【精品】仪器分析高效液相色谱法1课件
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仪器分析高效液相色谱法1
第一节 概述
以经典液相色谱法为基础，引入气相色谱的理论 与实验方法，发展而成的分离分析方法。
以高压泵输送液体流动相，采用高效固定相，实 现在线检测和仪器化。具有分离效能高、分析速 度快、应用范围广等的优点。
2
（二）反相键合相色谱法
常用固定相：十八烷基硅烷（C18，ODS） 常用流动相：甲醇—水，乙腈—水 分析对象：非极性、中等极性的分子型化合
离子对色谱 (Ion-Pair)
固定相
流动相
(Stationary Phase) (Mobile Phase)
硅胶，氨基、氰基、 二醇基键合硅胶……
烷烃/极性调节剂
C18、氨基、氰基键 水/有机溶剂 合硅胶……
C18、C8键合硅 胶……
C18、C8键合硅 胶……
水/有机溶剂 弱酸、弱碱缓冲 盐
水/有机溶剂 离子对试剂
子对，在固定相和流动相之间产生分配平衡。 分析对象：各类有机酸、碱、盐及两性化合物
13
保留机制-离子对模型
B+H RSO3Na
BH+ + RSO3- + Na+
BH+RSO3-
固定相 BH+RSO3-
K B [[ B B A ]m ]s [[B B ] m [A A ]]sm A m E BA A m
CH3
22
（二）键合相的性质和特点
键合反应 含碳量和覆盖度
键合基团的链长增加，极性降低，载样量增大， 容量因子增加。 键合相的特点 不流失、稳定、载样量大 注意点 pH适用范围
23
二、化学键合相的流动相
对流动相的基本要求 不与固定相发生化学反应。 对样品有适宜的溶解度。有合适的k值。 溶剂应与检测器相匹配，
溶剂系统选择的原则(分子间作用力)与优化意义 (增加R)
流动相的优化
实现最难分离物质对的理想分离前提下的快速分离 实现最大整体分离效能前提下的快速分离
27
三、分离条件的选择
（一）Van Deemter 方程式
在气相色谱法中： 填充柱
H=A+B/u+Cu
17
离子色谱法（ion chromatography）
离子交换色谱与电导检测器相结合分析各种离子 的方法
抑制型（双柱型）和非抑制型（单柱型）
分离柱 交换反应：R＋－OH－+ NaX →R＋－X－ + NaOH 洗脱反应：R＋―X－+ NaOH→R＋－OH－+ NaX
抑制柱 与组分反应：R――H＋+ NaX→R――Na＋+ HX
14
影响容量因子的因素
离子对试剂的种类和浓度
分析酸性类物质 季铵盐 分析碱性类物质 烷基磺酸盐或硫酸盐 PIC试剂碳链， k 在低于胶束浓度时， PIC试剂浓度， k
流动相的pH 影响PIC试剂和组分的离子化
15
小结
色谱类型 (Mode)
正相色谱 (NormalPhase) 反相色谱 (ReversedPhase) 离子抑制色谱 (Ion Suppression)
与洗脱剂反应：R－―H＋+ NaOH→R――Na＋+ H2O
18
第二节 HPLC的固定相和流动相及其选择
固定相应满足下列要求 颗粒细、均匀 传质快 机械强度高，耐高压 化学稳定性好，与流动相不发生反应
19
一、化学健合相的固定相 （chemically bonded phase)
用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体 表面上所形成的填料称为化学键合相。
10
离子抑制色谱法 ISC
ISC—调节RLLC流动相pH值以抑制组分的离解 抑制剂：弱酸(HAc)、弱碱(NH3H2O)或缓冲
液 分离机制：调节流动相pH，抑制组分的理解，以
中性分子的形式在固定相和流动相之间产生分配 平衡。 分析对象：3.0≤pKa ≤ 7.0的弱酸
7.0 ≤ pKa ≤ 7.0的弱碱 两性化合物
按极性分为非极性、中等极性和极性三类。
20
（一）键合相的种类
1. 非极性键合相
表面基团
-C18H37 -C8H17
硅胶表面
OH
OH
OH
OH
OH
Si
Si
Si
Si
Si
O
O
O
O
21
2. 弱极性、极性键合相Байду номын сангаас
弱极性键合相： O
