植物组织培养项目三 无菌操作(接种)技术
实验室与基本操作(植物组织培养)
1 实验室与基本操作(植物组织培养)第一章实验室与基本操作第一节实验室及其基本设备实验室的大小取决于工作的目的和规模：1.以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产影响效率。
2.在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来设计避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。
植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。
要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。
实验室设计标准的组织培养实验室包括：洗涤室(准备室)；配置室；灭菌室；接种室；培养室；观察室等一、准备室作用：材料、培养器械的清洗、培养基准备、灭菌等的准备工作。
普通化学实验室：仪器及设备、化学药品。
纯水仪、冰箱、移液枪、过滤灭菌器、电炉、微波炉、磁力搅拌器、低速台式离心机、电脑等作用：配制培养基。
洗涤室：清洗、贮存器皿设施、鼓风干燥箱等。
作用：玻璃器皿、用具和培养材料的洗涤。
灭菌室：①高压蒸气灭菌装置：如立式、卧式和手提式灭菌器。
作用：培养基、器械、棉塞、无菌纸等灭菌消毒②细菌过滤器作用：进行植物材料分离接种的重要场所，需长期的无菌操作，对组织培养成功起关键作用。
试验设施；超净工作台；紫外灯；固定式和挪移式载物台；消毒器、广口瓶、酒精灯、酒精棉、机械支架；手术剪、解剖刀、解剖针、镊子等超净工作台(alaminarflowhood)工作原理:利用鼓风机驱动空气通过高效过滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。
净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。
作用：进行材料的培养的场所。
其大小、规模可根据工作性质设定。
以充分利用空间和节能为原则。
设备：可调控光、温、湿度等设备。
还有固定式培养架、转床、摇床。
合用于器官(芽、茎、花药等)、愈伤组织、细胞和原生质体的固体培养和液体培养。
作用：细胞学和组织学观察。
设备：需备有高倍显微镜、体视显微镜、倒置显微镜、各种相机、恒温箱、切片机、恒温水浴、滴瓶、染色缸、载玻片、盖玻片等。
第二章——植物组织培养实验室
D、金属用品洗涤
金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水 洗净），需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。
E、除菌过滤器
除菌过滤器用清水冲洗后，用洗液冲洗，再用清水冲洗，最后 用蒸馏水冲洗，晾干备用
（二）灭菌技术
1.灭菌工作是极其重要的。
首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴： 有菌：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、 超净工作台的台面，未处理的工具和手等。 无菌：高压高温处理（工具、器皿、培养基等）如：火烤后的物体；
（二）药品贮存和配制仪器设备
1.冰箱 • 作用：低温保存材料，存放药品、
培养基母液、激素、酶制剂。
2.天平
• 陈列于制备室中 • 作用：称取大量元素、微量元素、
酶制剂
3.酸度计
• 陈列于制备室中 • 作用：测定培养基及酶制剂的pH值
PHS-802中文台式酸度计
通用型或经济型酸度计
（三）观察分析仪器设备
5.摇床和旋转床
• 进行液体培养时用以改善气体状况
小型臭氧发生器
不锈钢蒸馏水器（单蒸水）
三、玻璃器皿及用具
（一）玻璃器皿 1.培养器皿 培养用的：试管、三角瓶、培养皿等 2.分注器 类型：注射器式分注器、漏斗式分注器、
量筒漏斗式分注器 3.其他玻璃仪器 烧杯、量筒、移液管、容量瓶、试剂瓶等
《植物组织培养技术》组培基本操作技术
