生物过程—生物催化法生产2-苯乙醇的研究现状
科研成果——酵母生物转化生产天然2-苯乙醇
科研成果——酵母生物转化生产天然2-苯乙醇一、 2-苯乙醇的用途β-苯乙醇，又名2-苯乙醇(2-phenylethanol，β-phenylethanol，PEA)，分子式为C8H10，其分子结构如下图。
2-苯乙醇是一种具有淡雅细腻玫瑰香味的芳香醇，存在于很多花和植物的精油中，如玫瑰、风信子、茉莉、水仙、百合等，其它含有天然2-苯乙醇的产品是那些生产中涉及发酵的食品，如茶叶、可乐、咖啡、面包、白酒、苹果酒、奶酪以及酱油等。
由于玫瑰芳香气味颇受人们欢迎，2-苯乙醇在食品、药品、化妆品、烟草和日化用品中得到广泛的应用。
它不仅是玫瑰香型香气的基本组分，有协合及增效作用，而且是丁香、橙花、依兰、风信子、铃兰等多种香型配方的基底成分。
2-苯乙醇可用于配制玫瑰、覆盆子、草莓、焦糖、甜瓜、蜂蜜和其他果香型香精；也可用于配制白兰地、威士忌和各种曲酒、白酒等酒用香精；还可用于烟用香精，这些产品中2-苯乙醇含量为0.1~20 mg/kg。
苯乙醇有一个令调香师喜爱的特性：对各种香料有良好的互溶性。
当调香师发现调好的香精出现浑浊、分层或沉淀时，加入适量的苯乙醇就可以使其变得澄清透明。
另外，苯乙醇在常温时香气淡弱，随着温度升高香气渐浓，这个特性可用于熏香香精的配制。
其次，以苯乙醇为原料合成的衍生物也有着不容忽视的应用价值，例如2-苯乙醇的酯类衍生物——乙酸苯乙酯，是一种芳香物质，主要用作日化香精和食用香精。
二、天然2-苯乙醇2-苯乙醇少部分是从天然的玫瑰花中提取的，绝大部分是采用廉价的化工原料苯或苯乙烯通过化学途径合成的，即苯-环氧乙烷合成法和氧化苯乙烯加氢法。
在国际市场上，苯-环氧乙烷合成的产品占40%，氧化苯乙烯加氢法合成的产品占60%。
然而化学合成的2-苯乙醇中含有一些难以除去的副产物，例如具有不良气味的联二苯、β-氯代乙苯、氯乙醇等，严重影响了2-苯乙醇的产品质量，难以达到食用和日用香料的质量标准，对人体健康和环境有着巨大危害。
生物技术合成天然香料香精全解
同时 , 采用植物细胞培养 技术生产香兰素及其系 列化合物时 , 会受到多种 因素影响。外植体、使 用培养基的类型、培养 基中添加的前体物质的 种类和数量、培养期的 温度和光照都会对代谢 物的组成和产量有重要 影响。
三.酶工程
酶工程是利用酶的催化作用生产各种有价值物质的技 术。酶工程是指在一定的生物反应器内，利用酶的催化作 用，将相应的原料转化成有用物质的技术，也是将酶学理 论与化工技术结合而形成的新技术。
二.细胞工程
利用植物细胞、 组织和器官大规模培养技术 ,可以大 量培养香料植物,从而获得高价值的香料。植物细胞培养是 一种令植物细胞在培养基或培养液中生长的技术，使植物 的生长和收成易于控制，免受天气及其他环境因素的影响。
植物香料属于次级代谢物，通常只在已分化的特殊组 织中产生，故在培养植物细胞生产香料时，需靠控制培养 液的成分和培养的环境以提高其次级代谢物的产量
应用实例
在利用植物细胞培养技 术生产香兰素时 , 通过在 培养基中添加一些植物 激素 , 如 2,4- 二氯苯氧乙 酸 (2,4dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D) 、 苄 基 腺 嘌 呤 (benzyl adenine,BA) 和 萘 乙 酸 (naphthalene acetic acid,NAA)等,愈伤 组织发生率大大提高 , 而 且所形成的愈伤组织的 继代培养生长较好。
谢 谢！
生物技术合成天然香料香精
杨晨
目录
起源
香料香精
生物技术合成天然香料香精的方法
生物转化法合成天然香兰素
生物转化法合成天然2-苯乙醇
前景与展望
起源
