酶 消化
电泳分离
放射自显影
检测
洗膜
杂交 转膜
NaOH变性
NaOH或高温变性
标记的探针
基因工程的主要技术原理课件
应用: ➢ 基因拷贝数检测; ➢基因筛选, 获取目的基因; ➢遗传疾病诊断; ➢转基因样品检测, 等…
（3）cDNA的合成
接上人工接头
粘性末端
末端转移酶 CCC
CCC
基因工程的主要技术原理课件
基因工程%的mRNA时 所需要的克隆数目。
ln (1-p) N= ln (1- 1n)
蛋白B 转录激活domain
DNA binding domain 蛋白A
上游激活序列（UAS） 转录机 GAL4效应基因
基因工程的主要技术原理课件
不能转录
（2）如果蛋白A与蛋白B能相互结合
GAL4的DB domain与AD Domain也能 靠近，所以能启动效应基因的转录。
蛋白A
蛋白B
DNA binding domain 转录激活domain 激活转录
基因工程的主要技术原理课件
（2）载体与基因组DNA大片段的连接 直接连接、人工接头或同聚物加尾。
① 粘性末端直接连接 载体与外源DNA大片段的两个末端 都有相同的粘性末端。 如：Sau3A与BamHI的酶切末端。
②人工接头法（adapter） 人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。
基因工程的主要技术原理课件
第二章 基因工程的主要技术原理
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五 .分子杂交技术
1、Southern blot
原理和方法:
双链DNA
限制性内切酶 消化
电泳分离
放射自显影
检测
洗膜
杂交 转膜
NaOH变性
NaOH或高温变性
标记的探针
基因工程的主要技术原理课件
应用: ➢ 基因拷贝数检测; ➢基因筛选, 获取目的基因; ➢遗传疾病诊断; ➢转基因样品检测, 等…
（3）cDNA的合成
第二章.基因工程主要技术原理-电泳、杂交
用于标记dUTP
24
基因工程
第二章 基因工程技术原理
DIG标记/检测举例
探针标记 6Nt随机寡核苷酸序列引物，Klenow标记
检测 漂洗 blocking 免疫反应 labeled Anti-DiG-Ab-Ap 洗涤 显色反应 化学发光检测 NBT-BCIP 形成棕黄色沉淀
返回第二节 25
基因工程
16
基因工程
返回目录
第二章 基因工程技术原理
返回第二章
“电泳”思考题
❖电泳的原理是什么
❖请说出以下电泳用胶的区别：普通DNA分离、测序胶、
Southern 杂交
❖比较分子量相同的三种不同构型的DNA（直链线形、闭合
环形、开链环形）在同一电场中的电泳迁移率
❖比较溴化乙锭染色和银染的区别
❖说明电泳技术在基因工程中的作用
方法：加入凝胶中，凝胶浸泡 重要的特性：荧光强度同DNA片段的 大小或数量成正比。在包含有数种 DNA片段的电泳谱带中，每一条带的 荧光强度是随着从最大的DNA片段到 最小的DNA片段方向逐渐降低的。
10
基因工程
第二章 基因工程技术原理
电泳照片
11
基因工程
第二章 基因工程技术原理
银染
银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合 物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电 泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于 琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA 不宜回收
DEPC H2O ✓ 制胶
甲醇（MW 30.03）通常为37%水溶液，12.3M(pH>4.0)
终浓度，1×buf + 2.2M甲醇
24
基因工程
第二章 基因工程技术原理
DIG标记/检测举例
探针标记 6Nt随机寡核苷酸序列引物，Klenow标记
检测 漂洗 blocking 免疫反应 labeled Anti-DiG-Ab-Ap 洗涤 显色反应 化学发光检测 NBT-BCIP 形成棕黄色沉淀
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基因工程
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基因工程
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第二章 基因工程技术原理
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“电泳”思考题
❖电泳的原理是什么
❖请说出以下电泳用胶的区别：普通DNA分离、测序胶、
Southern 杂交
❖比较分子量相同的三种不同构型的DNA（直链线形、闭合
环形、开链环形）在同一电场中的电泳迁移率
❖比较溴化乙锭染色和银染的区别
❖说明电泳技术在基因工程中的作用
方法：加入凝胶中，凝胶浸泡 重要的特性：荧光强度同DNA片段的 大小或数量成正比。在包含有数种 DNA片段的电泳谱带中，每一条带的 荧光强度是随着从最大的DNA片段到 最小的DNA片段方向逐渐降低的。
