Vero细胞在WAVE反应器中的微载体球转球放大
WAVE细胞培养手册原理和方法
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WAVE 实时称重功能实现连续自动灌注培养 Merck 公司将集成细胞截留膜的无菌培养袋创新的用于工作细胞库的建立，内置的细胞截留膜可以在 无菌封闭的培养袋中进行细胞清洗和浓缩，最终实现工作细胞库的冻存，代替反复离心操作，有效避免细 胞库的污染。结果显示，在 10L 的规模下，可将细胞浓缩至 1.5x107 cell/ml 进行冻存，活率>95%，操作完 全符合 GMP 要求，有效保证细胞库的安全建立。 使用 WAVE 反应器，培养工作体积范围宽，推荐为5~50%的培养袋总体积，因此可以在一个培养袋中 实现 10 倍体积的扩增，无需种子罐和大量摇瓶，避免了在不同的培养容器中频繁转移传代。同一型号的 WAVE 反应器可兼容不同大小的细胞袋，实验室规模的 WAVE2/10可以配合 1、2、10L 的细胞培养袋，灵活 实现 50ml ~ 5L 体积的培养。WAVE20/50反应器可兼容 2、5 、10、20L 的细胞培养袋，可以灵活使用 1 或 2 个 2 ~ 10L 培养袋或 1 个 20L 的培养袋，实现 100ml ~ 10L 体积的培养，并可扩展为最大 25L 的培养体积。 可以从冻存管直接接种到培养袋中，进而快速扩增传代到 5-10L 规模，方便易用。
用国产生物反应器培养Vero细胞和狂犬病毒_张立
用国产生物反应器培养Vero细胞和狂犬病毒¹张 立º 范为民 严 春 陆 健 张元兴 宋瑶君 赵一鸣 陈文兰 俞俊棠(华东理工大学生物工程学院 上海200237)摘 要 介绍了国产生物反应器CellCul-50A的特点及性能,并利用此生物反应器培养了V ero细胞和狂犬病毒,细胞密度达1.1×107cells/ml,病毒滴度也得到了满意的结果。
关键词 生物反应器,CellCul-50A,细胞培养,Vero细胞,狂犬病毒0 引言 随着基因工程的发展,通过动物细胞培养能生产出各种疗效很好的药物、灵敏度很高的诊断试剂以及其它生物制品,如用Vero细胞生产乙脑病毒[1]和狂犬病毒[2],用草鱼吻端细胞培养生产草鱼出血热疫苗[3],用鸡胚细胞培养生产鸡法氏囊病病毒疫苗[4,5]等。
90年代初,利用基因工程和细胞工程等现代生物技术生产的蛋白药物,如HBsAg、EPO、tPA等一批产品,大量进入市场[6]。
蛋白药物的生产正发展成为一支高新技术产业。
通过细胞培养进行的病毒或蛋白产品的生产,其唯一途径是细胞的大规模培养。
这些细胞大多是贴壁依赖性细胞,让其贴附在微载体上在生物反应器中进行培养是最常用和最有效的模式[7]。
由于动物细胞与微生物有很大的差异,如动物细胞没有细胞壁、非常脆弱、对剪切敏感以及对体外培养环境有严格的要求,传统的微生物发酵用的反应器不适用于动物细胞的大量培养,因而对动物细胞培养用反应器的设计和过程控制提出了特殊的要求。
自70年代以来,细胞培养用生物反应器有了很大的发展,种类越来越多,规模越来越大,反应器的主要结构形式仍以搅拌式、气升式和固定床为主。
在国外,气升式反应器已放大到5000～10000L[8],搅拌式反应器已放大到8000L[9]。
我国在“七五”期间开始这方面的研究,已成功地研制了CellCul-20A细胞培养用生物反应器[10]。
“八五”期间,我们研制的50L细胞培养用生物反应器CellCul-50A保留了CellCul-20A的优点,并根据细胞生长对培养环境的特殊要求进行了改进。
狂犬疫苗介绍
成大生物狂犬病疫苗一）技术来源1984 年11 月，世界卫生组织（WHO ）和洛克菲勒基金会（RF）开始一项合作项目——以Vero 细胞为基质工业化生产狂犬病疫苗。
历时15 年的努力，科学有效地解决了生产、纯化中的诸多问题。
1999 年，该技术生产的高品质人用狂犬病纯化疫苗首先被批准在哥伦比亚使用，经过5年的实践，证明具有卓越的安全性和免疫效果。
该技术的核心在于实现了细胞的悬浮培养。
（二）主要技术1、高密度微载体技术1）微载体的诞生实现了细胞从贴壁生长到悬浮培养的革命。