《植物组织培养技术》组培基本操作技术模块介绍掌握组培基本操作技术是做好组织培养工作的前提和关键。
本模块介绍了培养基制备、无菌操作等组培基本操作技术，主要内容包括培养基的种类、成分、特点和配制技术，以及外植体处理、接种方法、无菌操作规程等理论知识和技术方法。
两个项目共设计6个工作任务，以工作任务为载体，开展项目实践活动，旨在培养学生无菌意识、团队精神和操作技能，使学生初步具备培养基制备工、接种工的基本素质与工作能力。
模块结构设计见表1。
表1 模块结构设计项目1 培养基制备一、学习目标（一）终极目标能够根据培养对象和培养目的准确配制培养基。
（二）促成目标1．准确识记组培药品及其作用；2．熟记植物激素的种类、生理作用、理化性质与配制要求；3．清楚常用基本培养基的种类与特点；4．掌握母液和培养基的配制目的与操作流程，能够熟练配制母液和培养基；5. 熟练使用相关设备与用具；6. 具备无菌意识，具有团队精神、创新意识和和责任心。
二、学习内容1．培养基的种类、特点与成分；2．激素种类、理化性质、生理作用与配制要求；3.母液配制目的与方法；4．培养基配制的目的与方法；5. 培养基灭菌方法。
三、知识点1．培养基的种类、特点与成分；2．母液配制目的与方法；3．培养基配制的目的与方法；4. 培养基灭菌方法。
四、技能点1.母液配制；2.培养基配制；3.培养基灭菌。
五、教学重点1.培养基的种类、成分与特点；2.激素种类、理化性质、生理作用；3.母液和培养基配制的目的与方法；4.培养基灭菌方法。
六、教学难点1.MS大量元素母液、激素母液和铁盐母液的配制；2.培养基配制操作的规范度和熟练度；3.影响培养基湿热灭菌效果的因素；4.培养基中加入活性炭、抗生素的作用；5.配制螯合铁的目的。
七、教学设计八、拓展学习1.MS干粉培养基；2.螯合剂与鳌合物；3.培养基保存；4.培养基不凝固的原因；5.无土栽培营养液与组培培养基的区别。
九、学习建议1.重视培养基制备。
植物组织培养技术
植物组织培养技术（国培）训练方案一、主要训练内容1. 组培实验室和组培工厂的设计；2. 母液的配制（大量元素、钙盐、微量元素、铁盐、有机物）3. 培养基的配制（配制流程、定容、调节PH 值、分装、封口、灭菌）；4. 外植体灭菌（取材与处理、灭菌）；5. 无菌接种技术；6. 液体培养技术;7. 常见问题的处理（诱导培养、分化、增殖培养、生根培养等出现问题与解决措施）；8. 驯化移栽技术。
二、训练时间安排7月18 日上午：1. 组织培养技术流程简介；2. 组培实验室和组培工厂的设计；3. 母液的配制；7月18 日下午：4. 培养基的配制；7月19 日上午：5. 外植体灭菌；7月19 日下午：6. 无菌接种技术；7月20 日上午：7. 液体培养技术;8. 常见问题的处理；7月20 下午：9. 驯化移栽技术。
三、主要训练内容要点（一）植物组织培养技术流程简介植物组织培养是指分离一个或数个体细胞或植物体的一部分在无菌条件下培养的技术。
通常我们所说的广义的组织培养，是指在无菌条件下，将离体的植物器官（根、茎、叶、花、果实等）、组织（形成层、花药组织、皮层、胚乳等）、细胞（体细胞和生殖细胞）以及原生质体（即外植体），培养在人工配制的培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其长成完整的植株。
狭义概念：指对植物体组织或由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养直至生成完整植株。
广义概念：无菌操作分离植物体一部分（即外植体）接种到培养基上，在人工条件下培养直至形成完整植株。
植物组织培养的理论基础是细胞全能性。
所谓细胞全能性是指一个完整的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息。
即：细胞具有形成完整植株的潜在能力，给其适宜的条件就能形成一个完整的植株。
特定条件：①不受母株控制的完整离体细胞；②特定的培养条件，包括营养、激素、光、温、气、湿等因子。
植物体愈伤组织再化完整植株 ------------------ 不定器官或体细胞胚1.选择要培养的植物，查找相关资料，制定培养方案；2•准备培养基以及相关器材、灭菌材料等；3. 外植体处理与灭菌---获得无菌材料；4. 初代培养（诱导培养）；5. 继代培养（增殖培养）或分化培养；6. 生根培养；7. 驯化移栽。
