动物细胞培养生物反应器.
动物细胞培养生物反应器
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传统发酵罐
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酶反应器等
•
固定化酶和细胞反应器
•
动植物细胞培养反应器
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生物反应器类型
机械搅拌式反应器 气升式生物反应器 鼓泡塔生物反应器 膜生物反应器
动物生物反应器 植物生物反应器
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4
一 机械搅拌式生物反应器
医药工业中的第一个大规模的微生物发酵过程青霉 素生产是在机械搅拌式反应器中进行的。且迄今为 止，对新的生物过程，首选的生物反应器仍然是机 械搅拌式反应器。机械搅拌式反应器能适用于大多 数生物过程，是形成标准化的通用产品。
• 显然，反应器的增大有利于降低生产成本。
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2 动植物细胞培养反应器得到较大发展
• 由于动植物细胞培养可以得到很多高附加值生物 制品，如干扰素，单克隆抗体等，细胞培养反应 器的开发越来越受到重视。其中关于供氧问题， 快速升温、SIP自动灭菌、CIP自动清洗、机械 密封、排气处理、取样处理等问题等都需很好解 决。
混合不够均匀。
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三 其他类型反应器
• 鼓泡塔生物反应器 • 膜生物反应器 • 固定床和流化床反应器 • 动物植物生物反应器 • 其他
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四 生物反应器的发展趋势
• 生物反应器的研究、开发和设计是生物技 术的一个重要内容，一种好的生物反应器 出现往往能够大规模降低生产成本，成为 生物制品成功商业化的关键。因此，生物 反应器的开发一直很活跃，尤其是最近的 细胞生物反应器开发更是如此。生物反应 器的发展趋势可归纳为以下几个方面：
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7
• 反应器的结构
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8
几何尺寸
H/D=1.7~4 d/D=1/2~1/3 W/D=1/8~1/12 B/D=0.8~1.0 (s/d)2=1.5~2.5 (s/d)3=1~2
生物工程设备思考题---------答案
生物工程设备思考题名词：对数残留定律：在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其减少量随着活菌数的减少而递减，即微生物的死亡速率与任一瞬时残留的活菌数成正比。
纳滤：（NF）是介于反渗透与超滤之间的一种压力驱动型膜分离技术，是一个能从溶液中分离出相对分子质量为300-10000的物质的膜分离过程。
错流过滤：在泵的推动下料液平行于膜平面流动，与死端过滤不同的是料液流经膜面时产生的剪切力把膜面上滞留的颗粒带走，从而使污染层保持在一个较薄的水平双水相萃取：双水相系统形成的两相均是水溶液，它特别适用于生物大分子和细胞粒子，不同的高分子溶液相互混合可产生两相或多相系统，如葡聚糖和聚乙二醇，按一定的比列与水混合，溶液混浊，静置平衡后，分成互不相溶的两相，上相富含PEG,下相含葡聚糖。
超临界萃取：利用超临界流体，即其温度和压力略超过或靠近临界温度和临界压力，介于气体和液体之间的流体为萃取剂，从固体或液体中萃取出来某种高沸点或热敏性成分，以达到分离和提纯的目的。
