动物细胞培养生物反应器
生物反应器培养动物细胞在病毒疫苗生产中的应用
生物反应器培养动物细胞在病毒疫苗生产中的应用摘要：病毒传染会对人们的生活造成重大影响，疫苗是控制传染的重要手段。
改进病毒规模化生产效率，优化疫苗生产工艺是病毒疫苗研制的关键环节。
目前，国内动物细胞制备病毒疫苗的操作方式逐渐从转瓶培养向生物反应器培养转变。
生物反应器培养动物细胞的常见方法有悬浮培养、微载体培养、片状载体培养等。
生物反应器培养动物细胞有很多优势，可扩大病毒产量，降低成本，易于获取稳定性强、免疫原性高的病毒，有助于机械化控制。
生物反应器有潮汐式生物反应器、一次性摇动式生物反应器、一次性填充床生物反应器、微小型生物反应器、新型固定床生物反应器，不同的反应器有不同的特点。
对生物反应器培养动物细胞技术在病毒疫苗生产应用领域的研究进行综述，为促进生物反应器的开发与研究提供参考。
关键词：生物反应器；培养动物细胞；病毒疫苗；生产应用引言由病毒引起的传染性疾病严重威胁人类的健康和生命，尤其是某些病毒感染引起的传染病传播速度快、致死率高，一旦暴发，将对社会造成不可估量的危害。
疫苗是预防传染性疾病最有效的手段之一，使得许多传染性疾病得到有效控制。
但是近几十年，一些致命的新发突发病毒的出现，短时间内难以控制。
疫苗以源于有关病原体或生物合成抗原为主要成分，其目的是激发免疫反应，以保护机体免受感染，例如天花病毒疫苗、脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗等，对于病毒性疾病的防治或消除具有十分重要的意义。
因此，如何制备具有高度特异性且高活性的新型疫苗就成了当前研究热点之一。
但是传统的疫苗策略，如灭活疫苗和减毒活疫苗，在某些长期慢性疾病或复发性感染的疾病上性能较差，这些疫苗不仅不能对患者提供持续有效的保护，甚至会引起严重不良反应。
此外，由于传统疫苗研发过程周期较长，难以在短期内有效应对埃博拉病毒、寨卡病毒和尼帕病毒等高致命病原体导致的暴发性大流行。
因此，研发新型疫苗来替代传统疫苗尤为重要。
1动物细胞培养技术动物细胞培养是指将动物活体体内取出的组织分散成单细胞悬液,然后置于类似于体内的生存环境中进行培养,使其生存、生长并维持其原有结构与功能的方法。
动物细胞培养生物反应器
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传统发酵罐
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酶反应器等
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固定化酶和细胞反应器
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动植物细胞培养反应器
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生物反应器类型
机械搅拌式反应器 气升式生物反应器 鼓泡塔生物反应器 膜生物反应器
动物生物反应器 植物生物反应器
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一 机械搅拌式生物反应器
医药工业中的第一个大规模的微生物发酵过程青霉 素生产是在机械搅拌式反应器中进行的。且迄今为 止，对新的生物过程，首选的生物反应器仍然是机 械搅拌式反应器。机械搅拌式反应器能适用于大多 数生物过程，是形成标准化的通用产品。
• 显然，反应器的增大有利于降低生产成本。
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2 动植物细胞培养反应器得到较大发展
• 由于动植物细胞培养可以得到很多高附加值生物 制品，如干扰素，单克隆抗体等，细胞培养反应 器的开发越来越受到重视。其中关于供氧问题， 快速升温、SIP自动灭菌、CIP自动清洗、机械 密封、排气处理、取样处理等问题等都需很好解 决。
混合不够均匀。
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三 其他类型反应器
• 鼓泡塔生物反应器 • 膜生物反应器 • 固定床和流化床反应器 • 动物植物生物反应器 • 其他
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四 生物反应器的发展趋势