自古以来，人们已在无意识的情况下利用微生物使一些食品更具风味， 如各种酒类、酱、醋和面包等发酵类食品都具有一种自然的清香。到 19世纪末20世纪初，人们才开始认识发酵食品的典型香味与发酵微生 物之间的关系，香味物质乃是微生物生长过程合成的一些代谢产物。 发酵食品中特定的微生物群已决定了该食品所特有的香气，比如奶酪、 酸奶、酱油、啤酒、泡菜等中的味道各有特点。已知有多种微生物， 包括细菌、霉菌和酵母，都可以利用基本的营养成分通过全程合成某 些香料化合物，包括挥发性醇类、酯类、羰基化合物、有机酸、硫化 物、氨基酸类等。
酵母生物转化生产2_苯乙醇的研究进展
应用与环境生物学报 2006,12(1):140～144 Chi n J A pp lEnvi ron B i o l=I SSN1006-687X 2006-02-25酵母生物转化生产2-苯乙醇的研究进展杨霄 崔志峰*(浙江工业大学生物与环境工程学院 杭州 310014)摘 要 主要论述了利用酵母菌生物转化合成天然2-苯乙醇的研究进展,从应用微生物学的角度介绍了2-苯乙醇生产菌株的筛选,分析了2-苯乙醇合成过程中几方面因素的影响和培养条件的选择,并对产物原位转移技术作了简要说明.并从分子生物学的角度出发,对生物转化的重点途径———艾利希途径在基因水平上作了诠释,且例举了利用从头合成途径进行的基因工程育种,旨在为利用微生物生产2-苯乙醇的研究开发提供参考.图1参40关键词 2-苯乙醇;酵母菌;艾利希途径;产物原位转移CLC TQ923Progress i n2-phenylethanol Producti on by B iotransfor mati on w ith YeastYANG X iao＆CU I Zhifeng*(Co ll ege o fB iol ogica land E nvir onm en t a lEng i neering,Zhej iang Un i versit y o f Technol ogy,H angz hou 310014,Ch i n a) Abstract Since2-pheny l e t hano l is an i m po rt ant flavo r and frag rance co m pound w it h a rose li ke s m e ll,it is w ide l y used i n m any industries,such as frag rance industry and food i ndustry.I t occurs na t urall y in e ssentia l o ils of many fl ow ers and plan ts, espec iall y i n rose o i.l2-pheny le t hano l can a lso be s yn t hesized by chem ica lm ethods,bu t the chem ica lm eans a re giv i ng w ay t ob i o s yn t hesis path w ay s due to increasing l y de m and for na t ural produc.t This rev i ew desc ri bes t he prog re ss i n its producti on of2-pheny le t hano lw it h yeast,inc l udi ng strain sc reen i ng,cult ure conditi ons and aff ec ting factors i nvo l ved i n its produc tion.In situ p roduct