成大速达? 的微载体技术指标：1 个微载体= 180 μm1 克微载体（干重）= 4,400cm 2500 克微载体= 1,000 转瓶（3 升转瓶）7.5 升反应器= 150 克微载体= 350 转瓶30 升反应器= 750 克微载体= 1,750 转瓶细胞密度: 10 x 106个细胞/ml细胞生长30 L 生物反应器= 7 天病毒生长天数= 20 天从上图我们可以看到细胞在微载体表面生长的非常好，细胞密度达107/ml 。
刚才已经谈过，巴斯德PV2061 狂犬病固定毒毒株是WHO 公认的免疫原性高的Vero 细胞适应株，因此，接种病毒后，连续收获病毒的滴度很高，这样从技术上就保证了成大速达?0.5ml 的小剂量里面，能够含有较高的抗原蛋白和较少的杂蛋白。
2）生物反应器为大规模细胞培养提供了设备支持。
全自动、封闭式、管道化的生物反应器3）比照传统生产工艺，微载体高密度细胞培养的优势：* 高细胞密度* 高病毒收获* 低污染的机会* 生产工艺可控性强* 微载体投放量高达25g/L ，细胞密度高达1.1-1.5x107/ml ，远超过其他工艺(转瓶、细胞工厂、其他类型反应器) 。
2、四柱层析纯化系统从前面的工艺流程中，我们已经知道，收获的病毒液必须经过无菌连接的管道化的澄清过滤和超滤浓缩后，灭活，然后，进行层析纯化。
下面的图中显示先进的纯化设备和训练有素的工作人员在操纵全自动的装备，经过这道关键的工艺后，有效地去除99.95%的杂蛋白和Vero 细胞DNA ，保证了成大速达?具有卓越的安全性。
WAVE(TM)生物反应器中的Cytodex(TM)
GE Healthcare应用文献 28-9576-34 AA疫苗WAVE™生物反应器中的Cytodex™ 微载体细胞培养工艺关键词：MDCK，Vero，细胞培养，微载体，Cytodex，WAVE，疫苗摘要介绍WAVE Bioreactor系统多用于悬浮细胞的培养。
然而，用于细胞治疗和疫苗生产的多种细胞为贴壁依赖型的，需要一个可贴附的生长表面。
在本研究中，Cytodex微载体被应用在CellbagTM生物反应器中以扩增Madine-Darby Canine Kidney (MDCK)和Vero细胞。
为了优化细胞贴附，测试了两种细胞株的不同摇动混合条件。
我们发现培养基成分对细胞贴附有显著的影响；例如在低血清培养基中的MDCK和Vero细胞，用间歇式和连续摇动混合都可以使细胞贴附到微载体上。
然而，在无血清条件下，Vero 细胞在间歇式摇动混合下可以获得高贴壁率。
生长在 WAVE Bioreactor系统中的MDCK 细胞可以被放大到2 L和10 L工作体积。
细胞达到最大密度为3×106细胞/ml。
Vero细胞在2 L工作体积下的Cytodex 1和Cytodex 3微载体上培养，无血清条件下达到1.4×106细胞/ml 最大密度。
用转瓶同样条件可以获得相同密度的Vero细胞，WAVE中细胞生长速度更快。
数据显示WAVE Bioreactor系统是成功用于MDCK和Vero细胞微载体培养的通用平台，可以方便的进行规模放大，是对传统搅拌罐生物反应器或转瓶的一种快速和方便的替代系统。
与滚瓶 (Roller Bottle)中的细胞培养不同，贴壁细胞在微载体上的培养使它相对容易进行生产工艺的规模放大。
此外，微载体使细胞能够在生物反应器中扩增，与多个小T型瓶等塑料培养容器相比，生物反应器可以提供更好的工艺参数自动控制，降低劳动强度的同时减少污染的危险。
一次性生物反应器的使用减少了投资成本、提高灵活性(简化批次间的轮换准备等操作），消除了生产容器清洗验证的需要。
人教版 选择性必修一免疫学的应用 教案
第3节免疫失调第4节免疫学的应用课标内容要求核心素养对接举例说明免疫功能异常可能引发疾病，如过敏、自身免疫病、艾滋病和先天性免疫缺陷病等。
社会责任——向家人和他人宣传艾滋病的知识，不歧视艾滋病患者，并结合自身情况选择接种各种类型疫苗，认同器官捐献。
一、过敏反应1．概念：已免疫的机体，在再次接触相同的抗原时，有时会发生引发组织损伤或功能紊乱的免疫反应。
2．原因：由过敏原引起的。
3．机理：在接触过敏原时，在过敏原的刺激下，_B细胞会活化产生抗体。
抗体吸附在皮肤、呼吸道或消化道黏膜以及血液中某些细胞的表面。