植物组织接种实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握植物组织培养的无菌操作技术。
2. 熟悉植物组织培养的基本原理和过程。
3. 通过实验，了解植物细胞脱分化、再分化以及器官形成的过程。
4. 培养实验操作能力和观察能力。
二、实验原理植物组织培养是利用植物细胞的全能性，通过特定的培养条件，使离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织，再分化为具有根、茎、叶等器官的完整植株。
该实验依据以下原理：1. 植物细胞的全能性：每个植物细胞都含有该植物的全套遗传信息，在一定条件下可以发育成一个完整的植株。
2. 脱分化：在适宜的培养条件下，已分化的细胞可以恢复分裂能力，形成无定形的愈伤组织。
3. 再分化：愈伤组织在适宜的激素和营养条件下，可以分化形成具有特定功能的器官。
三、实验材料与仪器材料：1. 植物外植体（如叶片、茎段、芽等）2. MS培养基母液3. 琼脂4. 灭菌水5. 70%酒精6. 碘伏7. 无菌操作台8. 显微镜9. 灭菌锅仪器：1. 离心机2. 高压蒸汽灭菌器3. 电子天平4. 移液器5. 培养皿6. 移植针四、实验步骤1. 外植体消毒：将植物外植体用70%酒精消毒30秒，然后用碘伏消毒1分钟，最后用无菌水冲洗3次。
2. 制备培养基：按照MS培养基配方配制母液，然后用琼脂制成固体培养基。
3. 接种：将消毒后的外植体切成小块，接种到固体培养基上。
4. 培养：将接种后的培养基放入培养箱中，培养条件为：温度25℃、光照12小时/天。
5. 观察：定期观察愈伤组织的形成和器官的分化情况。
五、实验结果与分析1. 愈伤组织形成：接种后3-5天，外植体表面出现白色愈伤组织。
2. 再分化：愈伤组织在培养过程中逐渐分化出根、茎、叶等器官。
3. 器官形成：经过一段时间培养，愈伤组织分化出完整的植株。
六、实验讨论1. 外植体消毒是植物组织培养成功的关键环节，消毒效果直接影响愈伤组织的形成和植株的再生。
2. 培养基的配方和培养条件对愈伤组织的形成和器官的分化有重要影响。
植物组织培养无菌操作技术
维普资讯
刀和镊 子 放入 酒 精瓶 中浸 泡 ， 烧后 再 接下 一 焰 ， 身 由里 向外旋 转 ２ 圈即可 （ ６ 、图 灼 瓶 ～３ 图 ａ
镊 子 始终 与 无菌 碟 呈 ４ 。以 下夹 角 ， 得大 干 ５ 不 ４ 。 ， ｑ 上的 杂菌 会掉入 无 菌碟 中８起 污 ５ 否贝 手 Ｉ 染 （ ８ 、图 ８ ） 图 ａ ｂ。
好、 微酸性至 中性的土壤 。 植株 发育
成熟后可 大量供 水 ，而在其他 时段 则应注意 适量供 水 。春 季采 用种子 繁殖 ， 冬季 贝 用压条法进行 繁殖。 ｌ Ｊ 其 主要品种有特洛 皮 、 红特洛皮 、 粉红
后 与培 养基 或 接 种用 具 一起 高压 灭 菌 。 工作 人
员的 头 发 、衣 服 、手 指 中都 有许 多杂 菌 ，为 此 要穿 上 工作 服 ， 上 帽 子 ， 必须 剪 除指 甲 ， 戴 也 先 用肥 皂 、再 用 ０ ｌ ． ％新 洁 尔灭 冼手 ， 种 操 作 ０ 接 前再 用 ７ ～７ ％酒精 擦 洗 。 作 人 员呼 吸所 产 ０ ５ 工 生 的污 染 ，主 要 是 接种 时 谈 话或 咳 嗽 所 引起 ， 因此 ，接种 时 禁 止谈 话并 应 戴上 口罩 。
图 ７ 夹苗姿势 ａ
图 ９ 瓶盖放 置 ａ
Байду номын сангаас
图 ５ 镊子和接种 刀架碟 子上
（） 无菌 分 化芽 瓶 口进行 火 焰 灭菌 左 ８对
手拇指 、食 指 、中指 、无 名指托 着 瓶 身 ，右 手 图 ７ 夹苗姿势 （ ｂ 错误 ） 拇 指 、中指托 着 瓶 盖 。 口倾 斜 对 着酒 精 灯火 瓶
瓶 ，否则 会 ｇ起 交 叉感 染 （ ３ 。 Ｉ 图 ）
（ 夹 无 菌 碟 并 小 心 放 到 酒 精 灯 右 前 方 ６） （ ４ 、图 ４ 、图 ４ ） 图 ａ ｂ ｃ。
植物组织培养实验室的组成、仪器设备及基本操作