正相和反相均可
极性键合相：
CN NH2 一般作正相
CH 3
Si
O Si
(CH2)n C N
物 分离机制：疏溶剂理论认为在该法中溶质的
保留是溶质分子与极性分子间的排斥力。
9
反相键合相色谱法
影响保留行为的因素 溶质的分子结构
极性，疏水性，k，tR
流动相
与其表面张力和介电常数有关，有机溶剂含量，k 流动相的pH影响溶质的离解程度，离解程度，k
固定相
随碳链延长，键合相疏水性， k 碳链一定时，键合相浓度， k
11
ISC
容量因子及其影响因素
对于弱酸：流动相pH < 组分pKa，k，tR
流动相pH范围2 ~ 8 固定相与反相键合相一致
12
（三）反相离子对色谱法
RPIC—在一般RLLC流动相中加入离子对试剂。 常用的离子对试剂：分析碱用烷基磺酸盐，分析酸
用四丁基季胺盐。 分离机制：离子对试剂与被分析的离子形成中性离
主要适用范围 (Compound Separated)
在水中不溶解的物质 或同分异构体
中性、弱酸性、弱碱 性物质
弱酸、弱碱、两性化 合物
有机酸、碱、盐及两 性化合物
16
三、其他高效液相色谱法
离子色谱法（ion chromatography） 手性色谱法（chial chromatography） 亲和色谱法（affinity chromatography）
溶剂的截止波长<样品的检测波长 纯度高，粘度小。
24
流动相对分离的影响
分离度R与n、、k2的关系 n-决定于色谱柱（固定相）性能。 、k-受溶剂系统（流动相）影响。
n -1
k2
R= 4
k2-1
(a) (b) (c)
25
mAU
mAU
AB
AB
AB
2
3
1
2
1
110 0 70 0 30 0 10 0
2000 1600 1000
600
0
60% 乙腈 40% 水
1
2
Tim4 e
6
8
0
(min.)
80% 乙腈 20% 水
2
4
6
8
10
Time (min.)
溶剂洗脱强度增加
Inject
2
增加
低柱效
高柱效
柱效增加
Time
26
溶剂的强度和选择性
溶剂的极性 可按Snyder溶剂系统中的强度因 子来表示，反相洗脱时，强度因子S越大，洗脱 能力越强。
第一节 概述
以经典液相色谱法为基础，引入气相色谱的理论 与实验方法，发展而成的分离分析方法。
以高压泵输送液体流动相，采用高效固定相，实 现在线检测和仪器化。具有分离效能高、分析速 度快、应用范围广等的优点。
2
（二）反相键合相色谱法
常用固定相：十八烷基硅烷（C18，ODS） 常用流动相：甲醇—水，乙腈—水 分析对象：非极性、中等极性的分子型化合
离子对色谱 (Ion-Pair)
固定相
流动相
(Stationary Phase) (Mobile Phase)
硅胶，氨基、氰基、 二醇基键合硅胶……
烷烃/极性调节剂
C18、氨基、氰基键 水/有机溶剂 合硅胶……
C18、C8键合硅 胶……
C18、C8键合硅 胶……
水/有机溶剂 弱酸、弱碱缓冲 盐
水/有机溶剂 离子对试剂
子对，在固定相和流动相之间产生分配平衡。 分析对象：各类有机酸、碱、盐及两性化合物
13
保留机制-离子对模型
B+H RSO3Na
BH+ + RSO3- + Na+
BH+RSO3-
固定相 BH+RSO3-
K B [[ B B A ]m ]s [[B B ] m [A A ]]sm A m E BA A m
CH3
22
（二）键合相的性质和特点
键合反应 含碳量和覆盖度
键合基团的链长增加，极性降低，载样量增大， 容量因子增加。 键合相的特点 不流失、稳定、载样量大 注意点 pH适用范围
23
二、化学键合相的流动相
对流动相的基本要求 不与固定相发生化学反应。 对样品有适宜的溶解度。有合适的k值。 溶剂应与检测器相匹配，
溶剂系统选择的原则(分子间作用力)与优化意义 (增加R)
流动相的优化
实现最难分离物质对的理想分离前提下的快速分离 实现最大整体分离效能前提下的快速分离
27
三、分离条件的选择
（一）Van Deemter 方程式
在气相色谱法中： 填充柱
H=A+B/u+Cu
17
离子色谱法（ion chromatography）
离子交换色谱与电导检测器相结合分析各种离子 的方法