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基因工程
第二章 基因工程技术原理
电泳照片
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基因工程
第二章 基因工程技术原理
银染
银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合 物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电 泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于 琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA 不宜回收
DEPC H2O ✓ 制胶
甲醇（MW 30.03）通常为37%水溶液，12.3M(pH>4.0)
终浓度，1×buf + 2.2M甲醇
基因工程的原理和技术ppt
思考3: 如果我们已知蛋白质得氨基酸序列, 又可以怎样操作？
思考:能否根据氨基酸得序列获得人胰岛 素基因得碱基序列？
化 学 合 成 法
一、基因工程得基本操作步骤(技术物 材料
提取
DNA
限制酶
DNA 片段
DNA分子
导入
受体菌 构建 基因组群体单链 RNA (mRNA)
杂交 双链
单链 D
继续保持安静
一、基因工程得基本操作步骤(技术提取
DNA
限制酶
DNA 片段
形成重组 DNA分子
导入
录
因随受 体细胞 得繁殖
而复制
如果就是导入动物细胞
显微注射仪
用口径为1μm得DNA注射器,将大 量得目得基因片段注入到受精卵得 核内,然后把经过注射得受精卵移植 到另一只雌性动物得子宫内,使受精
。 卵发育为转基因动物
思考: 培育转基因动物时,受体 细胞能否采用动物体细 胞？试说明理由。一般 可以采用动物得什么细 胞？
思考3: 如果我们已知蛋白质得氨基酸序 列,又可以怎样操作？
思考4:如果我们知道目得基因两端得部分 碱基序列,还可以怎样操作？
u 聚合酶链式反应(PCR技术)
Ø变性:双链DNA解链成 为单链DNA
Ø复性(退火):部分引物 与模板得单链DNA得 特定互补部位相配 对与结合
Ø延伸:以目得基因为 模板,合成互补得新 DNA链
农杆菌得Ti质粒T-DNA:(可转移得DNA)
可转移(也可以将目得基因转移)至受体细胞 中,并且整合到受体细胞染色体得DNA上。
农杆菌转化法
3、 转基因植物
农杆菌转化法
重组 DNA 分子
农杆菌 侵染 植物体细胞 (整合到细胞
思考:能否根据氨基酸得序列获得人胰岛 素基因得碱基序列？
化 学 合 成 法
一、基因工程得基本操作步骤(技术物 材料
提取
DNA
限制酶
DNA 片段
DNA分子
导入
受体菌 构建 基因组群体单链 RNA (mRNA)
杂交 双链
单链 D
继续保持安静
一、基因工程得基本操作步骤(技术提取
DNA
限制酶
DNA 片段
形成重组 DNA分子
导入
录
因随受 体细胞 得繁殖
而复制
如果就是导入动物细胞
显微注射仪
用口径为1μm得DNA注射器,将大 量得目得基因片段注入到受精卵得 核内,然后把经过注射得受精卵移植 到另一只雌性动物得子宫内,使受精
。 卵发育为转基因动物
思考: 培育转基因动物时,受体 细胞能否采用动物体细 胞？试说明理由。一般 可以采用动物得什么细 胞？
思考3: 如果我们已知蛋白质得氨基酸序 列,又可以怎样操作？
思考4:如果我们知道目得基因两端得部分 碱基序列,还可以怎样操作？
u 聚合酶链式反应(PCR技术)
Ø变性:双链DNA解链成 为单链DNA
Ø复性(退火):部分引物 与模板得单链DNA得 特定互补部位相配 对与结合
Ø延伸:以目得基因为 模板,合成互补得新 DNA链
农杆菌得Ti质粒T-DNA:(可转移得DNA)
可转移(也可以将目得基因转移)至受体细胞 中,并且整合到受体细胞染色体得DNA上。
农杆菌转化法
3、 转基因植物
农杆菌转化法
重组 DNA 分子
农杆菌 侵染 植物体细胞 (整合到细胞
第二章 基因工程主要技术原理-DNA序列分析
发展趋势
SS S S
S S S S S S S SS SS
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基因工程
第二章 基因工程技术原理
“测序”思考回答问题
返回第二章
1、Sanger双脱氧链终止法原理是什么
2、使用M13mp载体系列的优点有哪些 3、Maxam－ Gilbert化学修饰法的原理是什么 4、DNA杂交测序原理是什么 5、什么是寡核苷酸矩阵芯片 6、杂交测序有什么应用
端中止法；
K. Mullis采纳他的方法，完善了PCR扩增DNA的方法； M．Smith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全都获得了诺贝
尔奖。
基因工程
第二章 基因工程技术原理
2.5.1 .1 Sanger双脱氧链终止法原理
利用DNA聚合酶的两种酶 催反应特性：1、利用单链 DNA模板，合成DNA互补 链；2、利用2’，3’双脱 氧核苷三磷酸作底物，参 入到寡核酸链的末端，从 而终止DNA链的生长。有 时也称引物合成法，或酶 催引物合成法。
基因工程
第二章 基因工程技术原理