当相同的过敏原再次进入机体时，就会与吸附在细胞表面的相应抗体结合，使这些细胞释放出组织胺等物质，引起毛细血管扩张、血管壁通透性增强、平滑肌收缩和腺体分泌增多，最终导致过敏者出现皮肤红肿、发疹、流涕、打喷嚏、哮喘、呼吸困难等症状。
4．特点(1)过敏反应有快慢之分。
(2)有明显的遗传倾向和个体差异。
5．主要预防措施：找出过敏原并且尽量避免再次接触该过敏原。
二、自身免疫病1．概念：自身免疫反应对组织和器官造成损伤并出现症状。
2．举例：风湿性心脏病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等。
3．风湿性心脏病发病机理某种链球菌的表面有一种抗原分子，与心脏瓣膜上一种物质的结构十分相似，当人体感染这种病菌后，免疫系统不仅向病菌发起进攻，而且也向心脏瓣膜发起进攻。
结果，在消灭病菌的同时，心脏也受到损伤，这就是风湿性心脏病。
三、免疫缺陷病1．概念：指由机体免疫功能不足或缺乏而引起的疾病。
2．种类(1)先天性免疫缺陷病：由于遗传而生来就有的免疫缺陷。
(2)获得性免疫缺陷病：由疾病和其他因素引起的免疫缺陷。
大多数免疫缺陷病都属于获得性免疫缺陷病。
3．典型实例：艾滋病(1)原因：HIV能够攻击人体的免疫系统，主要侵染辅助性T细胞。
(2)主要传播途径：性接触传播、血液传播和母婴传播。
(3)预防措施：①采取安全的性行为；②避免注射吸毒；③接受检测并积极治疗HIV等性传播感染；④不与他人共用牙刷和剃须刀；⑤不用未经消毒的器械文眉、穿耳等。
Vero细胞使用说明书
Vero细胞使用说明书产品基本信息产品货号YC-A001细胞名称Vero中文名称非洲绿猴肾细胞细胞形态上皮样,贴壁细胞传代比例1:3~1:6培养体系90%DMEM+10%FBS冻存液体系50%DMEM+40%FBS+10%DMSO特殊备注细胞接收1)冻存细胞：如果是干冰运输的冻存细胞，收到后请立即转入液氮储存或短暂（24H)放至-80℃冰箱保存，或直接进行细胞复苏。
2)活细胞：如果是T25瓶活细胞运输，收到后用75%的酒精对T25瓶外表面进行消毒，之后放在5%CO2、37℃的细胞培养箱静置2h，静置后取出细胞瓶在显微镜下观察细胞贴壁情况和细胞汇合度，分别在100X和40X下各拍2个不同视野的细胞拍照记录。
如果汇合度达到80%以上的传代密度，可以进行传代操作，如果细胞汇合度没有达80%以上不够传代，弃掉瓶内培养基，更换新鲜完全培养基。
(灌满细胞培养基不能正常用来培养细胞。
)注意：收到细胞后，活细胞首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否漏液、浑浊等现象。
冻存细胞若发现干冰已挥发完、冻存管瓶盖脱落、破损等异常情况，请务必拍照保留，并于收货24h内与我们联系（电话：400-688-9033；https://）。
细胞复苏1)准备工作：将完全培养液置37℃水浴锅预热30分钟，随后将冻存的细胞从液氮中取出，转移到-80℃冰箱，放置数分钟让残余液氮挥发；2)在超净台内用吸管吸取6-7mL完全培养液至15mL离心管中；3)将细胞从-80℃冰箱取出暂时放置于干冰里，复苏时稍稍甩动，去除残留的干冰和液氮，再迅速用镊子夹住盖子放入37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化；4)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，稍稍晾干。
用单道移液器将所有融化的细胞悬液转至提前准备好的完全培养液中，盖上盖子，1100rpm室温离心4分钟收集细胞；5)超净台内小心吸弃上清，用单道移液器吸取1mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移至装有4mL完全培养液的T25cm2培养瓶(或者6cm的皿)中，写上细胞名称、复苏日期、代次，放置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养。
Vero细胞的微载体培养_放大过程中的接种工艺
79
90
100
100
贴壁率, 结果如表 2。从表中 3 U nder the m icro scope, 1 000 m icrocarriers w ere num bered random ly and the