re m ova l is a lso m entioned because it is conside red nece ssa ry fo r high y i e ld o f2-pheny le t hano l in yeast by re m oving t he p roduct i nh i b ition.Be cause Ehrlich m etabo lis m is one of t he m ost i mportant pa t h w ay s f o r t he synthe sis o f2-pheny l e t hano l,g enes invo l ved in this path w ay and transcriptional regulati on a re also rev ie w ed.F i na ll y,de novo s yn t hesis o f2-pheny lethanoland yea st breeding by gene tic eng i neering a re s umm arized.F i g1,Re f40K eyword s 2-pheny lethano l;yeast;Ehrlich path w ay;in sit u p roduct re m ova lCLC TQ923 2-苯乙醇是一种具有玫瑰花香的芳香醇,由于它对碱和空气中的氧作用都很稳定,所以大量应用于日用化学和食品工业中玫瑰香型和其他类型的香精配方,尤其在化妆品中用量最大.由它作为原料合成的许多衍生物也具有不容忽视的应用价值,比如它的酯类衍生物乙酸苯乙酯就是一种重要的芳香物质.目前,绝大部分2-苯乙醇是用苯或苯乙烯通过化学途径合成的,这些原料都是致癌物质,对人体健康和环境都有巨大危害.此外,化学合成的2-苯乙醇中常含有一些难以除去的副产物[1],严重影响了产品质量,其弊端显而易见.值得重视的是从上世纪末以来,消费者对“天然”产品的要求在不断提升.就2-苯乙醇而言,在美国市场上,化学合成的市场售价为3.50＄/kg,而天然的2-苯乙醇售价则高达1000＄/kg[2].所谓“天然”,即此物质必须来源于自然,通过物理、酶或微生物途径产生[3].天然2-苯乙醇存在于很多花和植物的精炼油中,例如风信子、茉莉花、水仙、百合等,但多数情况下浓度太低,无法提取.唯一例外的是玫瑰精油,从某些种类的玫瑰精油中可以得到60%以上的2-苯乙醇.更高浓度的2-苯乙醇只能通过溶剂萃取的方法得到[1].但是,从玫瑰中提取天然2-苯乙醇生产周期长,花费昂贵,无法进行大规模的工业生产来满足市场的需收稿日期:2004-10-29 接受日期:2004-12-17*通讯作者 C orres pond i ng au t hor(E-m ail:zfcu i2001@yahoo.co )要.利用微生物作为生产菌株进行合成可以克服上述缺点,许多利用微生物发酵生产的食用品中都含有2-苯乙醇,如可可、咖啡、面包、啤酒、奶酪[4]等.特别是Eh rlich(艾利希)发现,在酵母培养物中添加L-苯丙氨酸(L-Phe)可以使2-苯乙醇的产量得到大幅提高[5],故可以利用酵母菌生物转化生产.必须说明的是,欧洲的相关法令规定,如果通过微生物代谢途径得到的产物需要定义为天然产物,那么参与代谢的前体物质必须是天然物质,如天然氨基酸.目前我国已有较多关于L-P he生物合成的研究报告,但对于2-苯乙醇生物合成的研究尚处于起步阶段,有关的文献报道也甚少[6].国外对于2-苯乙醇生物合成的研究已达到较高水平.