【精品】仪器分析高效液相色谱法1课件
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【精品课件】高效液相色谱定性定量分析方法
• 标样的可靠性及其配制的准确度 • 色谱方法的可靠性 • 色谱泵的精确度（GPC的影响更大） • 进样器的准确度，进样技术
定量分析基本要求
• 要有纯物质做标准 • 被定量组分峰要与其他组分达到基线分离 • 符合定性参数要求 • 选择合适定量方法
定量分析基本公式
• 在某些限定条件下，被测组分的浓度与检测器的 响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度 与峰面积不成线性，分别取对数后呈线性。）
两谱联用技术
1 如果标准物质缺乏或难以获得；或由于结构、理 化性质相似，很多物质具有十分接近，甚至相同 的保留值，则保留值定性准确度存在疑问。
2 可以运用红外光谱、紫外光谱、核磁共振光谱和 质谱对化合物进行定性，目前两用技术有： HPLC-紫外光谱，HPLC-红外光谱，HPLC-MS, HPLC-NMR等。
高效液相色谱定性定量分析方法
色谱分析的目的：
对未知组分进行定性分析 对已知组分进行定量分析
根据色谱图上某个色谱峰的保留时间和该色谱峰 在检测器上的响应信号强度，对该谱峰进行初步定性 定量分析。
液相色谱定性分析 液相色谱定量分析 影响定量分析的因素
色谱峰的定性鉴别：
通过保留值（通常指保留时间）进行定性 需要制定保留时间误差范围
• 相关系数—用来表示线性关系的好坏程度；
• 相关系数越接近1，说明线性关系越好；
• 绘制标准工作曲线时一般选取3-6个不同浓度 的标准样品，相关系数起码应在0.95以上。
如达不到要求，可பைடு நூலகம்存在以下原因：
1 所选浓度范围使检测器的响应值超出了该检测器
2
响应值的线性范围；
2 实验数据的精密度太差，过于分散。
3 无论何种原因，都应重新绘制标准工作曲线 。
定量分析基本要求
• 要有纯物质做标准 • 被定量组分峰要与其他组分达到基线分离 • 符合定性参数要求 • 选择合适定量方法
定量分析基本公式
• 在某些限定条件下，被测组分的浓度与检测器的 响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度 与峰面积不成线性，分别取对数后呈线性。）
两谱联用技术
1 如果标准物质缺乏或难以获得；或由于结构、理 化性质相似，很多物质具有十分接近，甚至相同 的保留值，则保留值定性准确度存在疑问。
2 可以运用红外光谱、紫外光谱、核磁共振光谱和 质谱对化合物进行定性，目前两用技术有： HPLC-紫外光谱，HPLC-红外光谱，HPLC-MS, HPLC-NMR等。
高效液相色谱定性定量分析方法
色谱分析的目的：
对未知组分进行定性分析 对已知组分进行定量分析
根据色谱图上某个色谱峰的保留时间和该色谱峰 在检测器上的响应信号强度，对该谱峰进行初步定性 定量分析。
液相色谱定性分析 液相色谱定量分析 影响定量分析的因素
色谱峰的定性鉴别：
通过保留值（通常指保留时间）进行定性 需要制定保留时间误差范围
• 相关系数—用来表示线性关系的好坏程度；
• 相关系数越接近1，说明线性关系越好；
• 绘制标准工作曲线时一般选取3-6个不同浓度 的标准样品，相关系数起码应在0.95以上。
如达不到要求，可பைடு நூலகம்存在以下原因：
1 所选浓度范围使检测器的响应值超出了该检测器
2
响应值的线性范围；
2 实验数据的精密度太差，过于分散。
3 无论何种原因，都应重新绘制标准工作曲线 。
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
waters-e高效液相色谱ppt课件
4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用甲醇水溶液冲洗。 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水冲洗及
保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。 。 6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。 7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯
化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。
注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形 成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。
高 检将效测电器信液连号相接转计换色算为谱机色数谱如据图站 ，何在，工显高示效作屏液上相展色现谱出系来统。单元先记录电信号，再
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
泵输液 进样
分离
检测器
检测
AB C
DE
G
F
记录
液 液相相流色色动谱谱相实：的验种所类各需及的部配基比分本，参示等数度-意-或亦梯图称度色谱条件
固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
四元梯度洗脱的溶剂输送动进样系统 柱温箱 液晶显示器 内置的柱塞杆密封垫清洗系统 溶剂瓶托盘 键盘用户界面及软盘驱动器
打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测
2器开、机计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自
检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。
溶 流【剂动M管相en理脱u/气系St确a统tu认s的所】有，准溶进备剂入管“路St都at充us满（溶1 剂），”按屏幕