3、不耐高温材料的灭菌：
采用过滤灭菌，如IAA、ZT、天然有机 添加物等。
4、外植体的表面灭菌：
采用70－75％乙醇（10-30秒）、有 效氯1％的次氯酸钠（5-30分钟）、0.1 －0.2%的氯化汞（2-15分钟）等杀菌剂 中加入几滴吐温－20或80（Tween－20 或80）效果较好。
（3）灼烧灭菌：接种时，解剖刀及镊子等浸入95％乙 醇，然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。
2、培养基灭菌：
采用高压蒸汽灭菌。120℃ 15－20 分钟。
培养基体积越大，灭菌时间越长。
高温高压灭菌对培养基成分的影响： a.pH值普遍下降。 b.产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发生化学反
应而产生混浊或沉淀。例如Ca+2与PO4-3化合，就会产生 磷酸钙沉淀。
166
MgSO4·7H2O
185
KH2PO4
400
(NH4)2SO4
463
KI
0.8
H3BO3
1.6
MnSO4·4H2O
4.4
ZnSO4·7H2O
1.5
组成成分 Na2－EDTA FeSO4·7H2O 蔗糖
pH
烟酸 盐酸吡哆醇 甘氨酸 盐酸硫铵
(mg/l) 37.3 27.8 50 5.8 0.5 0.5 2.0 1.0
大量元素中的氮通常采用硝态氮 或铵态氮，但铵态氮浓度过高会对 有些植物的培养物造成伤害，不适 宜使用过高的浓度，可以用谷氨酸、 丝氨酸等来代替。
2、微量元素：
植物组织的对其需要量极少，过多会产生毒害，如 造成蛋白质变性、酶失活,代谢障碍等。
各种微量元素均具有特定的生理功能，如硼与蛋白 质的合成及糖类的运输有关；铜能促进离体根的形成； 锰参与植物的光合作用和呼吸作用；钼为氮素代谢的 重要元素。
教案(无菌操作技术)
1．植物组织培养中，无菌操作技术包括灭菌、接种、培养和驯化四个环节。
2．接种程序包括（1）植物材料表面的消毒，（2）切割外植体，（3）将外植体移入培养基。
3．接种后材料的培养步骤可分为：（1）初代培养，（2）继代培养，（3）生根培养。
4．驯化时要注意培养基质的选择和温、光、水、肥、气的综合管理。
某某职业技术学院
教案
课程名称：
课程编号：
适用对象：ຫໍສະໝຸດ 任课教师：年 学期某某职业技术学院教案纸
第 教案
课题
组织培养的无菌操作技术
教学目标：含知识、能力和素质
了解外植体选择的时间、大小以及灭菌技术，外植体灭菌技术；掌握无菌操作技术，了解无菌培养过程以及培养过程中常见的问题。
教学重点
外植体选择、无菌操作技术
教学方法与资源
多媒体，讲授
教
学
过
程
设
计
导入新课：组织培养的操作过程是一项技术性很强的操作过程，从外植体选择、培养基的配制，以及接种、无菌培养等等都需要仔细认真的操作。
教学内容及时间：
一、外植体的选择（10分）
二、无菌操作技术（20分）
三、无菌培养（20分）
四、驯化与移栽（10分）
五、组织培养中常见的污染问题（20分）
教
学
反
思
课
后
作
业
1、外植体的选择有什么要求？
2、无菌操作有哪些方法？
3、简述植物组织培养中褐变发生的原因及其防止措施
植物组织培养技术
植物组织培养技术植物组织培养（Plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官（根、茎、叶、花等）、组织（如形成层、花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞），以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株，统称为植物组织培养。
植物组织培养的过程可概括为：外植体脱分化或完整植株胚状体茎尖、胚及子房等器官做外植体可不经脱分化直接形成试管苗。
植物组织培养技术是生物技术的重要组成部分，在生产实践及基因工程、遗传转化等研究中有重要应用前景。
植物脱毒及离体快繁，花药培养与单倍体育种、幼胚培养与试管受精，抗性突变体的筛选与体细胞无性系变异，植物产品的工厂化生产等方面的研究和应用，均必须借助植物组织培养技术的基本程序和方法。
通过本实验，要求同学掌握植物组织培养操作技术；了解外植体脱分化及再生的过程；理解植物细胞全能性。