本文对2-苯乙醇生产菌株的筛选、培养条件的影响、生化合成途径以及相关基因的研究进展等作一综述,旨在为利用微生物生产2-苯乙醇的研究开发提供参考.1 生物转化机理与菌种筛选大多数微生物,特别是酵母菌,都能通过正常的代谢途径产生2-苯乙醇,但产量一般都很低,若向培养基中加入前体物质L-P he,2-苯乙醇的产量能得到大幅提高.这条途径早在1907年就被艾利希发现并加以阐述,之后由他的名字命名[5].L-Phe 通过转氨酶作用形成苯丙酮酸,苯丙酮酸在苯丙酮酸脱羧酶作用下脱羧形成苯乙醛,苯乙醛再通过醇脱氢酶催化生成2-苯乙醇.艾利希在描述这条途径时同时指出,加入的L-P he的量与最终得到的2-苯乙醇的产量之间存在紧密联系.这条途径是目前利用微生物转化生产2-苯乙醇的主要途径.2-苯乙醇还可以通过莽草酸途径从头合成.葡萄糖通过糖酵解途径(E M P)产生磷酸烯醇式丙酮酸,通过磷酸戊糖途径(HM P)产生4-磷酸赤藓糖,两者在2-酮-3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAH P合酶)作用下通过中间体DAHP形成莽草酸.莽草酸再经中间体分支酸和预苯酸在分支酸变位酶和预苯酸脱水酶的作用下形成苯丙酮酸,苯丙酮酸一方面可通过苯乙醛生成2-苯乙醇,另一方面,也可通过与L-谷氨酸的转氨作用形成L-Phe[2,7].代谢途径中DAHP合酶及预苯酸脱水酶受到L-Phe的反馈抑制[8].这条途径在微生物体内广泛存在,但由于代谢途径太长,支路太多,存在多种抑制作用,故最终得到的2-苯乙醇产量很低,但是通过基因工程或传统诱变的手段定向增强关键酶的活性可使产量得到提高.生物体内通过何种途径合成2-苯乙醇取决于培养基中的氮源状况.谷氨酸、铵盐等一般作为优质的、较易利用的氮源使用,而氨基酸、尿素等只作为贫瘠的次级氮源使用.只有当L-Phe作为唯一氮源时艾利希途径才占主导地位.如果有更易利用的氮源存在,L-Phe则将通过其它途径代谢.酵母中L-Phe的代谢有很多种可能性,对相当一部分酵母而言,L-Phe可通过肉桂酸途径代谢[9].在酿酒酵母中这条途径尚未得到证实,除艾利希途径之外的L-Phe的其它代谢途径还有待考证.哺乳动物中的代谢途径与酵母中的又有不同[9](图1).图1 L-苯丙氨酸代谢途径[2]F i g.1 L-phenylal anine(L-Phe)m et abolis m[2] 2-苯乙醇的产生具有菌株特异性,不同的产生菌产2-苯乙醇的能力也不相同,因此,在对生物转化途径进行细致的研究之前,稳定高产菌的筛选必须事先完成.F abre等通过一个半合成培养基(葡萄糖80g/L,DL-Phe2g/L,(NH4)2SO42g/L,KH2PO45g/L,M gSO47H2O0.4g/L,酵母提取物1g/L,p H3.8)对21种酵母菌进行筛选,采用高效液相色谱(HPLC)法进行检测:RP-C18柱(220mm×4.6mm),流动相乙腈∶水=40∶60(V/V),检测波长216n m,苯丙氨酸在4m i n出峰, 2-苯乙醇在8m in出峰.选出一株K luyvero m yces marxianus为高产菌,在30℃、125r/m in条件下培养192h后2-苯乙醇产量达1.85g/L[10].Etsch m ann等以工业废料糖蜜作为碳源,利用糖蜜培养基(甜菜糖蜜形式的蔗糖60g/L,L-Phe7g/L,N a2HPO42H2O22.8g/L,柠檬酸10.3g/L,M gSO47H2O0.5g/L,无氨基酸无硫酸铵的酵母氮碱0.17g/L,p H5)从14株酵母菌菌株筛选出K.marxianus CBS600和CBS397两株高产菌,培养过程中通过产物原位转移技术用油醇作为提取剂消除终产物2-苯乙醇对细胞生长的毒性,可使两株菌的2-苯乙醇产量提高到3g/L.2-苯乙醇在水相中的含量用HPLC法测定:RP-C18柱(250mm×4.6mm,10μm,A llt ech),流动相甲醇∶水=60∶40(V/V),流速2mL/m i n;检测波长216nm.2-苯乙醇的总浓度通过它在油醇和水相中的分配系数K计算出,通过实验测定K值为13.5∶1[11].