动物细胞培养生物反应器：是一类模拟培养物在生物体内的生长环境，具有较低的剪切效应，较好的传递效果和力学性质的设备。
中空纤维细胞培养法：细胞能在中空纤维上不断地从流动的培养液中获得营养物质，细胞代谢产物和培养物又可随培养液的流动而流走。
微囊化培养技术：是用固定化技术将细胞包裹在微囊里，在培养液中悬浮培养。
酶反应器:以酶为催化剂进行生物反应所需的设备。
1.粉碎的粒径范围如何划分？原粒径成品粒径粗碎 40-1500mm 5-50mm中细碎 5-50mm 0.5-5mm微粉碎 5-10mm <100um超微粉碎 0.5-5mm <25um2.机械粉碎的5种形式（5种粉碎力）挤压粉碎、冲击粉碎、磨碎、劈碎和剪碎。
3.影响灭菌的因素是什么？微生物的热阻和相对热阻；培养基成分与其物理状态、其氢离子浓度；其微生物数量；微生物细胞含水量；微生物细胞菌龄；微生物的耐热性；空气排出情况；搅拌；泡沫。
动物细胞培养主要仪器(一)
动物细胞培养主要仪器（一）（一）提供细胞培养环境的仪器 l.CO2 指能精密控制并提供恒温、恒湿、洁净、恒定CO2浓度的仪器，利用该仪器可用法培养皿、多孔板（(6-96孔板）、培养方瓶等举行细胞培养。
按照容积大小，有60-190L 台式，也有上下堆叠落地式。
按照通气情况，普通通CO2和空气，也有3气（CO2、N2和空气）或4气（CO2、NZ2、O2和空气）培养箱。
按照控温类型，区别为水套式和蔼套式两种。
2．细胞工厂在CO2培养箱中，应用特定的培养容器举行细胞大量培养。
3．滚瓶培养 (1)滚瓶培养箱放置于CO2培养箱中用法，有驱动滚瓶滚动的机械装置，可以应用滚瓶举行细胞大量培养。
(2)滚瓶培养架在CO2浓度、温度、湿度可控的洁净间内用法，有驱动滚瓶滚动的机械装置，可以应用滚瓶举行细胞大量培养。
4．生物反应器生物反应器，也称动物细胞罐，应具有良好的无菌控制，通过特地的控制器组件举行细胞大量培养，普通需要4气（CO2、N2、O2和空气）培养，可分批次培养和延续培养形式。
需要配置特地的补料瓶。
培养工艺复杂，仪器设备的造价往往很高，通常用于讨论、中试和生产。
按照罐体容量和培养容量（培养容量往往比罐体容量小）区分大小。
普通在讨论试验室用法的生物反应器的罐体体积常在30L以下，用于生物制品制备的生物反应器体积达到500L 以上。
罐体可以是钢化玻璃、陶瓷，也可以是不锈钢或钦合金或铁。
（二）用于换液操作的仪器 1．微量移液器微量移液器是常用的无菌操作移液用仪器，有单通道、8通道和12通道等规格。
频繁的种类如下：(1)50-200μl单道微量移液器，配套200μl无菌塑料吸嘴用法。
(2)50-300μl8道微量移液器，配套300μ1无菌塑料吸嘴用法。
(3)500-5000μ1微量移液器，配套5000μ1无菌塑料吸嘴用法。
(4)电动大量移液器，协作无菌长丝滴管、无菌刻度移液管用法，移液速度可调。
（三）镜检与显微影像记录仪器 1．倒置显微镜和倒置荧光显微镜与正置显微镜（一般显微镜）的主要区分在于，倒置显微镜是载物台在光源下方，或者说物镜在载物台下方的显微镜，使得物镜镜第1页共2页。
细胞工程第六章动物细胞培养生物制药
BHK 21细胞（Baby hamster kidney cell）：是1961 年英国从幼地鼠的肾脏分离的细胞。成纤维样，异 倍体。常用于增殖病毒制备疫苗和重组蛋白。
Vero细胞（Vero cell）:是1962年日本从非洲绿猴肾 中分离的细胞。成上皮型，异倍体，贴壁型，是最 常用的大规模培养的动物细胞。
和将产终物体形积成1/积3～累1到/2的适培当养的液时装间入，反一应次器性中收，获适细宜胞