• 生物反应器的研究、开发和设计是生物技 术的一个重要内容，一种好的生物反应器 出现往往能够大规模降低生产成本，成为 生物制品成功商业化的关键。因此，生物 反应器的开发一直很活跃，尤其是最近的 细胞生物反应器开发更是如此。生物反应 器的发展趋势可归纳为以下几个方面：
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• 反应器的结构
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几何尺寸
H/D=1.7~4 d/D=1/2~1/3 W/D=1/8~1/12 B/D=0.8~1.0 (s/d)2=1.5~2.5 (s/d)3=1~2
大学课件 生物工程设备 动物细胞培养反应器
• 动物细胞培养
典型过程培养
2、pH
大规模培养时影响培养液的pH稳定性的主要因 素有三种：
（1）缓冲液的缓冲能力及种类 （2）对流空间大小 （3）葡萄糖浓度 培养液中正常的缓冲系统是NaHCO3/CO2系统， 它是一种弱缓冲系统，其pK为6.1，低于生理学 最佳要求。这种缓冲系统要求在培养液上面的 对流空间加入CO2以防止它的丢失及增加羟基 离子。
• 动物细胞培养
典型过程培养
6、脂类和磷脂前体 在使用血清的细 胞培养中，脂类来自血清，在无血清培 养中，有些细胞需要添加脂类，如胆固 醇、脂肪酸、磷脂。特别是缺陷型细胞， 对某种脂类有很高的依赖性。
非营养性物质
1、抗生素 细胞培养中，特别是原代细胞培 养中，常使用抗生素抑制微生物的污染。
2、pH缓冲剂 最常用的缓冲剂是碳酸氢钠， 常用浓度26mmol/L，接近血中浓度，必须与 5％～10％CO2平衡，否则培养基迅速变碱。 HEPES是缓冲能力很强的化合物，但由于它 相当昂贵，细胞大规模培养中很少使用。
典型过程培养
悬浮培养
悬浮培养指细胞在培养容器中自由悬浮生 长的过程，主要用于非贴壁依赖性细胞的 培养，如杂交瘤细胞等。动物细胞悬浮培 养与微生物过程比较接近，但由于动物细 胞对搅拌和通气造成的流体剪切很敏感， 在反应器的设计和操作上又有特殊要求如 利用螺旋带叶轮减小生物反应器培养过程 中的剪切作用，并通过表面充气及诱导表 面气泡产生 具有双层滤网的新型搅拌器，它提高了氧 传递速率
典型过程培养
目前，动物细胞培养用生物反应器主要包括：转瓶培养 器、塑料袋增殖器、填充床反应器、多层板反应器、螺 旋膜反应器、管式螺旋反应器、陶质矩形通道蜂窝状反 应器、流化床反应器、中空纤维及其它膜式反应器、搅 拌反应器、气升式反应器等。
动物细胞生物反应器
大小 代谢调节方式 营养要求胞
10-100mm 内部和激素 苛刻 倍增时间一般为12-60h 很差，缺乏保护性细胞壁 差
微生物细胞
10mm 内部 宽松，可利用多种底物 倍增时间一般为0.5-2h 较好 好
（三）、動物細胞大规模培養技術
动物细胞大规模培 养它是在传统的培养技 术的基础上，融合固定 化细胞、流式细胞技术、 填充床、生物反应器技 术以及人工灌流和温和 搅拌技术等发展起来的。 动物细胞大规模培养装 置如图。
4.攪拌罐生物反應器（stirtank bioreactor）
搅拌罐生物反应器基本结构为：一个旋转过滤器， 一台用于控制温度、pH值、搅拌速度和溶氧（DO）的 数字控制装置（DCU）和起通气作用的底部环形喷气结 构。
5.堆積床生物反應器（packedbed bioreactor）
CelligenPlus堆积床生物反应器的工作原理为：当推 进器旋转时，培养基通过推进器的中心空管螺旋式地从 罐体底部上流，然后从三个出口流出，通过堆积床向下 流动至罐体底部，再通过推进器的中心管往上流。
3.微囊化培養技術
微囊是一种由半透膜制成的多孔微球体，酶及大分 子不能从微囊中溢出，而小分子物质可以通过，微囊化 技术是固定化技术将细胞包裹在微囊里，在培养液中悬 浮培养，细胞微囊化后由于生长在各自的微小环境里， 减少了培养时搅拌对细胞的剪切力，细胞生长良好，培 养液易于迅速改变，且无分离细胞与培养液的困难。
2.中空纖維管生物反應器（hollow-fiber bioreactor）
中空纤维管生物反应器主体是由微孔中空纤维管束 组成的，纤维束由外壳包裹，可分为壳体空间及管体空 间两部分，每部分各有其出口。
3.流化床生物反應器（fluidized-bed bioreactor）
微生物和动物细胞培养的反应器
支原体 衣原体 立克次氏体
微生物
真核类： 真菌
原生动物 显微藻类
非细胞类： 病毒
亚病毒 (类病毒 , 拟病毒 , 朊病毒 )
4.1.1 微生物反应器