需要指出的是,此结果与其它在合成培养基中研究所得的结果彼此间缺乏可比性,由于培养条件有差异,此处的两株高产菌也许在合成培养基中并不高产.但此实验中用糖蜜作为碳源,具有巨大的经济和环境上的优势,这种培养方式值得进行更深一步的研究.141 1期杨霄等:酵母生物转化生产2-苯乙醇的研究进展 2 酵母菌对2-苯乙醇的耐受性和产物原位转移技术2-苯乙醇作为杀菌剂已在医药行业中应用多年了.浓度介于2～3g/L的2-苯乙醇能完全抑制多种细菌和真菌的生长.关于抑制作用的具体机理存在多种看法,但普遍认为,细胞膜是一个重要的作用位点,因为芳香醇能增加细胞膜的流动性,影响细胞质膜上糖和氨基酸的转运体系,加速粒子和小分子代谢产物的过膜积极扩散,导致跨膜质子动势被扰乱[12,13],从而引起胞内离子的渗漏和氨基酸、葡萄糖摄入量的降低.2-苯乙醇也被认为是细菌细胞内大分子物质合成的抑制剂[14],它通过特殊的作用机制抑制了大肠杆菌中蛋白质和RNA的合成[15].W ilkie和M a roudas研究发现,2-苯乙醇抑制酿酒酵母的生长是通过诱导出一种呼吸缺陷型菌株,这种缺陷型菌株一方面是由于诱导发生小菌落突变,细胞合成了无功能的线粒体,另一方面是通过线粒体通透性的增加,直接抑制了呼吸,导致胞内P/O比降低,代谢解偶联[16].试验表明,当2-苯乙醇的浓度低于0.6g/L时,它对酿酒酵母的生长不产生抑制作用,当浓度达到4g/L时,酿酒酵母停止生长.由于2-苯乙醇能自由扩散出入质膜,故酵母细胞内代谢产生的2-苯乙醇对细胞同样有毒害作用,这使得胞内合成的2-苯乙醇达到一定浓度时,细胞受其毒性影响,生长延缓,代谢受阻,无法得到更高的浓度.产物原位转移技术是指在液体培养基中加入另一有机溶剂相例如油酸,共同培养(有机溶剂需对细胞的生长不产生抑制作用).水相中合成的2-苯乙醇将通过液液抽提进入有机相之中,从而保证水相中的2-苯乙醇浓度始终处在对酵母细胞的抑制浓度之下,避免酵母细胞受到高浓度2-苯乙醇的毒害,使细胞正常生长代谢,不断合成2-苯乙醇[17].Sta rk等利用酿酒酵母在含有6g/L L-Phe和其他氮源条件下培养所得的2-苯乙醇浓度为2.35g/L,同一菌株用油酸进行产物原位转移,通过补料分批培养所得的2-苯乙醇浓度达到了12.6g/L[18].3 影响酵母菌合成2-苯乙醇的其它因素和培养方式的选择2-苯乙醇的产率还与酵母细胞的生长速率、培养基中L-Phe的浓度和溶氧等因素密切相关.在高氧浓度下,酵母细胞保持高生长速率,代谢旺盛,培养基中如果存在高浓度的L-Phe,就可以形成一种浓度势能,推动其中一部分L-Phe通过艾利希途径高效率转化成为2-苯乙醇,S tark等在L-Phe18.3g/L 高浓度条件下有氧转化,通过测定消耗的L-P he量和得到的2-苯乙醇量比较得出,2-苯乙醇相对于消耗的L-Phe的摩尔产率达到0.93mo l/mo l[19].但由于培养基中仍残留高浓度的L-Phe,因此不宜采取通气连续培养的方式浪费大量的L-Phe.若培养基中L-Phe的浓度较低(小于1.5g/L),即使在有氧环境下,转化率也很低,只能得到微量的2-苯乙醇,当环境氧容量逐渐降低时,转化率逐渐回升,直至无氧条件下,摩尔产率又高达0.93m ol/m o l[19].但当环境氧容量降低时,培养基中乙醇的含量会上升,乙醇是细胞生长的又一抑制剂,虽然其毒性比2-苯乙醇低约20倍,但当乙醇和2-苯乙醇同时存在时,所产生的毒性比两者单独存在时所具有的毒性之和大得多[20],这样将会导致细胞生长缓慢甚至死亡.