保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。 。 6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。 7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯
化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。
注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形 成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。
高 检将效测电器信液连号相接转计换色算为谱机色数谱如据图站 ，何在，工显高示效作屏液上相展色现谱出系来统。单元先记录电信号，再
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
泵输液 进样
分离
检测器
检测
AB C
DE
G
F
记录
液 液相相流色色动谱谱相实：的验种所类各需及的部配基比分本，参示等数度-意-或亦梯图称度色谱条件
固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
四元梯度洗脱的溶剂输送动进样系统 柱温箱 液晶显示器 内置的柱塞杆密封垫清洗系统 溶剂瓶托盘 键盘用户界面及软盘驱动器
打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测
2器开、机计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自
检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。
溶 流【剂动M管相en理脱u/气系St确a统tu认s的所】有，准溶进备剂入管“路St都at充us满（溶1 剂），”按屏幕
仪器分析 高效液相色谱法
第17章HPLC法17.1 内容提要17.1.1 基本概念高效液相色谱法──在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。
高效液相色谱仪──采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。
梯度洗脱──用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。
也称为梯度淋洗。
低压梯度──又称外梯度，特点是先混合后加压。
它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。
高压梯度──又称内梯度，特点是先加压后混合。
它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。
两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。
柱外效应──由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。
柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。
液固吸附色谱法──以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附性。
K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。
液液分配色谱法──根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。
分配系数较大的组分保留值也较大。
正相分配色谱法──流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。
反相分配色谱法──流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。
化学键合相──利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。
仪器分析-高效液相色谱法
提高检测灵敏度。
流动相的选择与制备
选择合适的流动相
根据被分析化合物的性质， 选择适当的流动相，如有 机溶剂、缓冲液等。
流动相的配制
按照实验要求，准确称量 流动相组分，混合均匀， 并进行过滤和脱气处理。
流动相的梯度洗脱
对于多组分分离，可以采 用梯度洗脱技术，以提高 分离效果。
仪器的开机与平衡
开机
按照仪器说明书，打开仪器电源， 启动仪器操作系统。
药物制剂质量控制
高效液相色谱法可以用于药物制剂的质量控制， 检测制剂中药物的含量、纯度和稳定性等指标。
环境样品分析中的应用
污染物检测
高效液相色谱法可以用 于检测环境中的有机污 染物，如农药、多环芳 烃等，为环境污染控制 和治理提供依据。
饮用水质量检测
通过高效液相色谱法可 以检测饮用水中的有害 物质，如消毒副产物、 微量有机物等，保障公 众的饮用水安全。
粒径
色谱柱的粒径影响分离效 果和分离时间。粒径越小， 分离效果越好，但分离时 间越长。
长度
色谱柱的长度影响分离效 果和载样量。长度越长， 分离效果越好，但载样量 越小。
检测器
类型
常用的检测器有紫外-可见光检测器、荧 光检测器、电导检测器等，根据被测物质 的性质和检测需求选择合适的检测器。
响应速度
线性范围
质。
测定水体、土壤、空气 中的污染物和有害物质。
用于蛋白质、核酸、细 胞等生物大分子的分离
和检测。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择 性、应用范围广。
局限性
需要专业操作人员、仪器昂贵、 样品前处理复杂、耗时长。
02 高效液相色谱法的仪器构成
CHAPTER
流动相的选择与制备
选择合适的流动相
根据被分析化合物的性质， 选择适当的流动相，如有 机溶剂、缓冲液等。
流动相的配制
按照实验要求，准确称量 流动相组分，混合均匀， 并进行过滤和脱气处理。
流动相的梯度洗脱
对于多组分分离，可以采 用梯度洗脱技术，以提高 分离效果。
仪器的开机与平衡
开机
按照仪器说明书，打开仪器电源， 启动仪器操作系统。
药物制剂质量控制