发酵罐结构：罐体、搅拌装置、消 泡器、轴封、传动装置、传热装置 、挡板、人孔、视镜、通气装置、 进出料管、取样管等。
用直径为2.5mm的聚四氟乙烯中空 纤维管作为通气装置，空气在管内， 氧分子通过半透性的管壁扩散到培养 液中，供动物细胞生长。
4.1.2 动物细胞培养反应器
5L气腔式动物细胞培养反应器： 反应器内有一旋转圆筒，在圆筒上部有3~5个中空的导 向搅拌桨叶，在圆筒外壁用200目(75μm)不锈钢丝网焊 成一个环状气腔，气腔下面有一圈气体分布管。
4.1.2 动物细胞培养反应器
(2) 动物细胞贴壁培养反应器 大部分动物细胞必须附着在固体或半固体表面才能生长
，细胞在载体表面上生长并扩展成一个单层，又称 单层培养。
传统方法：滚瓶 用4~30L大小的成千 上万个滚瓶进行动 物细胞培养，来生 产疫苗。 比表面积小，0.35 手工操作
4.1.2 动物细胞培养反应器
4.1.4 国内外细胞培养反应器
B. Braun D300机械搅拌发酵罐， 200L
B. Braun 10L 气升发酵罐
4.1.4 国内外细胞培养反应器
NBS BIOFLO 110 机械搅拌 发酵罐，最大3m3
NBS 7L 发酵罐
4.1.4 国内外细胞培养反应器
韩国一投资2.5 亿美元的单克 隆抗体和重组 蛋白生产线
4.1.3 植物细胞培养反应器
机械搅拌反应器
《生物工程设备》第七章动物细胞生物反应器
动物细胞培养生物反应器随着基因工程的发展，通过动物细胞的培养所生产出多种疗效高的药物、灵敏的诊断试剂及生物技术制品，目前在这一方向上正发展成为一支高新技术产业。
由于动物细胞与微生物细胞有很大的差异，对体外培养有严格的要求，如动物细胞对剪切非常敏感，反应器的设计不能像微生物细胞那样高的剪切力，因此，传统的微生物细胞反应器应该经过改造才能适用动物生物反应器，根据动物细胞的特点，开发新型的生物反应器显得十分重要和迫切。
一、动物细胞培养过程（一）动物细胞培养概论动物细胞培养（cell culture）是从动物体内取出细胞并分散成单个细胞，模拟体内的生长环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使细胞在体外继续生存、生长、增殖并维持结构和功能的一门技术。
体外培养可分为原代培养（primary culture，亦称初代培养）和传代培养（subculture，亦称继代培养）。
原代培养是指从机体内取出的细胞进行初次培养的过程。
培养的细胞大约增殖10代左右称为原代细胞（primary cell）；从原代培养的细胞继续转接培养称为传代培养。
动物细胞体外培养的历史可追溯到1907年，美国生物学家哈里森Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基成功地在试管中培养了蛙胚神经组织达数周，并观察到细胞突起的生长过程，创立了体外组织培养法。
1923年，法国学者卡勒尔设计的卡氏培养瓶用于培养鸡胚的心肌组织取得成功，也使得多种动物组织培养获得成功。
20世纪80年代以来，随着基因工程技术和细胞融合技术的迅速发展，人们已经能够把特定的外源基因通过PCR扩增，并转染到动物细胞内，得到高质量的表达，由此可生产各种特殊的生物制品。
德国生物技术公司Hauser用一个含人的IFN-β基因的科斯质粒pCOSIFN-βNDA（36000碱基对）与质粒pHC792COS/tk+DNA（含有单疱疹病毒的tK基因）通过磷酸钙沉淀技术，共转移进入小鼠LK-细胞，从而得到含干扰素基因的能分泌干扰素的细胞克隆。
动物细胞大规模培养和专用生物反应器
贴壁培养细 胞转瓶机
细胞转瓶培养器
转瓶培养系统：
为最初采用系统;一般用 于小量培养到大规模培养的过 渡阶段;或作为生物反应器接 种细胞准备的一条途径 细胞 接种在旋转的圆筒形培养器— —转瓶中;培养过程中转瓶不 断旋转;使细胞交替接触培养 液和空气;从而提供较好的传 质和传热条件
转瓶机
转瓶培养的优 缺点
优点：
结构简单;投资少;技术成 熟;重复性好;放大只需简 单的增加转瓶数量等
缺点：
劳动强度大;占地空间大;单位体 积提供细胞生长的表面积小;细 胞生长密度低;培养时监测和控 制环境条件受到限制
二 悬浮培养suspension culture
指细胞在反应器中自由悬浮生长的过 程 主要用于非贴壁依赖型细胞培养;如杂 交瘤细胞等;是在微生物发酵的基础上发 展起来的
通过植物组织培养的药物：奎宁 长春碱 洋地黄 紫 草素 人参皂甙等
1
大 规2 模 动 物3 细 胞 培 养4 工 艺 流5 程 图
6
8 7
9
10 细胞培养反应器
诱生剂
细胞
提取 纯化