大部分酵母还具有限制自身呼吸容量的C rabtree效应(酵解抑制有氧氧化),因此即使发酵过程在氧充足的条件下进行,还是会产生乙醇.采用补料分批培养体系,既可将乙醇的产生量控制在毒性范围以下,又可避免L-Phe不必要的浪费.结合使用产物原位转移技术,能使酵母细胞合成2-苯乙醇的能力达到最大,获得高浓度的2-苯乙醇.为了减少培养基中乙醇的生成,还可以选用C rabtree效应阴性菌株例如K.marx i anus、Hansenu l a ano m ala等合成2-苯乙醇[19],这些菌株极有可能在高生长速率下或高氧浓度环境下进行分批培养而不产生乙醇.或是可以用甘油代替葡萄糖作为碳源和能源以避免糖酵解产生乙醇[19].4 生化合成途径的研究与基因工程育种作为利用微生物合成2-苯乙醇的首选途径,艾利希途径在近几年里已在基因水平上得到了广泛而深入的研究,研究的重点在于编码艾利希途径3个步骤中3种酶活性的结构基因及其转录和调控.第一步反应的转氨酶被认为是与菌体的生理生长密切相关[21],它通过与α-酮戊二酸之间的转氨作用与TCA循环紧密联系.而目前吸引绝大多数研究者注意的是第二步反应中苯丙酮酸脱羧酶的基因本质,它是艾利希途径中的关键酶.第三步反应一直被认为是醇脱氢酶催化的步骤,但直到最近,编码这种脱氢酶的结构基因才得到严格的证明.4.1 转氨酶及其基因本质目前已知有两种转氨酶参与了艾利希途径的第一步反应:芳香族氨基转氨酶Ⅰ和芳香族氨基转氨酶Ⅱ,分别由基因ARO8和ARO9编码.芳香族氨基转氨酶Ⅰ能够催化与苯丙氨酸相关的绝大部分转氨反应,它在细胞内普遍存在,是主要的芳香族转氨酶[22].芳香族氨基转氨酶Ⅱ在正常的生长过程中不存在,当细胞缺失aro8基因的情况下,它通过苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸诱导产生,参与转氨反应.诱导作用主要涉及两个因素:基因ARO9的一组上游激活序列和A ro80p蛋白.A RO80基因编码一条950个残基组成的多肽链,通过序列分析表明,此蛋白属于与G a l4p、P rp1p高度相似的Zn2Cys6家族[23],它的N末端是与DNA结合的区域,C末端富含天冬氨酸,大量负电荷构成多个绕线式α-螺旋,此区域介导蛋白质间的相互作用,并赋予此蛋白激活转录的能力.芳香族诱导物通过定位在质膜上的通透酶G ap1p和W ap1p[24]进入细胞,通过与A ro80p的C末端相结合将诱导信号传递至A ro80p.接受了诱导信号的A ro80p通过与A RO9基因上游36 bp序列的结合,激活ARO9表达成为芳香族氨基转氨酶Ⅱ.Ira-qu i等通过试验还证明,A RO9基因上游的36bp序列,含有4个重复的CCG组合,互相间隔7bp,除去此36bp序列后,诱导作用完全消失[25].说明此36bp序列对A RO9诱导表达是必需的,称为上游激活序列.4.2 苯丙酮酸脱羧酶的基因本质酿酒酵母基因组中含有5个可能编码苯丙酮酸脱羧酶活性的基因,包括3个丙酮酸脱羧酶基因PDC1、PDC5、PDC6,以及另外两个认为同样是编码以焦磷酸硫胺素为辅酶的脱羧酶142 应用与环境生物学报 Chi n J App lEnvi ron B i o l 12卷活性的可读框ARO10/YDR380w、TH I3/YDL080c[26].V ura l han 等对苯丙酮酸脱羧酶基因进行了比较详细的研究,他们比较了以L-Phe为氮源和以铵盐为氮源条件下酵母细胞内各基因的转录水平,发现在以L-Phe为氮源条件下,AR O10转录水平比其余4个基因的转录水平高出30倍,而其余4个基因的转录水平之间相差不大.作者进一步通过构建aro10缺陷型菌株,再进行同样的摇瓶培养试验,发现其余4个基因在此条件下并不表现出编码苯丙酮酸脱羧酶活性的能力,证明苯丙酮酸脱羧酶活性主要是由A RO10基因决定的[27].