（二）大规、条模产件培物下养、接技培种术养细基胞的。，操培作养方过式程中流加浓缩的营养物 12、 、分流批加式 式培培或细和养养将密在时培胞产细度细间养和物原胞之胞取液培 形有接前增出，养成体种，长部使基过积于以和分细一程，一一产培胞品起中维定定物养持达加，持体速形物续到入不反积度成，生较反断应的连过再长高应将器培续程用至水器部内养添中新较平后 分总基加，培高，培体，新每养密在养积细鲜间液度细基不胞培隔补、胞取变达养一足目增出最基段到标长，大，产
供新鲜培养液流入小室和旧培养液
◆旋转管培养的排方出法，从而使细胞生活在不断更新
的培养液中
◆灌注小室培养法
3． 、培养液的发展 天然培养基(胎汁、血浆和血清)
人工合成培养基（需添加血清）
无血清细胞培养基（用激素、生长因子替代血清）
第三节 动物细胞培养的应用
一、在生物学领域基础研究中的应用 1、在细胞生物学上的应用
始分裂。随着细胞数量增多，细胞间开始接触并 连接成片，出现接触性抑制。 3、停滞期：细胞长满载体表面，随着营养物消耗和 代谢物积累，密度抑制现象出现，细胞开始退化。 如不及时传代培养，细胞脱落死亡。
微载体培养的操作过程：
微载体培养动物细胞也经过以上四步。大致可 以分为五个阶段，即培养初期阶段、黏附贴壁阶段、 维持培养阶段、细胞收获阶段、微载体培养的放大 阶段。
动物细胞和植物细胞培养反应器
六叶罗式搅拌器实物图
后来，有人使用锚式搅拌器和螺旋式搅拌器进行植物细胞的培养，
也取得了较好的效果。一般认为螺旋式搅拌器效果最优。
锚式搅拌器和螺旋搅拌器植物细胞培养反应器
吸筒式搅拌器和帆式搅拌器也常用于植物细胞的悬浮培养中， 其结构如下图所示。吸筒式搅拌器的结构原理在本章动物细胞培养 反应器中会有详细介绍，帆式搅拌器结构相对简单，由四片较大的 搅拌叶组成。这两种搅拌在使用时转速都不高，一般在30～80转/分。
吸管式搅拌器和帆式搅拌器
搅拌桨是用尼龙丝编织带制成帆形，搅拌轴用磁力驱动旋转， 转速为20~50r/min，氧气通过插入溶液中的硅胶管扩散到培养 液内，以维持培养液内一定的溶解氧水平。
带帆形搅拌器的连续灌注系统培养反应器
/sbs.asp?id=118
第
三
章
植物细胞和动物细胞 培 养 反 应 器
动植物细胞培养与微生物细胞培养有很大的不同。 动物细胞培养与微生物培养区别： • 动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固体或半固 体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、 葡萄糖或半乳糖外，还需有血清。动物细胞对环境敏感，包括pH、 溶氧、温度、剪切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监 测和控制。 植物细胞培养与微生物培养区别： • 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细胞培养一 般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养产物，以及植物细胞生 长较微生物要缓慢，长时间的培养对无菌要求及反应器的设计也提 出特殊的要求。
悬浮培养瓶
小规模悬浮培养
3、固定化培养：是指采用吸附（固体吸附剂）、共价贴附 （与固相载体结合）、共价交连（用试剂处理使细胞间形 成桥而絮结）、包埋（将细胞包埋在多孔材料内）等方法 将细胞固定在支持物上，或将细胞嵌入微囊或高分子聚合 物的网络中进行培养。该方法对贴壁依赖性细胞与非贴壁 依赖性细胞均适用。
六章动植物细胞培养装置和酶反应器-医学资料