p lating rate w as defin ited as:
可以看出, 当新球比例增加 时, 细胞贴壁率降低, 同时贴
三次, 再用戊二醛固定, 样品由华东理工大学分析测试中心电镜室处理后拍照。
2 结果与讨论
2. 1 细胞生长状态对球转球的影响 转瓶中微载体浓度为 3g L , 当微载体上细胞分别长到: ① 微载体上没有完全被细胞贴
满, ② 微载体上已被细胞贴满, ③ 微载体上的细胞已长成多层时, 补加新的微载体 2g L , 以后 每天取样计数光球数和满球率, 结果如表1。从表1可以看出, 当微载体上细胞已长到致密单 层时补加微载体, 可使新的微载体上较快地有细胞贴附, 贴壁率很快达到 100% , 其他两种情 况需要较长时间贴壁率才能达到 100%。 这可能由于球间转移方式是通过细胞粘附搭桥生长 或单个细胞迁居生长[6]。 当细胞生长旺盛时, 细胞搭桥生长或迁居生长能力强; 当微载体上细 胞长满时, 细胞向外生长的趋势明显, 因而更易进行球转球 (见图 1)。因此, 当微载体上已被细 胞贴满时, 补加适量微载体进行球转球时机最好。
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第6期
张 立等: V ero 细胞的微载体培养
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2. 2 新老球比例对球转球 的影响
3∶3 3∶2 2∶1
细胞培养vero实验报告
Vero细胞传代培养实验报告一、实验原理体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。
培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。
在一代中，细胞培增3～6次。
细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。
细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。
二、器材和液体的准备①.细胞培养器材：培养箱、超净工作台、倒置显微镜、25m培养瓶、5ml移液管、1ml枪头；②. 细胞培养溶液：配制好的PBS液、DMEM培养液（10%血清）、胰酶溶液。
（均已过滤灭菌， 37℃预热）③．其他器材及灭菌用品：计时器、无菌手套、75%酒精、镊子、棉球、废液缸。
三、实验操作①．将长成单层的Vero细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中吸出瓶内的培养液，加入3~5ml的PBS溶液洗涤一次后吸出，加入1ml胰酶溶液，左右晃动培养瓶使胰酶溶液平铺在细胞表面。
放入37℃，5%二氧化碳培养箱中放置3分钟。
②.在倒置显微镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液吸出，加入2ml新鲜培养液，反复吹打，制成细胞悬液。
③．将细胞悬液吸出1ml废弃后，将培养瓶中培养液添加至5ml左右，盖好瓶塞，送回37℃，5%二氧化碳培养箱中，继续进行培养。
④. 记录细胞生长情况。
四、无菌操作的注意事项①．在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。
为此，在操作前要认真地洗手并用75％乙醇消毒。
将要放入超净工作台的器材均需放入前喷洒75%酒精灭菌。
操作前30分钟起动超净台紫外灭菌后打开吹风，酒精棉球擦拭超净工作台面。
无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒工艺的建立
无血清培养基培养 Vero细胞制备狂犬病病毒工艺的建立摘要：文章主要是分析了Vero 细胞无血清培养基的组成，在此基础上讲解了Vero细胞无血清细胞培养基的发展，望可以为有关人员提供到一定的参考和帮助。
关键字：Vero细胞；无血清培养基；研究进展1、前言当前现代细胞工程的不断发展，无血清培养基培养Vero细胞作为其中的基质生产疫苗已被广泛的应用，市场上的商品化Vero细胞无血清培养基主要是使用到无血清培养基以及无血清无动物源成分的培养基，其可以有效维持到细胞在体外的生长以及增值，但其中还是存在了一定的污染可能，这会在一定程度上使得疫苗存在一定风险。