反应：同时加入引物和 模板、DNA聚合酶1、一 种 ddNTP、 以 及 四 种 dNTP（有一种带放射性 标记）。 变性胶电泳分离反应混 合物。 放射自显影术，检测单 链DNA片段的放射性带。
结果判读，从放射性X 光底片上，直接读出 DNA的核酸顺序。
考考你：反应混合物中，标记什么最方便？
基因工程
第二章 基因工程技术原理
Sanger 双脱氧一pUC体系 DNA序列分析法基本步骤
待测DNA与pBR322或pUC分子
重组；
转化：转化反应物涂布在补加
有Xgal-IPTG选择性培养基平板上， 经37℃过夜培养；
挑选白色菌落，制备质粒NA。
基因工程(基因工程的主要技术与原理-核苷酸序列分析)课件
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
核心原理：
利用特定的化学试剂对不同碱基进行特异 性切割。
硫酸二甲酯： 哌啶甲酸： 肼+NaCl： 肼：
G G和A C T和C
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
5′ 3′
G A+G
3′ 5′
待测DNA
放射性标记5′末端 R
限制性酶切
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
(二) 序列分析的基本步骤
模板变性(dnature template)：将待测DNA模板 与引物混合，通过加热使模板变性； 退火(annealing)：将变性的模板与引物混合物 缓慢降温，使引物与模板结合；
3. 分离：通过凝胶电泳分离片段群；
4. 推导：再经放射线自显影，确定各片段末端碱基， 从而得出目的DNA的碱基序列。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
凝胶电泳分离，放射线ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ显影分析
G A+G C+T C 3′
5′ 5′ C T T基因T工T程(基T因T工程G的G主要G技术C与原T理T- A G C 3′
通过凝胶电泳分离，放射自显影确定DNA片段 末端的碱基，进而推断DNA的核苷酸序列。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
5´ 3´
5´ 3´
5´ 3´
正常的DNA合成反应基因工程(基因工程d的dN主T要P技掺术与入原到理-DNA合成反应后导致反应终止
核苷酸序列分析)
基于双脱氧核苷酸的这种特性，Sanger于 1977年建立了以双脱氧链终止反应为基础来 测定DNA序列的方法；
该方法以待测DNA为模板，在DNA聚合酶的 催化作用下合成新的DNA链；
核心原理：
利用特定的化学试剂对不同碱基进行特异 性切割。
硫酸二甲酯： 哌啶甲酸： 肼+NaCl： 肼：
G G和A C T和C
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
5′ 3′
G A+G
3′ 5′
待测DNA
放射性标记5′末端 R
限制性酶切
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
(二) 序列分析的基本步骤
模板变性(dnature template)：将待测DNA模板 与引物混合，通过加热使模板变性； 退火(annealing)：将变性的模板与引物混合物 缓慢降温，使引物与模板结合；
3. 分离：通过凝胶电泳分离片段群；
4. 推导：再经放射线自显影，确定各片段末端碱基， 从而得出目的DNA的碱基序列。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
凝胶电泳分离，放射线ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ显影分析
G A+G C+T C 3′
5′ 5′ C T T基因T工T程(基T因T工程G的G主要G技术C与原T理T- A G C 3′
通过凝胶电泳分离，放射自显影确定DNA片段 末端的碱基，进而推断DNA的核苷酸序列。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
5´ 3´
5´ 3´
5´ 3´
正常的DNA合成反应基因工程(基因工程d的dN主T要P技掺术与入原到理-DNA合成反应后导致反应终止
核苷酸序列分析)
基于双脱氧核苷酸的这种特性，Sanger于 1977年建立了以双脱氧链终止反应为基础来 测定DNA序列的方法；
该方法以待测DNA为模板，在DNA聚合酶的 催化作用下合成新的DNA链；
5DNA序列分析
5DNA序列分析DNA序列分析是对DNA序列进行研究和分析的过程。
DNA是构成生命体的基本遗传物质，通过分析DNA序列可以帮助科学家们了解基因组的结构和功能，从而对生命体的进化、疾病和其他遗传变异等方面做出深入研究。
本文将介绍DNA序列分析的基本原理和常用方法，并探讨其在生物学、医学和犯罪学等领域中的应用。
首先，DNA序列分析的基本原理是基于DNA的碱基对原则。
DNA由四种碱基（腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤和胞嘧啶）组成，它们以互补配对的方式连接在一起。