高效液相色谱法可以用于药物制剂的质量控制， 检测制剂中药物的含量、纯度和稳定性等指标。
环境样品分析中的应用
污染物检测
高效液相色谱法可以用 于检测环境中的有机污 染物，如农药、多环芳 烃等，为环境污染控制 和治理提供依据。
饮用水质量检测
通过高效液相色谱法可 以检测饮用水中的有害 物质，如消毒副产物、 微量有机物等，保障公 众的饮用水安全。
粒径
色谱柱的粒径影响分离效 果和分离时间。粒径越小， 分离效果越好，但分离时 间越长。
长度
色谱柱的长度影响分离效 果和载样量。长度越长， 分离效果越好，但载样量 越小。
检测器
类型
常用的检测器有紫外-可见光检测器、荧 光检测器、电导检测器等，根据被测物质 的性质和检测需求选择合适的检测器。
响应速度
线性范围
质。
测定水体、土壤、空气 中的污染物和有害物质。
用于蛋白质、核酸、细 胞等生物大分子的分离
和检测。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择 性、应用范围广。
局限性
需要专业操作人员、仪器昂贵、 样品前处理复杂、耗时长。
02 高效液相色谱法的仪器构成
CHAPTER
高效液相色谱分析法(仪器+组成+分离类型+流动相选择)
1、流 程
2、主 要 部 件
(1) 高压输液泵
主要部件之一，压力：30MPa以上。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ <10μm），液体的流动相高速通过时，将产生 很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱 的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、 流量稳定可调、耐腐蚀等特性
(2)梯度淋洗装置
3.离子交换色谱分离固定相
结构类别： （1）薄壳型离子交换树脂
薄壳玻璃珠为担体，表 面涂约1%的离子交换树脂； （2）离子交换键合固定相
薄壳键合型；微粒硅胶 键合型（键合离子交换基团）
树脂类别： （1） 阳离子交换树脂（强酸 性、弱酸性） （2） 阴离子交换树脂（强碱 性、弱碱性）
4. 空间排阻分离固定相
liquid-solid adsorption chromatography 固定相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝等，较
常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：利用溶质分子占据固定相表面吸 附活性中心能力的差异；适用于分离相对分子 质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合 物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
GC：H = A + B / u + C • u （填充柱）
A = 2λ • dp
A ∝ λ • dp
B = 2γ • Dm = 2γ • Dg B ∝ t R ，B ∝ Dg
Dg
∝
T η
或Dg
∝
T M
B = 2γ • Dm
Dm
∝
T η
柱温T ↓低，流动相η ↑大 ⇒B相忽略
在高效液相色谱中, 液体的扩散系数
(4) 高效分离柱
2、主 要 部 件
(1) 高压输液泵
主要部件之一，压力：30MPa以上。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ <10μm），液体的流动相高速通过时，将产生 很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱 的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、 流量稳定可调、耐腐蚀等特性
(2)梯度淋洗装置
3.离子交换色谱分离固定相
结构类别： （1）薄壳型离子交换树脂
薄壳玻璃珠为担体，表 面涂约1%的离子交换树脂； （2）离子交换键合固定相
薄壳键合型；微粒硅胶 键合型（键合离子交换基团）
树脂类别： （1） 阳离子交换树脂（强酸 性、弱酸性） （2） 阴离子交换树脂（强碱 性、弱碱性）
4. 空间排阻分离固定相
liquid-solid adsorption chromatography 固定相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝等，较
常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：利用溶质分子占据固定相表面吸 附活性中心能力的差异；适用于分离相对分子 质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合 物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
GC：H = A + B / u + C • u （填充柱）
A = 2λ • dp
A ∝ λ • dp
B = 2γ • Dm = 2γ • Dg B ∝ t R ，B ∝ Dg
Dg
∝
T η
或Dg
∝
T M
B = 2γ • Dm
Dm
∝
T η
柱温T ↓低，流动相η ↑大 ⇒B相忽略
在高效液相色谱中, 液体的扩散系数
(4) 高效分离柱
《环境仪器分析》第九章 高效液相色谱法
• 分离对象：用于分离多环芳烃等低极性化合物； • 若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液为流动 相，可用于分离极性化合物； • 若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，可分离一 些易解离的样品，如：有机酸、有机碱、酚类等。 • 反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色 谱峰的优点。
2019/10/31
东华大学Hale Waihona Puke 相表面存在的某种特异性亲和
力，进行选择性分离。
先在载体表面键合上一种
具有一般反应性能的所谓间隔
臂(环氧、联胺等)，再连接上配
基(酶、抗原等)，这种固载化的
配基将只能和具有亲和力特性