2、组成2.1、基础培养基葡萄糖是血液生长、增殖和产物表达过程中的重要能量来源。
通过对血清培养Vero细胞中枢代谢的研究，发现葡萄糖主要参与葡萄糖代谢，而谷氨酰胺是三羧酸循环中最重要的碳源。
用天门冬酰胺和丙酮酸钠代替谷氨酰胺作为碳源，才可以有效的减少到了次级代谢的产物（如乳酸和氨）对细胞的伤害，且谷氨酰胺易被降解，在新形成的培养基中加入等量的谷氨酰胺。
2.2、主要添加因子在Vero无细胞培养的早期研究中，主要是加入到了一些牛（人）血清白蛋白和转铁蛋白，然后有效的促进到了细胞的生长。
然而，血清白蛋白不仅能调节渗透压，能够有效的保护到了细胞免受受到机械的损伤，而且能与维生素、脂类激素、金属离子和生长因子结合，使这些物质在血清培养中的活性转移到血清培养中，具有结合毒素和还原蛋白酶的作用。
通过新的研究发现Vero细胞无血清培养物现在用于用植物蛋白质水解酸盐可以替换成了血清白蛋白。
该蛋白质是复杂的，其中主要是包括了氨基酸，寡肽，橄榄果多酚和纤维。
目前，最常用的植物水解产物是大豆植物水解产物，小麦植物水解产物和水稻水解产物。
这些植物蛋白质使疫苗更加安全。
转铁素是无细胞培养物中最重要的额外组分，这可能导致细胞生长抑制。
在没有动物来源成分的Vero细胞培养基研究中，认为铁柠檬酸铁和维生素C的混合物可以取代转铁蛋白。
微生物报告
1.产品的意义：目前恶性肿瘤已超过心脑血管类疾病成为首位人类致死性疾病, 采用Vero细胞培养技术生产的重组溶瘤性Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅱ)具有良好的溶源性、靶向性和安全性, 具有重要的应用价值。
国内人类肿瘤疫苗的有关研究处于刚起步状态，面临多重难题，建立高效的肿瘤疫苗生产工艺具有非常重要的社会和经济价值。
经过重组减毒的Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒作为高效新型病毒疫苗有望用于肿瘤的临床研究。
图1.溶瘤病毒的作用机制2.生产材料：①细胞培养：Vero 细胞②病毒株：重组Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒HSV—II，中国医学科学院肿瘤研究所提供。
③微载体：Cytodex 1④生物反应器图2.产品外观图3. Cytodex 1微载体图4.Vero细胞图5.生物反应器3.经济效益：经查阅ATCC，Vero细胞为免费（不包邮）；病毒株需向中国医学科学院肿瘤研究所申请提供（几乎免费）；微载体Cytodex 1市价为3元/瓶；生物反应器可租借。
成本保守估计（不算设备使用费）：每支成本约为6元，预售价为98元，除去设备费和人工生产费，约可净得利润30RMB/支（1ml）。
4.生产工艺流程：图6.生产车间流程图在反应罐培养间中进行重组HSV—Ⅱ病毒疫苗的微载体悬浮培养，步骤如下：①Cytodex 1微载体制备：称取一定量Cytodex l置于二甲基二氯硅烷硅化的转瓶／瓶子内，加入PBS(pH 7．2)水化，比例约为80～150 mL／g Cytodex 1，约3h后将PBS倾去，加入新PBS继续水化约3 h(可过夜)，倾去并用新的PBS洗涤一次。
高压灭菌121℃ ，30min，冷却后倾去PBS，用培养基洗涤一次后倾去，重新加入新鲜培养基置4℃ 冰箱平衡过夜，待用。
PBS继续水化约3 h(可过夜)，倾去并用新的PBS洗涤一次。
高压灭菌121℃ ，30 min，冷却后倾去PBS，用培养基洗涤一次后倾去，重新加入新鲜培养基置4~C冰箱平衡过夜，待用。
WAVE生物反应器
疗、植物细胞以及细菌酵母发酵等多种培养体系。WAVE生物反应器兼容批式 (Batch)、批式流加 (Fed
Batch)或连续灌注 (Perfusion) 等培养方式，适合实验室规模细胞培养，以及工艺开发放大和cGMP商业
生
化规模生产。
物
反 应
易于线性放大
器
WAVE波浪生物反应器克服了传统搅拌式反应器搅拌桨叶端剪切力高的弊端，大的气液交换表面可在
新型WAVE波浪生物反应器系统