这种碱基对配对关系使得DNA在复制和传递遗传信息时具有较高的稳定性。
通过分析DNA序列，可以了解碱基的排列顺序，从而揭示基因的功能和调控机制。
在DNA序列分析过程中，常用的方法包括序列比对、引物设计、基因预测和蛋白质结构预测等。
序列比对是将待分析的DNA序列与已知的DNA序列进行对比，以发现可能的相似性和差异性。
这项工作对于生物进化、物种鉴定和新基因的发现都具有重要意义。
引物设计是为了在PCR（聚合酶链式反应）等实验中扩增目标DNA片段而设计的短DNA序列。
引物设计的主要目的是使引物与待扩增片段的两个端点互补配对，从而实现扩增。
基因预测是通过计算机算法判断DNA序列中的编码区和非编码区，识别其中的基因，并推测其可能的功能。
蛋白质结构预测则是基于DNA序列推测编码的蛋白质的三维结构，从而理解蛋白质的功能和相互作用。
DNA序列分析在生物学中具有广泛的应用。
通过对不同物种的DNA序列进行比对，可以揭示不同物种之间的亲缘关系和进化历史。
通过对人类基因组的研究，可以了解人类疾病的遗传基础，从而推动药物研发和个性化医疗的发展。
此外，DNA序列分析还在犯罪学中发挥着重要作用。
通过对犯罪现场的DNA样本与嫌疑人DNA样本进行比对，可以进行犯罪嫌疑人的辨认和刑事调查。
总之，DNA序列分析通过研究和解读DNA序列，有助于我们理解生命体的基因组结构和功能。
它在生物学、医学和犯罪学等领域中具有重要的应用价值。
基因工程的主要技术与原理-核苷酸序列分析
(三) 化学降解法的应用
Maxam-Gilbert化学降解法的测序长度大约为250个
碱基，适合G+C含量较高及较短的寡核苷酸片段的 测序； 从DNA两端分别测定同一条DNA核苷酸序列，相互 参照测定结果，可以得到准确的核苷酸序列；
Maxam-Gilbert化学降解法不需要进行酶催化反应，
起始位点相同的、不同长度的、以不同碱基结
尾的DNA片段群； 3. 分离：通过凝胶电泳分离片段群；
4. 推导：再经放射线自显影，确定各片段末端碱基， 从而得出目的DNA的碱基序列。
凝胶电泳分离，放射线自显影分析
G A+G C+T C 3′
5′ 5′ C T T T T T T G G G C T T A G C 3′
基因分析工具
NCBI:（美国国家生物技术信息中心）
EMBL:（欧洲生物信息学研究所）
Sanger中心:（基因组测序中心）
ExPASy:（瑞士生物信息学研究所蛋白质分析系统）
H
ddNTP
ddATP
ddCTP
通过聚丙烯酰胺凝胶电 泳能分辨出小至一个碱基 长度差异的DNA片段,从 而将混合产物中不同长度 DNA片段分离开。
再通过放射自显影曝光, 根据片段尾部的双脱氧核 苷酸读出该DNA的碱基排列 顺序。
(二) 序列分析的基本步骤
模板变性(dnature template)：将待测DNA模板 与引物混合，通过加热时模板变性； 退火(annealing)：将变性的模板与引物混合物 缓慢降温，使引物与模板结合； 标记(labeling)：利用放射性同位素标记核苷酸 或引物； 延伸(extension)和终止(termination)：反应体 系中新生核苷酸的合成和随机终止过程； 电泳分析和数据读取：聚丙烯酰胺凝胶电泳，放 射自显影，读取DNA的碱基排列顺序。
基因工程的原理和技术
两个切口 获得目的基因
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
3、将重组DNA导入受体细胞
转化
• 常用的受体细胞：
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、 酵母菌和动植物细胞等。
• 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
（1）将重组DNA导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法
（2）将重组DNA导入动物细胞
④利用PCR技术
⑤利用DNA转录
⑥人工合成
A．①②③⑤
B．①②⑤⑥
C．①②③④
D．①②④⑥
3.基因工程又叫基因拼接技术。
(1)在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之 一是：以目的基因转录的 信使RNA为模板，逆转录 成互 补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA(目的。基因)
(2)基因工程中常用的受体细胞有细菌、真菌、动植物细。胞
显微注射技术
提纯基因表达载体 体外显微注射入受精卵
受精卵移植
1.将重组DNA导入植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法
2.将重组DNA导入动物细胞 显微注射技术（最多、最有效） 3.将重组DNA导入微生物细胞 Ca2+处理，以增加细菌细胞壁的通透性。
目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高，导入完成 后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是 普通质粒A，只有少数导入的是重组质粒。