产品肿瘤抗原
提取 纯化 产品干扰素
细胞
浓缩纯化
产品单克隆抗体
大规模培养动物细胞的方法：
• 贴壁培养 • 悬浮培养 • 固定化培养
一 贴壁培养attachment culture
细胞贴附在一定的固相表面进行的培养
1 生长特性：贴壁依赖型细胞在 培养时要贴附于培养瓶器皿壁上;细 胞一经贴壁就迅速铺展;然后开始有 丝分裂;并很快进入对数生长期 一般 数天后就铺满培养表面;并形成致密 的细胞单层
贴壁培养细 胞转瓶机
2 贴壁培养的优点：
2 连续式培养的特点： ●细胞维持持续指数增长；
动物细胞生物反应器研究发展
动物细胞生物反应器研究发展摘要：现如今，随着社会经济的飞速发展，动物细胞培养在当今生物制品生产中已越来越重要，而动物细胞培养的最主要设备就是生物反应器。
生物反应器是利用酶或生物体(如微生物)所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统，是1种生物功能模拟机，是实现产品产业化的关键设备，是连接原料和产物的桥梁。
关键词：动物细胞；生物反应器；研究发展引言动物细胞生物反应器是模拟动物的体内环境并在体外进行生物培养的系统，它是一个集机械、流体、控制、生物等多学科的高新技术产品。
其控制的参数主要有温度、溶解氧（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄｏｘｙｇｅｎ，ＤＯ）、ｐＨ、流体动力学、营养物质、代谢产物的浓度等。
最终目的是为了达到细胞高密度增长，高效地产出具有医药价值的酶、单抗、疫苗等目标产物。
相比于传统的生物制品生产工艺，生产周期长、操作繁琐、工作量大、易污染等诸多缺陷，生物反应器系统具有更好的稳定性和安全性，大量节省劳动力、生产场地和能源消耗，降低生产成本，具有明显优势。
1生物反应器培养动物细胞的优势1.1扩大病毒产量生物反应器的推广能改变动物细胞的培养方式，在增加动物细胞密度的基础上，有效提高病毒滴度，利于扩大病毒产量。
PAＲK等在200L生物反应器中悬浮培养BHK-21细胞，第3天即得到每毫升7．65×106个细胞的活细胞密度。
该细胞为口蹄疫病毒疫苗制造的连续细胞系，充分提升了口蹄疫疫苗的生产潜力。
1.2降低成本生物反应器的推广推动了口服疫苗的进程，有利于在确定的培养条件下快速、重复性地展开生产，发挥更高的成本效益。
LESELLIEＲ等为降低英国牛结核病发病率，选择对携带传染源牛分枝杆菌的欧洲獾进行结核病的疫苗接种。
在广阔的地理范围内，采用口服方式能充分发挥疫苗的最佳疗效。
但口服减毒卡介苗的常规生产多基于液体培养基表面的薄膜生长，利用生物反应器开展培养，所得浓度能远远超过同条件下的薄膜生长，在简化制作工序的同时，更加强了操作的循环性，实现成本节约。
动物细胞培养生物反应器的操作模式
动物细胞培养生物反应器的操作模式(总7页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--动物细胞培养生物反应器的操作模式米力第四军医大学细胞工程中心，国家863西安细胞工程基地陕西西安，710032动物细胞培养工艺的选择首先考虑的重要一点是该产品所涉及的生物反应器系统。
选择反应器系统也就是选择产品的操作模式，操作模式选择将决定该产品工艺的产物浓度、杂质量和形式、底物转换度、添加形式、产量和成本，工艺可靠性等。
与许多传统的化学工艺不同，动物细胞反应器设备占整个工艺资金总投入的主要部分（＞50%），也就是说动物细胞培养工艺的选择主要部分是生物反应器系统的选择。
选择反应器系统及培养工艺时，必须对工艺的整体性进行全面考虑，主要包括以下几个方面：细胞株及生长形式、产物表达量和稳定性，培养基质及代谢物，产物分离和纯化难度等。
动物细胞大规模培养的生物反应器操作模式，一般分为分批式操作（batch）、流加式操作（Fed-batch）、半连续式操作（semi-continuous）、连续式操作（continuous）和灌流式操作（perfusion）五种操作模式。
1. 批式操作（batch culture）批式操作是动物细胞规模培养发展进程中较早期采用的方式，也是其它操作方式的基础。
该方式采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。
该方式的特点:(1) 操作简单。
培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。