动物细胞培养液中通常含有葡萄糖、氨 基酸、无机盐、维生素和动物血清等。培养的 动物细胞大都取自动物胚胎或出生不久的幼龄 动物的器官或组织，将组织取出来后，先用胰 蛋白酶等使组织分散成单个细胞，然后配制成 一定浓度的细胞悬浮液，再将该悬浮液放入培 养瓶中，在培养箱中培养，这个过程称为原代 培养。细胞在培养瓶中贴壁生长。随着细胞的 生长和增殖，培养瓶中的细胞越来越多，需要 定期地用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来， 配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的 培养瓶中培养，这称为传代培养。
一、动物细胞培养装置
动物细胞培养技术的应用是多方面的。许多有 重要价值的蛋白质生物制品，如病毒疫苗、干扰素、 单克隆抗体等，都可以借助于动物细胞的大规模培养 来生产。用取自烧伤病人皮肤的健康细胞进行培养， 可以获得大量自身的皮肤细胞，为大面积烧伤的病人 移植。培养的动物细胞还可以用于检测有毒物质。许 多致畸、致癌物质加入培养液后，培养细胞会发生染 色体结构和数目的变异。根据变异细胞占全部培养细 胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。现在动物细 胞培养已经成为检测有毒物质的快速而灵敏的有效手 段。医学家培养各种正常的或病变的细胞，用于生理、 病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理 论依据。
图6－5 动物细胞贴壁培养后的微载体显微镜照片
微载悬浮培养的反应器要解决的三个关键问题：
（1）具有合适的搅拌，使微载体在培养液 内悬浮循环流动，而又不因过高的剪切力而使 动物细胞受到破坏。
（2）不能像传统发酵罐那样用空气在培养液 内鼓泡充氧，而只能用特殊方式来传递氧，以 满足所需要的溶氧浓度。
（3）在培养液中要严格控制pH值，要求pH值 控制误差小于0.05。
叶的搅动作用，液体与微载体的悬浮液由圆筒
动物细胞大规模培养和专用生物反应器
贴壁培养细 胞转瓶机
细胞转瓶培养器
转瓶培养系统：
为最初采用系统;一般用 于小量培养到大规模培养的过 渡阶段;或作为生物反应器接 种细胞准备的一条途径 细胞 接种在旋转的圆筒形培养器— —转瓶中;培养过程中转瓶不 断旋转;使细胞交替接触培养 液和空气;从而提供较好的传 质和传热条件
转瓶机
转瓶培养的优 缺点
优点：
结构简单;投资少;技术成 熟;重复性好;放大只需简 单的增加转瓶数量等
缺点：
劳动强度大;占地空间大;单位体 积提供细胞生长的表面积小;细 胞生长密度低;培养时监测和控 制环境条件受到限制
二 悬浮培养suspension culture
指细胞在反应器中自由悬浮生长的过 程 主要用于非贴壁依赖型细胞培养;如杂 交瘤细胞等;是在微生物发酵的基础上发 展起来的
通过植物组织培养的药物：奎宁 长春碱 洋地黄 紫 草素 人参皂甙等
1
大 规2 模 动 物3 细 胞 培 养4 工 艺 流5 程 图
6
8 7
9
10 细胞培养反应器
诱生剂
细胞
提取 纯化
产品肿瘤抗原
提取 纯化 产品干扰素
细胞
浓缩纯化
产品单克隆抗体
大规模培养动物细胞的方法：
• 贴壁培养 • 悬浮培养 • 固定化培养
一 贴壁培养attachment culture
细胞贴附在一定的固相表面进行的培养
1 生长特性：贴壁依赖型细胞在 培养时要贴附于培养瓶器皿壁上;细 胞一经贴壁就迅速铺展;然后开始有 丝分裂;并很快进入对数生长期 一般 数天后就铺满培养表面;并形成致密 的细胞单层
贴壁培养细 胞转瓶机
2 贴壁培养的优点：
2 连续式培养的特点： ●细胞维持持续指数增长；
动物细胞培养生物反应器的操作模式
动物细胞培养生物反应器的操作模式米力第四军医大学细胞工程中心，国家863西安细胞工程基地陕西西安，710032动物细胞培养工艺的选择首先考虑的重要一点是该产品所涉及的生物反应器系统。