一、试材与用具1．植物材料：花生、烟草、苹果、大白菜、玉米等。
2．实验室：准备室、接种室、培养室等。
3．仪器设备：高压灭菌锅（器）、光照培养箱、振荡培养箱、天秤、酸度计、超净工作台等。
4．器械及用具：镊子、手术刀、接种针、细菌过滤器、记号笔等。
5．玻动器皿：三角瓶、培养瓶、培养皿、量筒、容量瓶等。
二、方法步骤（一）培养基的制备1．母液的配制在植物组织培养中，不同的植物，不同的器官和组织，不同的研究目的，使用不同的培养基，培养基尽管千差万别，按其性质和含量来分主要由以下几部分组成：①无机营养，包括大量元素和微量元素；②有机物质；③铁盐；④碳水化合物；⑤天然复合物；⑥激素；⑦琼脂（固体培养基）；⑧其他添加物。
在培养基的配制中，对各组分的成分，常先要按其需用量扩大一定倍数，配制成母液（表2－1）。
配制母液时应注意以下两个方面：（1）配制大量元素母液时，为了避免产生沉淀，各种化学物质必须充分溶解后才能混合，同时混合时要注意先后顺序，把钙离子（Ca2+）、锰离子（Mn2+）、钡离子（Ba2+）和硫酸根（SO42-）、磷酸根（PO43-）错开，以免形成硫酸钙、磷酸钙等沉淀，并且各种成分要慢慢混合，边混合边搅拌。
植物组织培养室及培养用具的消毒与灭菌（3学时）
实验一植物组织培养室及培养用具的消毒与灭菌（3学时）一、目的要求1、通过实验，培养学生良好的卫生观念，确立组织培养的无菌意识；2、掌握组织培养室的消毒及灭菌方法。
3、掌握培养用具的干热灭菌的一般操作技术。
二、仪器与用具1、用具：喷雾器、工作服、口罩、手套等；2、药品：2%新洁尔灭，高锰酸钾，甲醛，70%酒精。
三、方法步骤（一）植物组织培养室的灭菌1、地面、墙壁和工作台的灭菌：用2%新洁尔灭喷雾。
（1）配方：取新洁尔灭原液20ml，加水980ml，配成2%新洁尔灭溶液。
（2）方法：将配好的2%新洁尔灭溶液倒入喷雾器内，进行均匀喷雾。
（3）注意事项：①墙壁、角落、地面喷雾要均匀，不要遗漏；②注意安全，在喷房顶时，要特别小心，防止药液雾滴掉入眼睛。
2、无菌室和培养室的灭菌：用甲醛和高锰酸钾熏蒸，1年中熏蒸1-2次。
（1）配方：每立方米空间用甲醛10ml加高锰酸钾5g的配比液熏蒸。
（2）方法：首先房子要密封。
然后在房子中间放一口缸或大烧杯，将称好的高锰酸钾放入缸内，再把已称量的甲醛溶液慢慢倒入缸内，完毕，人迅速离开，并关上门，密封3天。
（3）注意事项：①操作前要戴好口罩及手套；②倒入甲醛时要小心，因为甲醛遇到高锰酸钾会迅速沸腾，并产生大量烟雾。
操作时人要迅速避开烟雾；③3天后，打开房间，搬走费液缸；一周后，方可进入操作。
3、在已经熏蒸过的房间内，用70%酒精纱布擦洗培养架、工作台。
4、用紫外灯照射20—30min。
5、使用前，再用70%酒精喷雾，使空间灰尘落下。
（二）培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法）（1）洗涤：把组织培养基用的培养皿、三角瓶、试管等玻璃器皿进行彻底清洗。
自然晾干或烘箱干燥。
（2）包扎：用牛皮纸、报纸、纱布或锡箔纸把玻璃器皿和金属器械分别包扎好。
（3）装水：在高压灭菌锅内装入一定量的水（水要淹没电热丝）。
（切忌干烧！）（4）装物品：在灭菌锅内放入含培养基的培养瓶或三角瓶、装蒸馏水的玻璃瓶，以及包扎好的玻璃器皿和金属器械等。
植物组织培养实验中存在的问题及方法的改进
植物组织培养实验中存在的问题及方法的改进本文对植物组织培养实验过程中出现的问题进行分析并提出实验改进方法。
标签：植物组织培养实验改进植物组织培养在过去的40多年中得到迅速发展，已渗透到生物学科的各个领域，并广泛应用于农业、林业、工业和医药业，产生了巨大的经济效益和社会效益。
尤其是快繁技术和无毒苗培育技术，在农林业生产中具有重大的实践意义。
虽然植物组织培养的操作过程并不复杂，但在实验中常常会遇到一些问题，这些问题可能会导致实验的失败，给科研和生产造成损失。
因此，在植物组织培养实验中积累经验和熟练掌握无菌操作技术是非常重要的。
笔者根据多年从事教学实验，对植物组织培养实验过程中出现的问题进行分析并提出实验改进方法，既提高了工作效率，又能提高实验的成功率。