吸附的生物大分子作用而被保
留，没有这种作用的分子不被保留。
2019/10/31
东华大学
六、亲和色谱（Affinitychromatograph）
定相上的吸附作用不同来进行分离。 固 定 相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、硅
-镁吸附剂等，较常使用的是5～10μ m的硅胶吸附剂。 在高效液相色谱法中，表面多孔型或全多孔型都可作吸附色谱
中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小、孔穴浅等优点，能极 大提高柱效。
但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全多 孔型微粒填料。
• 选择溶剂还必须与检测器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、 甲苯、氯仿、二甲基酰胺和水等。
• 分离对象：以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品， 以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。
2019/10/31
东华大学
六、亲和色谱（Affinity chromatograph）
原理：利用生物大分子和固定
（2）气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力， 即不产生作用力，仅起到载气作用。而HPLC流动相可选用不 同极性的液体，对组分产生作用力，流动相对分离起很大作用。
2019/10/31
东华大学Hale Waihona Puke 相表面存在的某种特异性亲和
力，进行选择性分离。
先在载体表面键合上一种
具有一般反应性能的所谓间隔
臂(环氧、联胺等)，再连接上配
基(酶、抗原等)，这种固载化的
配基将只能和具有亲和力特性
吸附的生物大分子作用而被保
留，没有这种作用的分子不被保留。
2019/10/31
东华大学
六、亲和色谱（Affinitychromatograph）
定相上的吸附作用不同来进行分离。 固 定 相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、硅
-镁吸附剂等，较常使用的是5～10μ m的硅胶吸附剂。 在高效液相色谱法中，表面多孔型或全多孔型都可作吸附色谱
中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小、孔穴浅等优点，能极 大提高柱效。
但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全多 孔型微粒填料。
• 选择溶剂还必须与检测器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、 甲苯、氯仿、二甲基酰胺和水等。
• 分离对象：以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品， 以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。
2019/10/31
东华大学
六、亲和色谱（Affinity chromatograph）
原理：利用生物大分子和固定
（2）气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力， 即不产生作用力，仅起到载气作用。而HPLC流动相可选用不 同极性的液体，对组分产生作用力，流动相对分离起很大作用。
仪器分析高效液相色谱法
详细描述
离子交换色谱法适用于分离离子化合物，如氨基酸、核酸等。在分离过程中，离子交换剂对不同离子的亲和力不 同，通过改变流动相的离子强度和种类，可以实现对不同离子的分离。
体积排阻色谱法
总结词
利用固定相孔径大小排除不同大小的分子进行分离。
详细描述
体积排阻色谱法适用于分离大分子物质，如蛋白质、多糖等。在分离过程中，固定相的孔径大小不同 ，能够排除不同大小的分子，从而实现分离。该方法具有较高的分辨率和分离效果。
检测
通过检测器对分离后的组分进 行检测，记录数据并进行后续
分析。
03
高效液相色谱法的分离模式
正相色谱法
总结词
利用极性固定相吸附剂，对极性物质的吸附作用进行分离。
详细描述
正相色谱法适用于分离极性物质，如醇、胺、水溶性氨基酸 等。在分离过程中，固定相的极性大于流动相的极性，极性 物质在固定相上的吸附力较强，因此能够得到较好的分离效 果。
金属、霉菌毒素等，保障食品安全。
生物医学研究中的应用
生物分子分离纯化
高效液相色谱法可用于分离和纯化生物分子，如蛋白质、核酸等， 为生物医学研究提供高质量的样品。
药物代谢和药代动力学研究
通过高效液相色谱法检测药物在体内的浓度和代谢产物，有助于了 解药物的作用机制和代谢途径。
临床诊断和生物标志物分析
高效液相色谱法能够检测生物体中的生物标志物，如氨基酸、脂肪 酸、激素等，为临床诊断和疾病研究提供重要信息。
食品分析中的应用
食品添加剂分析
01
高效液相色谱法可用于检测食品中的添加剂，如防腐剂、色素、
甜味剂等，确保食品质量和安全。
营养成分分析
02
通过高效液相色谱法测定食品中的维生素、矿物质和其他营养
离子交换色谱法适用于分离离子化合物，如氨基酸、核酸等。在分离过程中，离子交换剂对不同离子的亲和力不 同，通过改变流动相的离子强度和种类，可以实现对不同离子的分离。
体积排阻色谱法
总结词
利用固定相孔径大小排除不同大小的分子进行分离。
详细描述
体积排阻色谱法适用于分离大分子物质，如蛋白质、多糖等。在分离过程中，固定相的孔径大小不同 ，能够排除不同大小的分子，从而实现分离。该方法具有较高的分辨率和分离效果。
检测
通过检测器对分离后的组分进 行检测，记录数据并进行后续
分析。
03
高效液相色谱法的分离模式
正相色谱法
总结词
利用极性固定相吸附剂，对极性物质的吸附作用进行分离。
详细描述
正相色谱法适用于分离极性物质，如醇、胺、水溶性氨基酸 等。在分离过程中，固定相的极性大于流动相的极性，极性 物质在固定相上的吸附力较强，因此能够得到较好的分离效 果。
金属、霉菌毒素等，保障食品安全。