1996年，先灵葆雅(Schering-Plough)著名细胞培养专家Dr. Vijay Singh发明新型WAVE波浪生物反应器， 引发了细胞培养技术行业的革命，从而赋予生命科学研究，细胞培养工艺开发和生物制药生产全新的 意义！ WAVE波浪生物反应器创新的采用非介入的波浪式摇动混合，避免了搅拌浆叶端和鼓泡对细胞的伤 害，提供温和低剪切力高溶氧的细胞培养微环境，有利于改善细胞状态、提高细胞密度和产量。 WAVE波浪生物反应器培养体积范围灵活、操作简单、控制精密可靠、易于工艺放大。 细胞培养袋由医药级材质制成，预先经过辐照灭菌，从而杜绝污染风险，有效避免反应器的清洗和验 证，缩短工艺开发和生产周期。无菌的细胞培养袋不仅提高细胞培养成功率，密闭的培养系统可避免 料液和操作人员的直接接触，确保生物操作安全。 2011年3月最新上市的新一代WAVEPOD II全自动反馈控制器，将细胞培养过程高精度全自动参数反馈 控制功能进一步强化。WAVEPOD II通过先进的PID反馈控制技术和光纤电极光补偿技术，可进一步提 高细胞培养工艺的稳定性和可靠性。经典的Unicorn工作站进行细胞培养过程的全方位监控和数据采 集，实现数据分析、比较和报告打印等；电子签名和多级用户密码管理功能保证数据安全，符合各项 法规要求。 作为通用的细胞培养/发酵技术平台，WAVE生物反应器已经经过普遍的验证，成功的用于各种细胞培 养和发酵等领域，如CHO和杂交瘤等细胞培养表达单抗、Vero/MDCK/二倍体等细胞Cytodex微载体悬 浮培养多种病毒、昆虫细胞杆状病毒系统以及CHO/HEK293瞬转高通量表达重组蛋白、细胞治疗、植 物细胞、细菌和酵母发酵等。 全球各大科研院所和知名国际制药公司均使用WAVE生物反应器进行细胞培养工艺开发和放大生产。 2009年，美国Novavax公司将新型WAVE生物反应器为核心的RTP生产技术平台和VLP技术相结合，从 甲流病毒基因到最终生产出VLP甲流疫苗仅用21天；2005年，以新型天花疫苗和治疗性HIV疫苗著称的 丹麦Bavarian Nordic公司将WAVE生物反应器用于新型MVA疫苗生产，仅用11个月时间就建成了大规模 细胞培养新型疫苗生产车间，建厂周期比传统培养发酵罐方式缩短了6-9个月；此外，包括Remicade 单抗在内的多种上市药物均使用WAVE进行GMP生产！
美国Wave摇袋式细胞培养生物反应器
多用途 特殊设计的多样化的设备构造适合悬浮细胞、 微载体、批次、流加或灌注培养。
易放大 搅拌式培养瓶、滚瓶和其他类似系统因其固 有受限的传质表面而无法放大。WAVE 波浪 生物反应器没有这种限制。业已验证了 580 升培养体积的操作。
T 细胞自体治疗 HEK293/腺病毒 原代细胞 重组蛋白表达系统 疫苗生产
病毒性疫苗生产 WAVE 波浪生物反应器提供的密闭系统对病 毒产物十分理想。在基因治疗的应用中，人 293 细胞生长在悬液中，然后用重组的腺病 毒感染。当细胞生长到 4 × 106/ml 时病毒产 物为 100,000 病毒颗粒/细胞。
2
2
细胞袋持续提供可调节CO /空气比例的气体。 2
O MIX 氧气混合控制器为昆虫细胞、病毒和 2
高细胞密度培养中的 Cellbag 细胞袋供应富
含氧气的气体。O MIX 也能够为厌氧细菌提 2
供维持无氧环境。
DOOPT 独特的光纤溶氧控制器，溶氧探针能 够实时检测溶氧。DOOPT 是唯一的耐光褪色 和周围环境光线影响的DO检测器，能够进行 高精确度的测定。
昆虫细胞/杆状病毒 WAVE 波浪生物反应器的高供氧能力使它对 昆虫细胞的培养十分理想。一般能够获得的 细胞密度超过 9 × 106 细胞/ ml。
杆状病毒的产量比用常规生物反应器的更高。 WAVE 波浪生物反应器系统非常容易进行操 作和细胞接种放大，杆状病毒感染能够在细 胞袋内进行，减少了转移的需要。
9 lbs (4.2 kg)
34 lbs (15.5 kg)
780 lbs (350 kg)
WAVE生物反应器
Filtrate drawoff nozzle Polyethylene top
ాዃဦԇপାఈ
Cellbag ဦԇಢᄢڀ ಢᄢᅂ
Ԓڢፌߛဦԇ܈ǖ4×107 cell/ml CHO 7×107 cell/ml NSO