②检测目的基因是否转录出了mRNA
方法: 分 子 杂 交
过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂 交带,表明目的基因转录出了mRNA.
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法: 抗原抗体杂交
鉴定—— 抗虫鉴定、抗病鉴定等
基
基因工程的基本原理和技术
基因工程技术的使用引发了伦理和社会方面的讨论。其中涉及到隐私、公正 性、人类干预自然等问题，需要进行过编码蛋白质的氨基酸序列，决定了生物体的表型特征和功能。
2 调控机制
基因还参与调控其他基因的表达，控制细胞的功能和发育过程。
基因工程的基本步骤
1
1. 提取基因
从源生物体中提取含有目标基因的DNA。
2
2. 基因克隆
通过PCR等方法将目标基因复制并插入载体DNA。
3
3. 转录与翻译
基因工程的基本原理和技 术
欢迎来到本次演讲！我们将探讨基因工程的基本原理和技术，了解其定义、 背景，以及在医药和农业领域的应用，同时也会涉及到伦理和社会问题。
基因的结构和功能
基因是生物体中编码遗传信息的DNA片段，具有特定的结构和功能。它们是由氨基酸序列编码的 蛋白质的蓝图，同时也控制着生物体的发育和功能。
药物生产
利用转基因技术生产人类胰 岛素、生长因子等药物，提 高生产效率。
癌症研究
研究肿瘤相关基因，开发新 型抗癌药物和个体化治疗方 案。
基因工程在农业领域的应用
转基因作物
改良农作物，提高抗病虫害能力和耐逆性，增加产 量。
转基因畜牧业
培育更健康、高产的畜禽，提高肉类和乳制品的质 量。
基因工程的伦理和社会问题
将重组的DNA转录成RNA，然后翻译成蛋白质。
常用的基因工程技术
C R IS P R - C as9
一种高效的基因编辑技术，可用于精确修改目标基 因。
转基因
将外源基因导入目标生物体，实现特定的功能增强 或改进。
基因工程在医药领域的应用
基因治疗
通过修复或替换缺陷基因， 治疗遗传性疾病，如囊性纤 维化和遗传性视力损失。
2 调控机制
基因还参与调控其他基因的表达，控制细胞的功能和发育过程。
基因工程的基本步骤
1
1. 提取基因
从源生物体中提取含有目标基因的DNA。
2
2. 基因克隆
通过PCR等方法将目标基因复制并插入载体DNA。
3
3. 转录与翻译
基因工程的基本原理和技 术
欢迎来到本次演讲！我们将探讨基因工程的基本原理和技术，了解其定义、 背景，以及在医药和农业领域的应用，同时也会涉及到伦理和社会问题。
基因的结构和功能
基因是生物体中编码遗传信息的DNA片段，具有特定的结构和功能。它们是由氨基酸序列编码的 蛋白质的蓝图，同时也控制着生物体的发育和功能。
药物生产
利用转基因技术生产人类胰 岛素、生长因子等药物，提 高生产效率。
癌症研究
研究肿瘤相关基因，开发新 型抗癌药物和个体化治疗方 案。
基因工程在农业领域的应用
转基因作物
改良农作物，提高抗病虫害能力和耐逆性，增加产 量。
转基因畜牧业
培育更健康、高产的畜禽，提高肉类和乳制品的质 量。
基因工程的伦理和社会问题
将重组的DNA转录成RNA，然后翻译成蛋白质。
常用的基因工程技术
C R IS P R - C as9
一种高效的基因编辑技术，可用于精确修改目标基 因。
转基因
将外源基因导入目标生物体，实现特定的功能增强 或改进。
基因工程在医药领域的应用
基因治疗
通过修复或替换缺陷基因， 治疗遗传性疾病，如囊性纤 维化和遗传性视力损失。
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
总起 顺 这 来序种 ，的随 序恢 测 机 列复 定 的 。成 将 方 原派法 来生， 结的也 构序需 形列要 式拼通 的连过
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DNA
基因工程
第二章 基因工பைடு நூலகம்基本技术原理-DNA序列测定
待测 DNA 与 pBR322 或 pUC 分子
重组；
转化：转化反应物涂布在补加
有Xgal-IPTG选择性培养基平板上， 经37℃过夜培养；
挑选白色菌落，制备质粒NA。 碱变性处理，与引物一起退火，
然后按双脱氧法作序列分析。 优点：无需将 DNA 克隆到 M13 载 体上，更为简单快速，现已被许 多研究工作者采用。
克服缺点的一种途径—DNA分子克隆
将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到载 体分子上。选用天然的单链 DNA噬菌体，例如 M13作为 载体，重组体噬菌体的DNA分子，可直接用作模板。
引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体 DNA 中分离出来的一种限制片段。其特点是能够特异性地同载体分 子上与克隆位点相连的单链 DNA区段杂交。称做“通用引物” 。
反应体系中加入lmol/L浓度的盐，肼 同T的反应速率便会逐渐下降，以确 保发生C特异的化学切割反应。根据 这一特点区别C和C+T之间的降解产 物。
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