生物医学研究中的应用
生物分子分离纯化
高效液相色谱法可用于分离和纯化生物分子，如蛋白质、核酸等， 为生物医学研究提供高质量的样品。
药物代谢和药代动力学研究
通过高效液相色谱法检测药物在体内的浓度和代谢产物，有助于了 解药物的作用机制和代谢途径。
临床诊断和生物标志物分析
高效液相色谱法能够检测生物体中的生物标志物，如氨基酸、脂肪 酸、激素等，为临床诊断和疾病研究提供重要信息。
食品分析中的应用
食品添加剂分析
01
高效液相色谱法可用于检测食品中的添加剂，如防腐剂、色素、
甜味剂等，确保食品质量和安全。
营养成分分析
02
通过高效液相色谱法测定食品中的维生素、矿物质和其他营养
仪器分析 第7章 高效液相色谱法
由非极性固定相和极性流动相所组成的 液相色谱体系，与正相 HPLC 体系正好相反。 其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶 (ODS 柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。 是当今液相色谱的最主要分离模式。
液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到流 动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。 后来发展起来的键合固定相以化学键合的方法 将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解 到流动相中去了。
(3)工作温度： 气相色谱一般都在较高温度下进行的，而 高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。
高效液相色谱法主要类型
类 型 液固吸附色谱 主要分离机理 吸附能，氢键 主要分析对象或应用领域 异构体分离、族分离，制备
液液分配色谱 凝胶色谱 离子交换色谱
手性色谱 亲和色谱
疏水分配作用 溶质分子大小 库仑力
由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而 被非极性固定相（有机相）提取。组分离 子的性质不同，它与反离子形成离子对的 能力大小不同以及形成的离子对疏水性质 不同，导致各组分离子在固定相中滞留时 间不同，因而出峰先后不同。
B. 键合相反相离子对色谱法
离子对色谱法类型很多，根据流动相和 固定相的极性可分为反相离子对和正相离子 对色谱法。其中以键合相离子对色谱法最重 要。这种色谱法的固定相采用非极性的疏水 键合相［如十八烷基键合相（ ODS ）等］， 流动相为加有平衡离子（反离子）的极性溶 液（如甲醇—水或乙睛—水）。
抑制柱离子色谱的原理：
以阴离子分析为例：
分析柱反应：
R—Cl + NaOH R—OH + NaCl
抑制柱反应： + NaOH
R—Na + H2O
以阳离子分析为例：
仪器分析—高效液相色谱法
仪器分析—高效液相色谱法高效液相色谱（HPLC）是一种分离和定量化学物质的分析技术。
它广泛应用于生物医药、食品安全、环境监测等领域。
HPLC的原理基于样品在流动相中的分配行为，通过调节流动相成分和流速，实现对样品中化合物的分离和定量。
HPLC的特点之一是分离效率高。
其分析柱内有高效填料，通常是细小颗粒的吸附剂，能够提供大的表面积，有效地增加了分析柱与流动相接触的面积，从而提高了分离能力。
此外，在HPLC中还可以根据需要选择适当的流动相，调节柱温和压力等条件，进一步优化分析条件，提高分离效果。
其次，HPLC的灵敏度高。
在HPLC中，使用的检测器通常有紫外-可见光谱法、荧光法、质谱法等。
这些检测器可以实现对特定化合物的高选择性检测，而且还能够对不同化合物进行同时检测。
对于低浓度的化合物，可以通过选择合适的检测器和优化分析条件，提高检测灵敏度，使得即使在样品中含量很低的化合物也能够被准确地检测到。
此外，HPLC在分析速度和样品处理方面也比较快捷。
与传统的柱色谱技术相比，HPLC使用的高压泵可以提高流动相的速度，从而缩短分析时间。
对于样品预处理方面，使用HPLC时只需要进行简单的处理，如溶解样品并过滤，就可以直接进入分析阶段。
这使得HPLC具有高通量分析的优势，能够在短时间内快速分析大量样品。
此外，HPLC还可与其他技术结合应用。
例如，HPLC-质谱联用技术可以实现对样品中化合物的分离和结构的同时鉴定，具有非常高的分析灵敏度和选择性。
HPLC还可以与色谱预处理、液相萃取和样品前处理等技术结合，提高样品的净化效果和检测灵敏度。
综上所述，HPLC是一种高效、灵敏和多功能的分析技术，被广泛应用于各个科学领域。
它的分离效率高，灵敏度高，分析速度快，样品处理简便，可以与其他技术结合使用，提高分析的效果和可靠性。
在今后的科学研究和实际应用中，HPLC将继续发挥重要的作用。
仪器分析― 高效液相色谱法PPT课件
填充的固定相颗粒直径多在150~200m范围内。即使这样，
流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！ 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，
但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。
4
• 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识 到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减 小填充物的粒径（3~10 m ）！
HPLC仪器包括： 1. 高压输液装置; 2. 进样系统; 3. 分离系统; 4. 检测系统; 5. 此 外 还 配 有 梯 度淋洗、自动进样 和数据处理装置。
其工作过程如图 8-2所示。
图8-2 HPLC仪器工作过程示意图
9
高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography
选择原则。
3
8.1 概 述