抑制型（双柱型）和非抑制型（单柱型）
分离柱 交换反应：R＋－OH－+ NaX →R＋－X－ + NaOH 洗脱反应：R＋―X－+ NaOH→R＋－OH－+ NaX
抑制柱 与组分反应：R――H＋+ NaX→R――Na＋+ HX
14
影响容量因子的因素
离子对试剂的种类和浓度
分析酸性类物质 季铵盐 分析碱性类物质 烷基磺酸盐或硫酸盐 PIC试剂碳链， k 在低于胶束浓度时， PIC试剂浓度， k
流动相的pH 影响PIC试剂和组分的离子化
15
小结
色谱类型 (Mode)
正相色谱 (NormalPhase) 反相色谱 (ReversedPhase) 离子抑制色谱 (Ion Suppression)
与洗脱剂反应：R－―H＋+ NaOH→R――Na＋+ H2O
18
第二节 HPLC的固定相和流动相及其选择
固定相应满足下列要求 颗粒细、均匀 传质快 机械强度高，耐高压 化学稳定性好，与流动相不发生反应
19
一、化学健合相的固定相 （chemically bonded phase)
用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体 表面上所形成的填料称为化学键合相。
10
离子抑制色谱法 ISC
ISC—调节RLLC流动相pH值以抑制组分的离解 抑制剂：弱酸(HAc)、弱碱(NH3H2O)或缓冲
液 分离机制：调节流动相pH，抑制组分的理解，以
中性分子的形式在固定相和流动相之间产生分配 平衡。 分析对象：3.0≤pKa ≤ 7.0的弱酸
7.0 ≤ pKa ≤ 7.0的弱碱 两性化合物
按极性分为非极性、中等极性和极性三类。
20
（一）键合相的种类
1. 非极性键合相
表面基团
-C18H37 -C8H17
硅胶表面
OH
OH
OH
OH
OH
Si
Si
Si
Si
Si
O
O
O
O
21
2. 弱极性、极性键合相Байду номын сангаас
弱极性键合相： O
正相和反相均可
极性键合相：
CN NH2 一般作正相
CH 3
Si
O Si
(CH2)n C N
物 分离机制：疏溶剂理论认为在该法中溶质的
保留是溶质分子与极性分子间的排斥力。
9
反相键合相色谱法
影响保留行为的因素 溶质的分子结构
极性，疏水性，k，tR
流动相
与其表面张力和介电常数有关，有机溶剂含量，k 流动相的pH影响溶质的离解程度，离解程度，k
固定相
随碳链延长，键合相疏水性， k 碳链一定时，键合相浓度， k
11
ISC
容量因子及其影响因素
对于弱酸：流动相pH < 组分pKa，k，tR
流动相pH范围2 ~ 8 固定相与反相键合相一致
12
（三）反相离子对色谱法
RPIC—在一般RLLC流动相中加入离子对试剂。 常用的离子对试剂：分析碱用烷基磺酸盐，分析酸
用四丁基季胺盐。 分离机制：离子对试剂与被分析的离子形成中性离
主要适用范围 (Compound Separated)
在水中不溶解的物质 或同分异构体
中性、弱酸性、弱碱 性物质
弱酸、弱碱、两性化 合物
有机酸、碱、盐及两 性化合物
16
三、其他高效液相色谱法
离子色谱法（ion chromatography） 手性色谱法（chial chromatography） 亲和色谱法（affinity chromatography）
溶剂的截止波长<样品的检测波长 纯度高，粘度小。
24
流动相对分离的影响
分离度R与n、、k2的关系 n-决定于色谱柱（固定相）性能。 、k-受溶剂系统（流动相）影响。
n -1
k2
R= 4
k2-1
(a) (b) (c)
25
mAU
mAU
AB
AB
AB
2
3
1
2
1
110 0 70 0 30 0 10 0
2000 1600 1000
600
0
60% 乙腈 40% 水
1
2
Tim4 e
6
8
0
(min.)
80% 乙腈 20% 水
2
4
6
8
10
Time (min.)
溶剂洗脱强度增加
Inject
2
增加
低柱效
高柱效
柱效增加
Time
26
溶剂的强度和选择性
溶剂的极性 可按Snyder溶剂系统中的强度因 子来表示，反相洗脱时，强度因子S越大，洗脱 能力越强。