碱基特异的化学切割反应——硫酸二甲酯［（CH3O）2SO2］
在硫酸二甲酯的作用下，碱基环 中的氮原子发生甲基化反应（G N7和A N3）。 中性PH：甲基化导致配糖键水解， 留下失去碱基的糖一磷酸骨架上 的键。这种键十分微弱，易于使 糖片段两翼的磷酸脱落，造成 DNA断裂; 碱性 pH：采用六氢吡啶同DNA甲 基化反应，而这种反应对甲基化 的G是特异的。因此，DNA链的 断裂只在G发生。
3、Maxam－ Gilbert化学修饰法的原理是什么 4、DNA杂交测序原理是什么 5、什么是寡核苷酸矩阵芯片 6、杂交测序有什么应用
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仍被采用。
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.2.1 Maxam－ Gilbert化学修饰法的原理
化学试剂处理末端标记DNA片段，碱基的特异性切割产生的 DNA片段混合物,电泳分离显影后显现谱带，直接读出待测DNA 片段的核苷酸顺序。
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2.5.3 序列分析的自动化
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基因工程 2.5.4 DNA杂交测序
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
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基因工程 杂交的检测
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
这种方法特称为利用双链质粒 DNA模板的双脱氧 DNA
序列分析法。由于通常使用的质粒多是 pUC 载体系列， 所以又称之为Sanger双脱氧链终止-pUC体系DNA序列 分析法。
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
Sanger 双脱氧—pUC体系 DNA序列分析法基本步骤
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基因工程 M13载体克隆DNA片段
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
将DNA片段克隆在M13mp载体特定LacZ区段中 重组体噬菌体在含有IPTG和Xgal的培养基平板上形成白
色的噬菌斑;
非重组体的噬菌体则形成蓝色的噬菌斑。 从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链 DNA，就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。
基因工程 酶、原料比例
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
dNTP／ddNTP=100：1时，谱带分离效果较佳，可读出多
于 200个以上的核苷酸顺序。
降低dNTP对ddNTP浓度比，会产生逐渐加长的片段，再配 合使用长胶和低浓度的聚丙烯酰氨凝胶，分辨能力可提高到 能判读出300个左右的核苷酸顺序。
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.1.2 Sanger双脱氧-M13体系 DNA序列分析法
引物合成DNA序列测定法的特点及缺陷
高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制 策分 得析 高： 分这 子样 量处 理 后 吗， ？能
片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳
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基因工程 杂交测序的应用
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
检测单碱基的变化 序列比较分析 基因的表达状况 验证其他测序
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.5 DNA策序的商业运作及存在问题
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基因工程 引物—延伸测序策略
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
1968年华裔生物化学、生物学家吴瑞博士（Dr．Ray Wu
） 独创性地设计出一种崭新的引物延伸测序策略，并于 1971年首次成功地测定了λ噬菌体两个COS末端的完整序列；
1977，F.Sanger 在该策略的基础上，发展出了快速测定
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.1 Sanger双脱氧链终止法
DNA核酸序列分析历程