高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。 按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色 谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外， 还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。
早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm, 长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，
• 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
• 结论：从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有
用、更具发展前途！
7
3. 应用 由于HPLC分离分析的高
灵敏度、定量的准确性、适 于非挥发性和热不稳定组分 的分析，因此，在工业、科 学研究，尤其是在生物学和
不溶于水 非极性
极性增加 非离子极性
16
高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography
流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！ 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，
但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。
4
• 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识 到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减 小填充物的粒径（3~10 m ）！
HPLC仪器包括： 1. 高压输液装置; 2. 进样系统; 3. 分离系统; 4. 检测系统; 5. 此 外 还 配 有 梯 度淋洗、自动进样 和数据处理装置。
其工作过程如图 8-2所示。
图8-2 HPLC仪器工作过程示意图
9
高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography
选择原则。
3
8.1 概 述
高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。 按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色 谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外， 还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。
早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm, 长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，
• 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
• 结论：从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有
用、更具发展前途！
7
3. 应用 由于HPLC分离分析的高
灵敏度、定量的准确性、适 于非挥发性和热不稳定组分 的分析，因此，在工业、科 学研究，尤其是在生物学和
不溶于水 非极性
极性增加 非离子极性
16
高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
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按极性分为非极性、中等极性和极性三类。
20
（一）键合相的种类
1. 非极性键合相
表面基团
-C18H37 -C8H17
硅பைடு நூலகம்表面
OH
OH
OH
OH
OH
Si
Si
Si
Si
Si
O
O
O
O
21
2. 弱极性、极性键合相
弱极性键合相： O
正相和反相均可
极性键合相：
CN NH2 一般作正相
CH 3
Si
O Si
(CH2)n C N
溶剂系统选择的原则(分子间作用力)与优化意义 (增加R)
流动相的优化
实现最难分离物质对的理想分离前提下的快速分离 实现最大整体分离效能前提下的快速分离
27
三、分离条件的选择
（一）Van Deemter 方程式
在气相色谱法中： 填充柱
H=A+B/u+Cu
17
离子色谱法（ion chromatography）
离子交换色谱与电导检测器相结合分析各种离子 的方法
抑制型（双柱型）和非抑制型（单柱型）
分离柱 交换反应：R＋－OH－+ NaX →R＋－X－ + NaOH 洗脱反应：R＋―X－+ NaOH→R＋－OH－+ NaX
抑制柱 与组分反应：R――H＋+ NaX→R――Na＋+ HX
与洗脱剂反应：R－―H＋+ NaOH→R――Na＋+ H2O
18
第二节 HPLC的固定相和流动相及其选择
固定相应满足下列要求 颗粒细、均匀 传质快 机械强度高，耐高压 化学稳定性好，与流动相不发生反应
19
一、化学健合相的固定相 （chemically bonded phase)
用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体 表面上所形成的填料称为化学键合相。
离子对色谱 (Ion-Pair)
固定相
流动相
(Stationary Phase) (Mobile Phase)
硅胶，氨基、氰基、 二醇基键合硅胶……
烷烃/极性调节剂
C18、氨基、氰基键 水/有机溶剂 合硅胶……
C18、C8键合硅 胶……
C18、C8键合硅 胶……
水/有机溶剂 弱酸、弱碱缓冲 盐
水/有机溶剂 离子对试剂
2000 1600 1000
600
0
60% 乙腈 40% 水
1
2
Tim4 e
6
8
0
(min.)
80% 乙腈 20% 水
2
4
6
8
10
Time (min.)