（一）培养基母液的配制MS培养基是组织培养中常用的培养基，也是植物组织培养实验过程中主要使用的培养基，下面以MS培养基为例，简述其母液配制过程中常出现的问题及改进方法。
1.大量元素母液配制。
大量元素中的Ca2+、SO42-和HPO42-容易生成CaSO4、CaHPO4沉淀。
改进的方法是把NH4NO3、KNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2·2H2O5种药品分别用蒸馏水溶解，按顺序依次混合，同时考虑到大量元素的溶解度和方便使用，通常配制成10倍的母液5000ml贮存在冰箱中，使用一个学期不会产生沉淀，例如配制1000ml培养基，只需取100ml大量元素母液。
2.微量元素母液配制。
在配制微量元素母液时常常出现加入钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）后，钼酸钠难溶解，即使通过加热也无法解决问题。
解决的方法是在室温下用蒸馏水分别溶解微量元素药品，然后再依次混合在一起放入冰箱保存，用前摇匀母液。
同时考虑到微量元素的用量极微，通常配制成100倍的母液1000ml例如配制1000ml培养基，只需用移液管取10ml微量元素母液。
植物组织培养的基本技术与设施
（三）几种外植体的灭菌方法
1、茎尖、茎段及叶片等的消毒 ➢消毒前要经自来水较长时间的冲洗。 ➢消毒时要用70%的酒精浸泡数秒，无菌水冲洗2～3次，然后用2%～ 10%的次氯酸钠溶液浸泡10～25min，若材料有茸毛最好在消毒液中 加入几滴吐温-80，或者用0.1％～0.2％升汞浸泡消毒5～10分钟消毒 后，用无菌水冲洗3次后方可接种。
➢入无菌室前，要洗手。l%新洁尔灭溶液内5分钟 ➢入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。 ➢操作前要用70%酒精擦洗手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准 讲话，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把 工具在火焰上消毒。 ➢必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖 前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖 上。
（二） 外植体灭菌的一般步骤
1．预处理，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将 准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材 料，其表面仍有很多细菌和真菌。
2．将植物组织块置于一个有丝盖的玻璃瓶中，注入75%的酒 精溶液埋没材料，浸泡10S左右。倒出酒精，用无菌水冲洗一次。
3. 将适当浓度的消毒液(0.1%升汞或2%次氯酸钠)(含有几滴活 化剂Tween20或Tween 80)，使材料完全浸没在消毒液中，盖 上盖，把玻璃瓶置入超净工作台灭菌一定时间。在灭菌期间须 把玻璃瓶摇动2～3次。 4．消毒处理后，将瓶盖打开，将消毒液倒出，注入适量的无 菌蒸馏水，再盖上盖，摇动数次，将水倒掉，重复3～4次。
行灭菌？ 5．离体培养的植物材料对光、温、湿度有何要求？
如何调控？ 6. 何谓玻璃化？何谓褐化？如何克服？
第二节 实验室的设计与设备
一、实验室设计
准备间、缓冲室、接种室、培养间 驯化室、温室
植物组织培养技术：3-任务三 植物组培快繁技术
已离体培养植株 （试管苗）
❖ 多数情况下，应尽量使用温室或人工气候室控制 培养的植物材料作为外植体来源，减少培养过程 中的微生物感染概率。同时，生长在控制条件下 的植物可以保持培养料间的一致性，提高实验的 可重复性，也便于培养技术的规范。
❖ 某些多年生植物或特殊材料，必须取自自然生长 的植物，就需要尽可能避免使用那些生长过于潮 湿和不洁净环境中的植物。对于培养过程中可能 出现内生菌污染的材料，应尽量取生长旺盛期的 生长点部位作为起始培养的材料。
任务四、植物脱毒技术
植物病毒对园艺植物的危害；脱毒技术； 脱毒苗鉴定；脱毒苗的保存和繁殖。