反应器系统属于封闭式，培养过程中与外部环境没有物料交换，除了控制温度、pH值和通气外，不进行其他任何控制，因此操作简单，容易掌握；(2)直观的反应细胞生长代谢的过程。
由于培养期间细胞的生长代谢是在一个相对固定的营养环境，不添加任何营养成分,因此可直观的反应细胞生长代谢的过程,是动物细胞工艺基础条件或"小试"研究常用的手段；(3)可直接放大。
动物细胞大规模培养用生物反应器(bioreactor)简介
动物细胞大规模培养用生物反应器（bioreactor）简介动物细胞培养技术能否大规模工业化、商业化，关键在于能否设计出合适的生物反应器（bioreactor）。
由于动物细胞与微生物细胞有很大差异，传统的微生物反应器显然不适用于动物细胞的大规模培养。
首先必须满足在低剪切力及良好的混合状态下，能够提供充足的氧以供细胞生长及细胞进行产物的合成。
一、生物反应器分类目前，动物细胞培养用生物反应器主要包括：转瓶培养器、塑料袋增殖器、填充床反应器、多层板反应器、螺旋膜反应器、管式螺旋反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器、流化床反应器、中空纤维及其它膜式反应器、搅拌反应器、气升式反应器等。
按其培养细胞的方式不同，这些反应可分为以下三类：1.悬浮培养用反应器：如搅拌反应器、中空纤维反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器、气升式反应器；2.贴壁培养用反应器：如搅拌反应器（微载体培养）、玻璃珠床反应器、中空纤维反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器；3.包埋培养用反应器：如流化床反应器、固化床反应器。
二、搅拌罐生长反应器这是最经典、最早被采用的一种生物反应器。
此类反应器与传统的微生物生物反应器类似，真对动物细胞培养的特点，采用了不同的搅拌器及通气方式。
通过搅拌器的作用使细胞和养分在培养液中均匀分布，使养分充分被细胞利用，并增大气液接触面，有利于氧的传递。
现已开发的有：笼式通气搅拌器、双层笼式通气搅拌器、桨式搅拌器、海般式搅拌器等。
三、气升式生物反应器1979年首次应用气升式生物反应器成功的进行了动物细胞的悬浮培养。
气升式生物反应器的话优点：罐内液体流动温和均匀，产生剪切力小，对细胞损伤较小；可直接喷射空气供氧，因而氧传递率较高；液体循环量大，细胞和养分都能均匀分布于培养液中；结构简单，利于密封并降低了造价。
常用的气升式反应器有三种：内循环式气升式、外循环式气升式、内外循环式气升式生物反应器。
动物细胞培养用生物反应器
能和经济性。 ¾ 管路布局合理、简洁，有效消除管路灭菌死角，并实现了管路在线灭菌
功能。反应器使用简单方便，灭菌效果可靠，为反应器无菌控制提供了 有效保障。 ¾ 搅拌系统采用先进的磁力搅拌器装置，代替传统的机械搅拌装置，由于 去除了机械密封，使反应器系统完全与外界隔绝，具有更优良的系统密 封性，保证了反应器长时间无菌运行安全性。同时由于去除机械密封， 易清洁，更符合医药行业要求。 ¾ 深层通气系统采用微泡发生器提供溶氧，气泡更小、更均匀，溶氧传递 效果良好，并且通过设计优化，减少气体使用的种类，使用方便。 ¾ 采用称重系统控制反应器料液体积，可实现灌流培养要求，操作简单可 靠。 ¾ 反应器灭菌使用蒸汽在线灭菌，自动化程度高，并可进行手动操作灭菌， 使用方便。
4
CLAVORUS TM
4.1 搅拌控制
搅拌组件采用底部磁力搅拌，磁力搅拌器与反应器形成一定夹角，带动料液 转动产生涡流，实现料液充分混合。磁力搅拌器采用无极变速，运行平稳。
4.2 温度控制
采用夹套对反应器进行温度控制。夹套系统配备蒸汽混合器和电加热器，蒸 汽混合器提高了反应器温度上升的速度，电加热器提高了反应器温度控制的灵敏 性和稳定性。反应器温度控制系统采用基于罐体温度、夹套温度的双温度 PID 控制方式，温度补偿功能使控温更加稳定。
4.3pH 控制
采用独立模块控制方式，PH 控制器单独设置。使用 PID 控制模式实现自动 控制，具有自适应 PID 控制调整功能，可自动设定最佳的 PID 参数。pH 控制与 二氧化碳通气控制阀，以及酸、碱蠕动泵相关联，通过控制二氧化碳、酸液、碱 液的开关，实现 pH 的自动控制。当 pH 低于设定值时，控制器启动碱液蠕动泵， 补碱提高 pH 至设定值；当 pH 高于设定值时，控制器启动二氧化碳气体电磁阀， 以及酸液蠕动泵，降低 pH 至设定值。二氧化碳流量可通过转子流量计调节，酸 液、碱液蠕动泵流量可通过泵调速阀进行调节，进一步提高了 pH 控制的灵敏度。
动物细胞用生物反应器