溶剂洗脱强度增加
Inject
2
增加
低柱效
高柱效
柱效增加
Time
26
溶剂的强度和选择性
溶剂的极性 可按Snyder溶剂系统中的强度因 子来表示，反相洗脱时，强度因子S越大，洗脱 能力越强。
主要适用范围 (Compound Separated)
在水中不溶解的物质 或同分异构体
中性、弱酸性、弱碱 性物质
弱酸、弱碱、两性化 合物
有机酸、碱、盐及两 性化合物
16
三、其他高效液相色谱法
离子色谱法（ion chromatography） 手性色谱法（chial chromatography） 亲和色谱法（affinity chromatography）
14
影响容量因子的因素
离子对试剂的种类和浓度
分析酸性类物质 季铵盐 分析碱性类物质 烷基磺酸盐或硫酸盐 PIC试剂碳链， k 在低于胶束浓度时， PIC试剂浓度， k
流动相的pH 影响PIC试剂和组分的离子化
15
小结
色谱类型 (Mode)
正相色谱 (NormalPhase) 反相色谱 (ReversedPhase) 离子抑制色谱 (Ion Suppression)
CH3
22
（二）键合相的性质和特点
键合反应 含碳量和覆盖度
键合基团的链长增加，极性降低，载样量增大， 容量因子增加。 键合相的特点 不流失、稳定、载样量大 注意点 pH适用范围
23
二、化学键合相的流动相
对流动相的基本要求 不与固定相发生化学反应。 对样品有适宜的溶解度。有合适的k值。 溶剂应与检测器相匹配，
物 分离机制：疏溶剂理论认为在该法中溶质的
保留是溶质分子与极性分子间的排斥力。
9
反相键合相色谱法
影响保留行为的因素 溶质的分子结构
极性，疏水性，k，tR
流动相
与其表面张力和介电常数有关，有机溶剂含量，k 流动相的pH影响溶质的离解程度，离解程度，k
固定相
随碳链延长，键合相疏水性， k 碳链一定时，键合相浓度， k
溶剂的截止波长<样品的检测波长 纯度高，粘度小。
24
流动相对分离的影响
分离度R与n、、k2的关系 n-决定于色谱柱（固定相）性能。 、k-受溶剂系统（流动相）影响。
n -1
k2
R= 4
k2-1
(a) (b) (c)
25
mAU
mAU
AB
AB
AB
2
3
1
2
1
110 0 70 0 30 0 10 0
仪器分析高效液相色谱法1
第一节 概述
以经典液相色谱法为基础，引入气相色谱的理论 与实验方法，发展而成的分离分析方法。
以高压泵输送液体流动相，采用高效固定相，实 现在线检测和仪器化。具有分离效能高、分析速 度快、应用范围广等的优点。
2
（二）反相键合相色谱法
常用固定相：十八烷基硅烷（C18，ODS） 常用流动相：甲醇—水，乙腈—水 分析对象：非极性、中等极性的分子型化合
10
离子抑制色谱法 ISC
ISC—调节RLLC流动相pH值以抑制组分的离解 抑制剂：弱酸(HAc)、弱碱(NH3H2O)或缓冲
液 分离机制：调节流动相pH，抑制组分的理解，以
中性分子的形式在固定相和流动相之间产生分配 平衡。 分析对象：3.0≤pKa ≤ 7.0的弱酸
7.0 ≤ pKa ≤ 7.0的弱碱 两性化合物
11
ISC
容量因子及其影响因素
对于弱酸：流动相pH < 组分pKa，k，tR
流动相pH范围2 ~ 8 固定相与反相键合相一致
12
（三）反相离子对色谱法
RPIC—在一般RLLC流动相中加入离子对试剂。 常用的离子对试剂：分析碱用烷基磺酸盐，分析酸
用四丁基季胺盐。 分离机制：离子对试剂与被分析的离子形成中性离
子对，在固定相和流动相之间产生分配平衡。 分析对象：各类有机酸、碱、盐及两性化合物
13
保留机制-离子对模型
B+H RSO3Na
BH+ + RSO3- + Na+
BH+RSO3-
固定相 BH+RSO3-
K B [[ B B A ]m ]s [[B B ] m [A A ]]sm A m E BA A m
20
（一）键合相的种类
1. 非极性键合相
表面基团
-C18H37 -C8H17
硅பைடு நூலகம்表面
OH
OH
OH
OH
OH
Si
Si
Si
Si
Si
O
O
O
O
21
2. 弱极性、极性键合相
弱极性键合相： O
正相和反相均可
极性键合相：
CN NH2 一般作正相
CH 3
Si
O Si
(CH2)n C N
溶剂系统选择的原则(分子间作用力)与优化意义 (增加R)
流动相的优化
实现最难分离物质对的理想分离前提下的快速分离 实现最大整体分离效能前提下的快速分离
27
三、分离条件的选择
（一）Van Deemter 方程式
在气相色谱法中： 填充柱
H=A+B/u+Cu
17
离子色谱法（ion chromatography）
离子交换色谱与电导检测器相结合分析各种离子 的方法
抑制型（双柱型）和非抑制型（单柱型）
分离柱 交换反应：R＋－OH－+ NaX →R＋－X－ + NaOH 洗脱反应：R＋―X－+ NaOH→R＋－OH－+ NaX
抑制柱 与组分反应：R――H＋+ NaX→R――Na＋+ HX
与洗脱剂反应：R－―H＋+ NaOH→R――Na＋+ H2O
18
第二节 HPLC的固定相和流动相及其选择
固定相应满足下列要求 颗粒细、均匀 传质快 机械强度高，耐高压 化学稳定性好，与流动相不发生反应
19
一、化学健合相的固定相 （chemically bonded phase)
用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体 表面上所形成的填料称为化学键合相。
离子对色谱 (Ion-Pair)
固定相
流动相
(Stationary Phase) (Mobile Phase)
硅胶，氨基、氰基、 二醇基键合硅胶……
烷烃/极性调节剂
C18、氨基、氰基键 水/有机溶剂 合硅胶……
C18、C8键合硅 胶……
C18、C8键合硅 胶……
水/有机溶剂 弱酸、弱碱缓冲 盐
水/有机溶剂 离子对试剂
2000 1600 1000
600
0
60% 乙腈 40% 水
1
2
Tim4 e
6
8
0
(min.)