9×107 cell/ml T-cells 10×107 cell/ml S2 cell
疗、植物细胞以及细菌酵母发酵等多种培养体系。WAVE生物反应器兼容批式 (Batch)、批式流加 (Fed
Batch)或连续灌注 (Perfusion) 等培养方式，适合实验室规模细胞培养，以及工艺开发放大和cGMP商业
生
化规模生产。
物
反 应
易于线性放大
器
WAVE波浪生物反应器克服了传统搅拌式反应器搅拌桨叶端剪切力高的弊端，大的气液交换表面可在
WAVE
单克隆抗体
WAVE生物反应器系统已经被广泛用于单克隆抗体生产，包括常见的CHO细胞、杂交瘤细胞、NS0细
5
胞，S2昆虫细胞等。
初始阶段可采用小体积进行培养，随后当细胞密度提高后不断补充新鲜培养基而实现扩增。这使得接
种后放大培养避免在不同容器间的频繁转移，从100ml扩增到500L规模仅需WAVE20/50和WAVE1000两 台生物反应器，快速灵活，节省硬件设备投资。
生
摇动平台集成空气泵，可选CO₂或O₂混合功能，内置高精度气体质量流量计，可分别用于不同种类的
物
细胞培养和发酵应用。
反
应
器
选
择
指
南
摇动平台集成空气泵和质量流量计
触摸屏数字智能调节控温/灌注培养/空气流量
摇动平台可选称重功能，结合预置细胞截留膜的灌注细胞培养袋，可设定灌注速率进行自动连续灌注 培养，显著提高细胞密度，无需额外细胞截留装置，使用方便灵活。连续灌注培养已经成功验证于 CHO细胞、杂交瘤细胞、昆虫细胞、HEK293细胞和T细胞等，一般可获得1-5x107cell/ml以上的细胞密 度，其中S2昆虫细胞密度超过108cell/ml，使用较小的反应器即可实现较大规模的样品制备和生产，有 利于减小前期投资。
生物反应器的应用状况与前景
生物反应器的应用状况与前景201230620207 雷智烺摘要：生物反应器是指用于生物反应过程的容器总称。
包括酶反应器、固定细胞反应器、各种细胞培养器和发酵罐等。
本文阐述了生物反应器的应用现状及前景。
关键词：生物反应器应用前景生物反应工程学科是随着生物技术的发展逐步形成的，生物反应工程是一门以生物学，工程学，计算机与信息技术等多学科为基础研究生物反应过程中带有共性工程技术问题的交叉学科，生物反应工程以生物反应动力学为基础，将传递过程原理、设备工程学、过程动态学及最优化原理等化学工程学方法与生物过程方面的知识相结合，进行生物反应过程的分析与开发，以及生物反应器的设计、操作和控制等。
自然界中的生物现象可以说是无处不在，这些现象中的核心是生物微化反应，或者说是生物的生长、繁殖、形成产物、某些物质的减少或增加过程。
一般生物反应过程可以分为三个阶段：第一阶段指原料处理和培养基制备；第二阶段是利用生物反应器通过生物反应产生目的产物的过程；第三阶段指目的产物的提取与精制。
随着生物技术的发展，利用数学、化学工程学、化学工程原理和计算机技术等进行生物反应过程研究，使培养操作过程控制更为合理，新的生物反应器不断出现。
现今，生物反应器在许多领域都有应用：一．动物培养用生物反应器动物细胞体外培养时，生物反应器是整个培养过程的关键设备，为细胞提供了一个适宜的生长环境，使之快速增殖并形成所需的生物组织制品。
由于动物细胞在其形态结构、培养方法以及所需的力学环境等方面均不同于微生物细胞，因而传统的微生物反应器显然已不适用于动物细胞大规模培养，特别是组织工程的需要，促使新型生物反应器的研究与开发。
生物反应器的分类及结构特点：1、搅拌式生物反应器搅拌式反应器靠搅拌桨提供液相搅拌的动力，它有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性，因此在生物反应中被广泛使用。
但由于动物细胞没有细胞壁的保护，因此对剪切作用十分敏感，直接的机械搅拌很容易对其造成损害，传统的用于微生物的搅拌反应器用作动物细胞的培养显然是不合适的。
Vero细胞在微载体上迁移和多层生长现象
Vero细胞在微载体上迁移和多层生长现象
温华杰
【期刊名称】《电子显微学报》
【年(卷),期】1997(16)1
【摘要】本文通过对电子显微镜观察了Ｖｅｒｏ细胞有微载体增减过程中的迁移
民政部发现在不同增减阶段，Ｖｒｏ细胞迁移方式不同；在分泌形成的细胞外基质，上，Ｖｅｒｏ细胞迁移是通过层粘连蛋白介导进行的，被层粘连蛋白抗体抑制；这种迁移导致Ｖｅｒｏ细胞在微载体上形成多层生长现象。