选择反应器系统也就是选择产品的操作模式，操作模式选择将决定该产品工艺的产物浓度、杂质量和形式、底物转换度、添加形式、产量和成本，工艺可靠性等。
与许多传统的化学工艺不同，动物细胞反应器设备占整个工艺资金总投入的主要部分（＞50%），也就是说动物细胞培养工艺的选择主要部分是生物反应器系统的选择。
选择反应器系统及培养工艺时，必须对工艺的整体性进行全面考虑，主要包括以下几个方面：细胞株及生长形式、产物表达量和稳定性，培养基质及代谢物，产物分离和纯化难度等。
动物细胞大规模培养的生物反应器操作模式，一般分为分批式操作（batch）、流加式操作（Fed-batch）、半连续式操作（semi-continuous）、连续式操作（continuous）和灌流式操作（perfusion）五种操作模式。
1. 批式操作（batch culture）批式操作是动物细胞规模培养发展进程中较早期采用的方式，也是其它操作方式的基础。
该方式采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。
该方式的特点:(1) 操作简单。
培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。
反应器系统属于封闭式，培养过程中与外部环境没有物料交换，除了控制温度、pH值和通气外，不进行其他任何控制，因此操作简单，容易掌握；(2)直观的反应细胞生长代谢的过程。
由于培养期间细胞的生长代谢是在一个相对固定的营养环境，不添加任何营养成分,因此可直观的反应细胞生长代谢的过程,是动物细胞工艺基础条件或"小试"研究常用的手段；(3)可直接放大。
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• ① 单管
• ② 环形管 • dI = 0.8Di • dI —环径 Di—浆叶直径
二 气升式生物反应器 (airlift bioreactor)
气升式生物反应器是应用较广泛的一类无机械搅拌的生物反 应器。气升式生物反应器是在鼓泡塔反应器的基础上发展 起来的，它是利用空气的喷射功能和流体重度差造成反应 液循环流动，来实现液体的搅拌、混合和氧传递。 气升式生物反应器结构简单，没有其他生物反应器具有的如 有较多泄漏点和死角等等缺点，故早在20世纪70年代开
• 它是借搅拌涡轮输入混合以及相际传质所需要的功率。这 种反应器的适应性最强，从牛顿型流体直到非牛顿型的丝 状菌发酵液，都能根据实际情况和需要，为之提供较高的 传质速率和必要的混合速度。 • 缺点是机械搅拌器的驱动功率较高，一般2~4kw/m3， 这对大型的反应器来说是个巨大负担。
结构
• 机械搅拌反应器的基本结构包括：筒体，机械搅 拌系统（搅拌器、挡板、轴封、联轴器及中间轴 承等），通气系统（空气分散装置），温控系统 （换热装置），消泡系统、pH控制系统等，并在 筒体的适当位置设置排气、取样、接种、进出料 口以及入孔和视镜等部件。
生物反应器类型
机械搅拌式反应器 气升式生物反应器 鼓泡塔生物反应器 膜生物反应器 动物生物反应器 植物生物反应器
一
机械搅拌式生物反应器
医药工业中的第一个大规模的微生物发酵过程青霉 素生产是在机械搅拌式反应器中进行的。且迄今为 止，对新的生物过程，首选的生物反应器仍然是机 械搅拌式反应器。机械搅拌式反应器能适用于大多 数生物过程，封
双端面机械密封
温控系统
• 小型的反应器多采用外部夹套作为冷却或加热 的换热装置。其优点是结构简单、加工容易、 反应器内无冷却装置、死角少、容易进行清洗 和灭菌工作；缺点是传热壁较厚、冷却水流速 低、降温效果差。 • 大型的反应器则多采用反应器内装有蛇形管换 热装置，优点是管内冷却水流速大、传热效率 高，但它需占用反应器空间，并给反应器清洗 和灭菌增加了难度。
通气系统