特性
反应器类型
气升式
通气搅拌式
中空纤维管式
无泡搅拌式
流化床式
培养方式
悬浮
悬浮
贴壁、结团
悬浮
贴壁、结团
细胞的剪切保护
较差
较高
稍底
较好
较高
较低
对细胞的检测和控制
直接
过程控制
容易
扩散限制
无
放大
容易
生产率
较底
下游处理
较难
二、动物细胞培养用生物反应器
（一）生物反应器的特点动物细胞生物反应器是动物细胞产品生产过程中把原料转化为产物的环节，是生化工艺过程的心脏。由于动物细胞与微生物细胞有很大的差异，对体外培养环境有严格的要求，如动物细胞没有细胞壁，非常脆弱，生长缓慢，对培养环境十分敏感。传统的微生物发酵用的反应器不能适用于动物细胞的大规模培养，因而对动物细胞培养用的反应器的设计和过程控制系统提出了特殊的要求。一般地说，一台生物反应器的设计必须满足如下要求。① 生物因素：必须有很好的生物相容性，能很好地模拟细胞在体内的生长环节。② 化学因素：必须提供足够的停留时间，完成所需要的转化度，符合过程反应动力学的要求。③ 传质因素：对非均相反应，反应过程往往可能被反应底物的扩散速率制约，而不是被反应动力学所控制，因此，必须满足物质传递的要求。④ 传热因素：有能力除去和加入反应过程的热量，无过热点。⑤ 安全因素：能有效地隔离有毒害的反应物和产物，有优良的防污染性能。⑥ 操作因素：便于操作和维修。
动物细胞培养用生物反应器及其力学环境
１ 引
言
动物细胞体外培养技术自建立以来， 为研究细 胞的形态、 结构、 功能及其遗传学特征， 揭示细胞生
长、 增殖与分化等生命科学领域的基础间题发挥了 重要作用。 随着动物细胞体外培养技术的发展及相 关产业的要求， 特别是随着组织工程的发展与应用， 传统的实验室常规培养显然不能满足这一要求， 动 物细胞的工业 大规模培养已 被提上日 ７ 动物细 程Ｕ 胞体外培养技术能否生产人类所需的具有重要价值 的生物活性组织或物质并走向 商业化道路， 关键之 一便是能否设计出合适的生物反应器。 近年来有关生物组织／ 细胞应力一生长关系的 研究表明［ｓ从器官、 Ｐ７ －， 组织到细胞、 细胞器等各个
的生物制品。然而动物细胞无细胞壁 ， 其机械强度 低， 细胞生长缓慢， 营养要求高， 生长条件不易控制，
由气升式生物反应器和沉淀罐（ｅ ｌｇ ｋ 组 Ｓｔｉ ｔ ） ｔ ａ ｎ ｎ 成； 灌注培养中， 细胞悬浮液在进入沉淀罐之前经过 冷却， 能有效防止细胞营养成分及供氧不足等问题，
有利于动物细胞高密度培养。
（ ｂ ｅ ｒｏ Ｂｏ ｅ ａｉ（ ｉｅｎ ， ｕ二 ｎ ｅｉ ， ｎｄ ６０６，ｈ ａ Ｉ ｔｙ ｉ ｃ ｎａ Ｅｇｎ ｒ ｇ Ｓ ｈ。 Ｕ ｉ ｒｔ Ｃｅ ｕ １０５Ｃｉ ） ｏ ｏ ｆ ｍ ｈ ｃ ｎ ｅ ｉ ｒ ｉ ｃ ｖｓ ｙ ｈｇ ｎ
Ａ ｓ ａｔ ｉ ａ ｏ ｓ ｅ ｅｉ ｄｒ ｇ ｉｏ ｍ ｌ ｃｌ ｒ． ｒｖ ｅ ａ ｐｒ ｉｅ ｗｈ Ｂｏｅ ｔ ｉａ ｄｖ ｅ ｉ ｉ ｖ ｒ ａｉａ ｃ ｌ ｔ ｅ Ｉｐｏｉ ｓ ａｐｏｒ ｔ ｇｏ ｔ ｂｔ ｃ ｒ ｃ ｒ ｋｙ ｃ ｕ ｎ ｎ ｒ ｔ ｎ ｅ ｕｕ ｌ ｔ ｄ ｎ ｐ ａ ｒ ｅｖ ｏｍ ｎ ｆ ｔｅ ｌ ｅａｌｇ ｍ ｐｏ ｆ ａ ａｄ ｏ ｅ ｆ ａ ｂ －ｒｄｃ． ｃ ａｉａ ｃｌ ａ ｎｉ ｎ ｅｔ ｈ ｃ ｓ ｎｂｎ ｔｅ ｔ ｒｌｅ ｔ ｎ ｂｃｍ ｔｅ ｌ ｐｏｕｔ Ｓ ｅ ｍ ｌ ｓ ｒ ｏ ｒ ｅ ， ｉ ｈ ｏ ｉｒ ｅ ｅ ｌ ｈ ｉ ｉ ｎ ｏ ｉ ｎ ｎ ｅ ｒ ｌ ｅ ｄ ｆ ｅｔ ｍ ｉｏｉ ｃｌ ｉ ｍ ｒｈｌ ｙ ｃｌ ｒ ｓｉ ｎｅｅ ， ｍ ｃａｉ ｌ ｕ ｔ ｎ ｅｅ， ｉｅ ｎ ｆ ｍｃ ｂ ｌ ｌ ｎ ｐｏ ｇ ， ｔ ｅ ｌ ｅｄｄ ａｄ ｅｈｎ ａ ｓｍ ｌ ｉ ｎ ｄｄ ｔｅ ｆｒ ｒ ｏ ｒ ａ ｅｓ ｏ ｏ ｕ ｕ ｋ ｌ ｎ ｃ ｔ ａｏ ｅ ｉ ｈ ｔ ｄ ｉ ａ ｍｃ ｂ ｌ ｒ ｃ ｒ ａ ｎｔ ｔ ｌｆ ｔ ｌ ｇ－ ａ ａｉａ ｃｌｃｌ ｒ ａｙ ｒ， ｍ ｎ ｎｗ ｒ ｉ ｎｌ ｒ ｉ ｂ ｅ ｔ ｓ ｏ ｓｉｂ ｏ ｈ ａ ｅ ｃｌ ｎ ｌ ｕ ｕｅ ｍ ｅ ａｄ ｙ ａｔ ｏ ｉｏ ａ ｉ ａ ｏ ｒ ｏ ｅ ｕ ａ ｅ ｅ ｓ ｅ ｍ ｅ ｒ ｒ ｌ ｔ ｎ ｏ ｎ ａ ｅ
动物细胞生物反应器的种类和特点
动物细胞生物反应器的种类和特点下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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生物工艺学第九章 动物细胞培养(细胞培养用生物反应器)