任务五、常见园艺植物的脱 毒与快速繁殖
马铃薯、苹果、草莓、兰花的脱毒快繁。
主要内容
1. 外植体选择与处理 2. 外植体培养 3. 试管苗驯化移栽 4. 快繁过程中出现的问题及解决办法
回顾知识点： ❖ 什么是外植体？
因此，外植体的采集尽量选用植物体最幼态的组织。
2、材料取材
(4)外植体的大小： 外植体越大，污染率越高，但也不能过小，越小成活率越 低。在通常情况下，叶片、花瓣等的面积约为5mm²，茎段 为0.5cm²，除非是用于去除病毒，否则不宜将外植体切得
过小。
一、外植体选择与处理
（二）外植体处理
1、外植体预处理 首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干 净，如用刷子刷洗。 把材料切割成适当大小，以能放入灭菌容器为宜。 置于自来水下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁轻度 为宜。细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。洗时可加入洗衣粉清洗， 然后用自来水清洗洗衣粉水。目的是去除轻度附着在植物表面的污 物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。最理想的清洗物 质是表面活性物质——吐温。
组织培养技术期末复习资料
组织培养技术期末复习资料1．目前植物组织培养的农业应用主要是种苗快速繁殖和无病毒苗生产。
2. 组织培养的理论依据是：植物细胞的全能性理论。
3植物组织培养的类型有：器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养、原生质体培养。
4. 1943年，white 提出了植物细胞“全能性”学说，并出版了《植物组织培养手册》，从而使植物组织培养成为一门新学科。
5. 组织培养实验室必要的设备有药品及仪器柜、无菌台、实验台、搁架（水槽）、培养架、消毒设备、接种器械、（冰箱、空调、排气扇、天平等）。
6. 接种室要求室内密封性好、长时间保持无菌，墙面密闭光滑，门为滑动拉门，并设置紫外线灭菌灯，防止出入时带进杂菌。
7. 紫外灯灭菌利用200~300波长左右的紫外光，他的灭菌强度弱，须离被灭菌物不超过1.2米。
8. 培养架一般长为1.2米，宽为0.5米（5层）。
9. 植物组织培养，从接种到商品苗可以分为五个阶段，他们是入选品种外植体的筛选和获取、外植体灭菌（接种）、初代培养、继代培养（继代扩繁）、诱导出芽生根、炼苗、驯化和包装。
二、名词解释1.植物组织培养：指使用无菌方法使植物的离体器官、细胞、原生质体等在人为提供的条件下进行培养，使其长成完整的植株。
2.细胞全能性：植物的大多数由核细胞在适当的条件下都能由单个细胞经过分裂、生长、分化在适宜条件下具有发育成完整植株的能力。
三、问答题1.根据你所学的知识和所查阅的文献，综述植物组织培养在生产上的应用，都有哪些成功的例子？答：自从Morell952年发现采用微茎尖培养方法可得到无病毒苗(virus free)后，微茎尖培养就成为解决病毒病危害的重要途径之一。
兰花、园林植物的生产。
2.你认为植物组织培养在当前的农业生产上有什么价值？为什么？答：价值：保持母本优良性状、实现脱毒和扩繁，培养高价植物和稀有植物。
提高农业生产经济效益。
植物组织培养可以人为控制，产量高，生长周期短，繁殖率高，管理方便，经济效率高。
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任务一 接种
学习目标
掌握接种（无菌操作）的概念； 了解接种前的准备工作； 掌握接种技术-横插法、竖插法。
一、接种的概念
将经过严格表面灭菌处理的植物材料在无菌的
条件下转放到培养基上的过程叫做接种。整个接 种过程均需境消毒
外植体处理
换衣服
擦拭双手
酒精擦拭双手
外植体处理及接种全过程
流水冲洗
70%酒精表面灭菌
1%升汞充分灭菌 无 菌 水 冲 洗
外植体接种
修剪外植体
三、接种
接种时既可采用横插法，也可采用竖插法。
思考题
1. 接种的概念？ 2. 接种前需做哪些准备工作？
3. 横插法与竖插法的区别在哪里？