60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和 研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实
第一，如何分离寡核苷酸片段；
另一方面，在研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。
分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。 为了将这些降解的 DNA片段，按其原来的顺序“拼排” 起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对 同种DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。
DNA
费时、费力、费钱、DNA损伤严重
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第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
你作对了吗？
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第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.2.3 Maxam－Gilbert化学修饰法优点
不需要体外酶催合成反应 单双链都可以 需要末端标记 两端采用不同的标记，测序可从两端进行
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第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
运作方式 存在的问题
大公司“垄断”
仪器公司“垄断”
发展趋势
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SS S S
S S S S S S S SS SS
基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
返回第二章
“测序”思考回答问题 1、Sanger双脱氧链终止法原理是什么
2、使用M13mp载体系列的优点有哪些
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.2.2 化学修饰法测序图解
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
试试看
C T+C G+A A
A
G+A T+C
C
T T A T C A G G A T
G G C G A C T T C G
基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
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第五节 DNA核酸序列分析
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.1 Sanger双脱氧链终止法 ■ 2.5.2 Maxam－Gilbert化学修饰法■
2.5.3 序列分析自动化■
2.5.4 杂交测序■ 2.5.5 DNA策序的商业运作及存在问题■ 2.5.6 思考问题■
使用M13载体系列的优点 所有的待测定的DNA片段，都可以共用一种引物。这样， 就避免了合成和分离各种不同引物的许多麻烦。 应用M13mp载体系列的双脱氧链终止法，已经成为一种 最普遍采用的快速的DNA序列分析法。
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第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.1.3 Sanger 双脱氧—pUC体系 DNA序列分析法 将待测 DNA 片段克隆到质粒载体上，直接用闭合环形 的双链质粒 DNA按双脱氧链终止法作 DNA序列分析。
基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
反应：同时加入引物和 模板、 DNA聚合酶 1、一 种 ddNTP、 以 及 四 种 dNTP（有一种带放射性 标记）。 变性胶电泳分离反应混 合物。 放射自显影术，检测单 链 DNA 片段的放射性带。 结果判读，从放射性 X 光底片上，直接读出 DNA的核酸顺序。
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基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
2.5.2 Maxam－Gilbert化学修饰法 是 1977 年由美国哈佛大学的 A．M．Maxam 和 W．
Gilbert 发明的，所以又叫做Maxam－Gilbert DNA
序列分析法 虽然说对于大分子量的DNA片段的序列测定而言， 化学修饰法并不如双脱氧法方便有效，其发展速度 也不及后者迅速，但是至今在相当多的研究工作中