80% 乙腈 20% 水
2
4
6
8
10
Time (min.)
溶剂洗脱强度增加
Inject
2
增加
低柱效
高柱效
柱效增加
Time
26
溶剂的强度和选择性
溶剂的极性 可按Snyder溶剂系统中的强度因 子来表示，反相洗脱时，强度因子S越大，洗脱 能力越强。
主要适用范围 (Compound Separated)
在水中不溶解的物质 或同分异构体
中性、弱酸性、弱碱 性物质
弱酸、弱碱、两性化 合物
有机酸、碱、盐及两 性化合物
16
三、其他高效液相色谱法
离子色谱法（ion chromatography） 手性色谱法（chial chromatography） 亲和色谱法（affinity chromatography）
14
影响容量因子的因素
离子对试剂的种类和浓度
分析酸性类物质 季铵盐 分析碱性类物质 烷基磺酸盐或硫酸盐 PIC试剂碳链， k 在低于胶束浓度时， PIC试剂浓度， k
流动相的pH 影响PIC试剂和组分的离子化
15
小结
色谱类型 (Mode)
正相色谱 (NormalPhase) 反相色谱 (ReversedPhase) 离子抑制色谱 (Ion Suppression)
CH3
22
（二）键合相的性质和特点
键合反应 含碳量和覆盖度
键合基团的链长增加，极性降低，载样量增大， 容量因子增加。 键合相的特点 不流失、稳定、载样量大 注意点 pH适用范围
23
二、化学键合相的流动相
对流动相的基本要求 不与固定相发生化学反应。 对样品有适宜的溶解度。有合适的k值。 溶剂应与检测器相匹配，
物 分离机制：疏溶剂理论认为在该法中溶质的
保留是溶质分子与极性分子间的排斥力。
9
反相键合相色谱法
影响保留行为的因素 溶质的分子结构
极性，疏水性，k，tR
流动相
与其表面张力和介电常数有关，有机溶剂含量，k 流动相的pH影响溶质的离解程度，离解程度，k
固定相
随碳链延长，键合相疏水性， k 碳链一定时，键合相浓度， k
溶剂的截止波长<样品的检测波长 纯度高，粘度小。
24
流动相对分离的影响
分离度R与n、、k2的关系 n-决定于色谱柱（固定相）性能。 、k-受溶剂系统（流动相）影响。
n -1
k2
R= 4
k2-1
(a) (b) (c)
25
mAU
mAU
AB
AB
AB
2
3
1
2
1
110 0 70 0 30 0 10 0
仪器分析高效液相色谱法1
第一节 概述
以经典液相色谱法为基础，引入气相色谱的理论 与实验方法，发展而成的分离分析方法。
以高压泵输送液体流动相，采用高效固定相，实 现在线检测和仪器化。具有分离效能高、分析速 度快、应用范围广等的优点。
2
（二）反相键合相色谱法
常用固定相：十八烷基硅烷（C18，ODS） 常用流动相：甲醇—水，乙腈—水 分析对象：非极性、中等极性的分子型化合
10
离子抑制色谱法 ISC
ISC—调节RLLC流动相pH值以抑制组分的离解 抑制剂：弱酸(HAc)、弱碱(NH3H2O)或缓冲
液 分离机制：调节流动相pH，抑制组分的理解，以
中性分子的形式在固定相和流动相之间产生分配 平衡。 分析对象：3.0≤pKa ≤ 7.0的弱酸
7.0 ≤ pKa ≤ 7.0的弱碱 两性化合物
11
ISC
容量因子及其影响因素
对于弱酸：流动相pH < 组分pKa，k，tR
流动相pH范围2 ~ 8 固定相与反相键合相一致
12
（三）反相离子对色谱法
RPIC—在一般RLLC流动相中加入离子对试剂。 常用的离子对试剂：分析碱用烷基磺酸盐，分析酸
用四丁基季胺盐。 分离机制：离子对试剂与被分析的离子形成中性离
子对，在固定相和流动相之间产生分配平衡。 分析对象：各类有机酸、碱、盐及两性化合物
13
保留机制-离子对模型
B+H RSO3Na
BH+ + RSO3- + Na+
BH+RSO3-
固定相 BH+RSO3-
K B [[ B B A ]m ]s [[B B ] m [A A ]]sm A m E BA A m