灭菌系统组装成为完整的动物细胞培养装置 CellCul-20反应器
3 中空纤维管生物反应器
原理：模拟细胞在体内生长的三维状态，利用 反应器内中空纤维的布置，提供细胞近似生理 条件的体外生长微环境，使细胞不断生长。
优点： ① 占地空间少； ② 细胞产量高，细胞密度可达109数量级； ③ 生产成本低，且细胞培养维持时间长，适用于
\开发新型无血清培养基。
长期分泌的细胞。
4 无泡搅拌反应器
一种装有膜搅拌器的生物反应器，采用多孔 的疏水性塑料管装配成通气搅拌桨，具有良 好的氧通透性。
由于这类反应器能提供动物细胞生长中所需 的容氧要求，产生的剪切力较小，以及在通 气中不产生泡沫，避免了在其他反应器中常 见的某些弱点，如泡沫等，已广泛用于实验 室研究、中试和工业生产。
（1）Spier笼式通气搅 拌生物反应器
※特点
¾可以避免在向培养基中通 气时气泡直接损伤细胞；
¾在采用微载体系培养时， 微载体不会被由于通气所产 生的泡沫囊夹在气液界面；
¾通过一个多孔的通气装置 在笼内通气以满足培养时溶 氧的需要。
（２）CelliGen笼式通气搅拌生物反应器
¾ CelliGen笼式通气搅拌生物反应器是Spier 笼式通气搅拌生物反应器的改进型。
特点：
1. 细胞密度大 2. 产物单位体积浓度高 3. 分离纯化操作经济简便 4. 抗体活性、纯度好
微载体培养系统
培养物的污染及防止
污染途径 ：
有以下5个污染途径。 1、空气：
空气流动性大，如果培养操作场地于外界隔离不 严格或消毒不充分，外界不洁空气很容易进入造 成污染。
因此，培养设施不能设在通风场所。无菌操作应 在净化台内进行，工作时要带口罩。
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• 首先，对反应器内的生物反应建立数学模型，获 得能够反映生物过程规律的较精确的表达式，然 后将该模型应用于反应器的设计和自动控制中， 从而优化反应器的结构和操作，比如温度、pH、 溶氧等的PID自动控制系统。
• 由于微生物可以悬浮培养，对搅拌的剪切力要求 不高，因此，微生物最有条件在大型甚至超大型 反应器内生长。目前，生产抗生素的发酵罐容积 已达到400m3，氨基酸的反应器达到300m3， 单细胞蛋白(SCP)的反应器达到2600m3，用 微生物处理废水的生物反应器甚至高达 27000m3. • 显然，反应器的增大有利于降低生产成本。
• ① 单管
• ② 环形管 • dI = 0.8Di • dI —环径 Di—浆叶直径
二 气升式生物反应器 (airlift bioreactor)
气升式生物反应器是应用较广泛的一类无机械搅拌的生物反 应器。气升式生物反应器是在鼓泡塔反应器的基础上发展 起来的，它是利用空气的喷射功能和流体重度差造成反应 液循环流动，来实现液体的搅拌、混合和氧传递。 气升式生物反应器结构简单，没有其他生物反应器具有的如 有较多泄漏点和死角等等缺点，故早在20世纪70年代开
始，植物细胞发酵培养就已经较多地采用气升式生物，易于清 洗、维修，不易染菌，能耗低，溶氧效率高，操 作费用低。 • 缺点：缺点相对来说较少，主要是高密度培养时 混合不够均匀。
三
其他类型反应器
• 鼓泡塔生物反应器 • 膜生物反应器 • 固定床和流化床反应器 • 动物植物生物反应器 • 其他
• 反应器的结构
几何尺寸 H/D=1.7~4 d/D=1/2~1/3 W/D=1/8~1/12 B/D=0.8~1.0 (s/d)2=1.5~2.5 (s/d)3=1~2
1
搅拌器
• 搅拌器的作用是混合和传质，使空气与溶液均 匀接触，使氧溶解于发酵液中。 • 搅拌器有轴向式（桨叶式、螺旋桨式）和径向 式（平直叶式、弯叶式、箭叶式）两种。
消泡系统
• 发酵过程中由于发酵液中含有大量的蛋白质，故在强烈的 通气搅拌下会产生大量的泡沫，严重时，将导致发酵液外 溢，增加染菌机会。在通气发酵生产中有两种消泡方法， 一是加入消泡剂，二是使用机械消泡装置。通常，是两种 方法联合使用。 • 消泡装置可分为两类：一类置于罐内，目的是防止泡沫外 溢，它是在搅拌轴或灌顶另外引入的轴（致搅拌轴由罐底 深入时）上装上消泡浆；另一类置于罐外，目的是从排出 的气体中分离出溢出的泡沫使之破碎后再将液体部分返回 罐内。
2
动植物细胞培养反应器得到较大发展
• 由于动植物细胞培养可以得到很多高附加值生物 制品，如干扰素，单克隆抗体等，细胞培养反应 器的开发越来越受到重视。其中关于供氧问题， 快速升温、SIP自动灭菌、CIP自动清洗、机械 密封、排气处理、取样处理等问题等都需很好解 决。