【总页数】1页(P21)
【作者】温华杰
【作者单位】中国科学院化工冶金研究所生化工程国家重点实验室;中国科学院化
工冶金研究所生化工程国家重点实验室
【正文语种】中文
【中图分类】Q246
【相关文献】
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2.Vero细胞微载体放大培养技术研究 [J], 毕军;王强;孙文
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Vero细胞在WAVE反应器中的微载体球转球放大陆丽芳，Christain Kaisermayer, 姚钰舜，隋礼丽通用电气医疗集团生命科学部，Fast Trak研发中心，上海概要Vero细胞能被广泛应用于疫苗的生产。
Vero细胞的培养技术能否成功放大对于该技术能否大规模应用于疫苗生产至关重要。
作为贴壁细胞，我们的经验证明Vero细胞能够成功地用微载体技术在WAVE反应器中生长。
为了进一步寻求放大培养的可能性，我们在WAVE反应器中进行了细胞从微载体Cytodex 1上的球转球实验。
一系列的实验都相当成功。
Vero细胞首先在10 L的培养袋中用Cytodex 1微载体培养到一定密度，生长在微载体上的细胞随后用胰蛋白酶消化，经消化后基本脱离微载体的细胞最终和旧的微载体根据一定的传代密度转移到新的微载体培养体系中并开始新一轮细胞培养。
我们的结果显示，几次这样的转移传代前后，细胞的生长速度基本一致。
Vero细胞的微载体培养技术在WAVE反应器中放大完全可能。
进一步的实验显示，在现有的工作条件下，Vero细胞在Cytodex上的培养以及球转球工艺可以达到10倍的放大倍率。
这为基于细胞培养的疫苗大规模工业化生产新前景提供了可靠的支持。
概要 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·1前言 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·2方法 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·2 WAVETM 反应器中Vero细胞的培养 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 2 在瓶子内进行球转球实验 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 2 在WAVETM培养袋内进行球转球实验 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 3结果 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·3 各次球转球实验情形· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 3 球转球前后细胞生长曲线· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·4 球转球前后细胞在微载体上的生长形态· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 4讨论· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·8结论· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·8参考文章· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 9陆丽芳博士：通用电气医疗集团生命科学部，Fast Trak研发中心，科学家前言Vero细胞最初起源于非洲绿猴肾，已知对多种病毒如SV40、 SV-5、麻疹病毒、虫媒病毒、呼吸道肠道病毒、风疹、猿腺病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、副流感病毒、牛痘病毒等等，都敏感。