• 通气装置是指将无菌空气导入罐内的装置。最简单的通 气装置是一单孔管，单孔管的出口位于最下面的搅拌器 的正下方，开口向下，以免培养液中固体物质在开口处 堆积。管口与罐底的距离约为40mm。 • 第二种形式是开口向下的多孔环形管。环的直径约为搅 拌器直径的0.8倍。小孔直径约5~8mm，孔的总面积 约等于通风管的截面积。在通气量较小的情况下，气泡 的直径与空气喷口直径有关。喷口直径越小，气泡直径 越小，氧的传质系数越大。但在发酵过程中通气量较大 ，气泡直径仅与通气量有关而与通气出口直径无关。又 由于在强烈的机械搅拌的条件下，多孔分布器对氧的传 递效果并不比单孔管好，相反，还会造成不必要的压力 损失，且易使物料堵塞小孔，故已很少采用。
四
生物反应器的发展趋势
消泡系统
• 发酵过程中由于发酵液中含有大量的蛋白质，故在强烈的 通气搅拌下会产生大量的泡沫，严重时，将导致发酵液外 溢，增加染菌机会。在通气发酵生产中有两种消泡方法， 一是加入消泡剂，二是使用机械消泡装置。通常，是两种 方法联合使用。 • 消泡装置可分为两类：一类置于罐内，目的是防止泡沫外 溢，它是在搅拌轴或灌顶另外引入的轴（致搅拌轴由罐底 深入时）上装上消泡浆；另一类置于罐外，目的是从排出 的气体中分离出溢出的泡沫使之破碎后再将液体部分返回 罐内。
填料函式轴封
• 填料函式轴封是由填料 箱体，填料底衬套，填 料压盖和压紧螺栓等零 件构成，使旋转轴达到 密封的效果。
端面式轴封
• 又称机械轴封，可分为单端面机械密封和双端面 机械密封。密封作用是靠弹性元件（弹簧、波纹 管等）的压力使垂直于轴线的动环和静环光滑表 面紧密地相互贴合，并作相对转动而达到密封。
生物反应器（Bioreactor）
• 定义：是人们对生物有机体进行有控制的 培养以生产某种产品或进行特定的反应的 容器。
生物反应器是发酵工程中最重要的设备之一
原料 能量 原料制备 预处理 灭菌 能量 过程控制
生物 反应器
产品回收 废物
产物
空气
空压机 除菌
热量
• 20世纪80年代
• 生物反应器在专业期刊和书籍中大量出现，成为 一个标准名称 • 传统发酵罐 • 酶反应器等 • 固定化酶和细胞反应器 • 动植物细胞培养反应器
轴向式搅拌器
桨叶式
螺旋桨式
轴向式搅拌器特点
• • • • • • 结构简单 制造方便 整体混合效果较好 搅拌功率小 剪切力小 适用于低粘流体的搅拌
径向式（涡轮式）搅拌器
平直叶 弯叶 箭叶
径向式搅拌器特点
• • • •
功耗较大 局部混合效果较好 剪切力较大 适用于低粘度至高粘度流体的搅拌
2
挡板
• 挡板的作用是改变液流的方向，由径向流改为 轴向流，促使液体剧烈翻动，增加溶解氧。 • 通常，挡板宽度取(0.1~0.2)D（罐体直径） ，装设4~ 6块即可满足全挡板条件；挡板高 度应设计为自罐底到液面高度为止。 • 全挡板条件：是指在一定转数下再增加罐内挡 板数量而轴功率仍保持不变。
3
轴封
• 轴封的作用是使罐顶或罐底与轴之间的缝隙加以 密封，防止泄漏和污染杂菌。 • 常用的轴封有填料函和端面机械轴封两种。
始，植物细胞发酵培养就已经较多地采用气升式生物反应 器。
• 优点：气升式生物反应器的结构较简单，易于清 洗、维修，不易染菌，能耗低，溶氧效率高，操 作费用低。 • 缺点：缺点相对来说较少，主要是高密度培养时 混合不够均匀。
三
其他类型反应器
• 鼓泡塔生物反应器 • 膜生物反应器 • 固定床和流化床反应器 • 动物植物生物反应器 • 其他
• 反应器的结构
几何尺寸 H/D=1.7~4 d/D=1/2~1/3 W/D=1/8~1/12 B/D=0.8~1.0 (s/d)2=1.5~2.5 (s/d)3=1~2
1
搅拌器
• 搅拌器的作用是混合和传质，使空气与溶液均 匀接触，使氧溶解于发酵液中。 • 搅拌器有轴向式（桨叶式、螺旋桨式）和径向 式（平直叶式、弯叶式、箭叶式）两种。