3
大量使用现代计算机技术进行生物反应 器的设计和开发
填料函式轴封
• 填料函式轴封是由填料 箱体，填料底衬套，填 料压盖和压紧螺栓等零 件构成，使旋转轴达到 密封的效果。
端面式轴封
• 又称机械轴封，可分为单端面机械密封和双端面 机械密封。密封作用是靠弹性元件（弹簧、波纹 管等）的压力使垂直于轴线的动环和静环光滑表 面紧密地相互贴合，并作相对转动而达到密封。
• 它是借搅拌涡轮输入混合以及相际传质所需要的功率。这 种反应器的适应性最强，从牛顿型流体直到非牛顿型的丝 状菌发酵液，都能根据实际情况和需要，为之提供较高的 传质速率和必要的混合速度。 • 缺点是机械搅拌器的驱动功率较高，一般2~4kw/m3， 这对大型的反应器来说是个巨大负担。
结构
• 机械搅拌反应器的基本结构包括：筒体，机械搅 拌系统（搅拌器、挡板、轴封、联轴器及中间轴 承等），通气系统（空气分散装置），温控系统 （换热装置），消泡系统、pH控制系统等，并在 筒体的适当位置设置排气、取样、接种、进出料 口以及入孔和视镜等部件。
• 挡板的作用是改变液流的方向，由径向流改为 轴向流，促使液体剧烈翻动，增加溶解氧。 • 通常，挡板宽度取(0.1~0.2)D（罐体直径） ，装设4~ 6块即可满足全挡板条件；挡板高 度应设计为自罐底到液面高度为止。 • 全挡板条件：是指在一定转数下再增加罐内挡 板数量而轴功率仍保持不变。
3
轴封
• 轴封的作用是使罐顶或罐底与轴之间的缝隙加以 密封，防止泄漏和污染杂菌。 • 常用的轴封有填料函和端面机械轴封两种。
生物反应器（Bioreactor）
• 定义：是人们对生物有机体进行有控制的 培养以生产某种产品或进行特定的反应的 容器。
生物反应器是发酵工程中最重要的设备之一
原料 能量 原料制备 预处理 灭菌 能量 过程控制
生物 反应器
产品回收 废物
产物
空气
空压机 除菌
热量
• 20世纪80年代
• 生物反应器在专业期刊和书籍中大量出现，成为 一个标准名称 • 传统发酵罐 • 酶反应器等 • 固定化酶和细胞反应器 • 动植物细胞培养反应器
生物反应器类型
机械搅拌式反应器 气升式生物反应器 鼓泡塔生物反应器 膜生物反应器 动物生物反应器 植物生物反应器
一
机械搅拌式生物反应器
医药工业中的第一个大规模的微生物发酵过程青霉 素生产是在机械搅拌式反应器中进行的。且迄今为 止，对新的生物过程，首选的生物反应器仍然是机 械搅拌式反应器。机械搅拌式反应器能适用于大多 数生物过程，是形成标准化的通用产品。
轴向式搅拌器
桨叶式
螺旋桨式
轴向式搅拌器特点
• • • • • • 结构简单 制造方便 整体混合效果较好 搅拌功率小 剪切力小 适用于低粘流体的搅拌
径向式（涡轮式）搅拌器
平直叶 弯叶 箭叶
径向式搅拌器特点
• • • •
功耗较大 局部混合效果较好 剪切力较大 适用于低粘度至高粘度流体的搅拌
2
挡板
单端面机械密封
双端面机械密封
温控系统
• 小型的反应器多采用外部夹套作为冷却或加热 的换热装置。其优点是结构简单、加工容易、 反应器内无冷却装置、死角少、容易进行清洗 和灭菌工作；缺点是传热壁较厚、冷却水流速 低、降温效果差。 • 大型的反应器则多采用反应器内装有蛇形管换 热装置，优点是管内冷却水流速大、传热效率 高，但它需占用反应器空间，并给反应器清洗 和灭菌增加了难度。
四
生物反应器的发展趋势
• 生物反应器的研究、开发和设计是生物技 术的一个重要内容，一种好的生物反应器 出现往往能够大规模降低生产成本，成为 生物制品成功商业化的关键。因此，生物 反应器的开发一直很活跃，尤其是最近的 细胞生物反应器开发更是如此。生物反应 器的发展趋势可归纳为以下几个方面：
1
微生物反应器朝着大型化发展
通气系统
• 通气装置是指将无菌空气导入罐内的装置。最简单的通 气装置是一单孔管，单孔管的出口位于最下面的搅拌器 的正下方，开口向下，以免培养液中固体物质在开口处 堆积。管口与罐底的距离约为40mm。 • 第二种形式是开口向下的多孔环形管。环的直径约为搅 拌器直径的0.8倍。小孔直径约5~8mm，孔的总面积 约等于通风管的截面积。在通气量较小的情况下，气泡 的直径与空气喷口直径有关。喷口直径越小，气泡直径 越小，氧的传质系数越大。但在发酵过程中通气量较大 ，气泡直径仅与通气量有关而与通气出口直径无关。又 由于在强烈的机械搅拌的条件下，多孔分布器对氧的传 递效果并不比单孔管好，相反，还会造成不必要的压力 损失，且易使物料堵塞小孔，故已很少采用。