然而,将此缺陷型菌株在限量葡萄糖的恒化器中有氧培养时,表现出另一种苯丙酮酸脱羧酶活性,分析表明,此活性由TH I3和3个PDC基因中任意一个共同编码,且当3个PDC基因同时存在时,PDC5的转录水平最高[27].比较两种苯丙酮酸脱羧酶活性的Km和Vm ax,发现由ARO10编码的酶活符合标准米氏方程曲线,另一酶活表现为一条S形曲线,其Km值比A RO10编码的酶活高出5～8倍[27],故在反应时苯丙酮酸将优先被A RO10编码的酶催化.Iraqu i等研究发现,ARO10基因的上游调节序列与A RO9基因非常相似,也具有36bp的上游激活序列,受A ro80p诱导调控[25].两者的诱导表达还受制于一种铵盐效应,当向生长在次级氮源条件下的细胞加入铵盐时,诱导作用受阻.分析表明,加入的铵盐离子会激发定位于质膜上的通透酶G ap1p和W ap1p快速失活并降解[28],这个过程要求具备N pi1p泛素连接酶以及通透酶C末端的完整性[28,29],通透酶在N pi1p泛素连接酶作用下发生遍在蛋白化作用进而内吞并降解[30].通透酶的失活使芳香族诱导物被隔离在细胞外,无法进入细胞发生诱导作用,从而阻止AR O9、ARO10表达.4.3 醇脱氢酶的基因本质酵母中共含有20个可能具备编码醇脱氢酶活性的基因,包括7个推定的芳香醇脱氢酶基因(A A D基因)[31,32]以及其余13种醇脱氢酶基因:A DH1、A DH2、A DH3、A DH4、A DH5、SFA1、BDH1/Y AL060w、BDH2/Y AL061w、SOR1/Y JR159w、S OR2/ YDL246c、XDH1/Y LR070c、肉桂醇脱氢酶基因C DH1/Y CR105w 以及最近才提出的A DH6/Y MR318c.其中BDH1最近被证明在2,3-丁二醇的合成中起作用[33],BDH2和BDH1具有很大的相似性,而SOR1、SOR2、XDH1编码糖醇脱氢酶活性[34,35], CDH1和A DH6则编码以NADPH为辅酶的酶活[36].因此,可以认为,上述这些基因与2-苯乙醇的合成无关.D ick i nson等对剩余13种基因进行了比较深入的研究,他们采用突变和基因敲除的方法构建出缺失其中一种或多种基因的缺陷型菌株,并对包括2-苯乙醇、异戊醇在内的长链复合醇终产物进行了测试.结果表明:AA D基因在合成过程中不起作用,其功能有待于进一步考证.剩余的6个基因A DH1、A DH2、A DH3、A DH4、A DH5和SFA1,无论是用传统的杂交方法或是从缺陷其中5个基因的缺陷型菌株转化,都无法获得同时缺失这6个基因的单倍体突变株.而其余各种组合方式显示都具有长链复合醇脱氢酶活性[37].因此,只要酵母菌含有A dh1p～A dh5p和S fa1p中的任何一种酶,且此酶能正常工作,就可由此得到长链复合醇.4.4 基因工程育种在对酿酒酵母K-9进行的底物类似物敏感性试验中,Fukuda等对酵母的从头合成途径进行考察,发现1m g/m L对氟苯丙氨酸(PFP)、2m g/m L邻氟苯丙氨酸(O FP)和5mg/mL 间氟苯丙氨酸(M FP)能完全抑制它在YNB琼脂培养基(0.67%无氨基酸的酵母氮碱,2%葡萄糖,2%琼脂)中的生长,向其中加入1m g/m L L-Phe后,抑制解除,说明氟苯丙氨酸和苯丙氨酸在细胞内是一种竞争性抑制的关系.在此基础上,使用乙基甲磺酸作为诱变剂,诱变得到氟苯丙氨酸抗性菌株,这些菌株经过YN B液体培养基培养后对其2-苯乙醇产量进行测定,结果表明,PFP抗性菌株的2-苯乙醇产量提高了近6倍, O FP抗性菌株的2-苯乙醇产量提高了3倍左右,M FP抗性菌株的2-苯乙醇产量无太大变化.通过对突变株稳定性的测试表明,无回复突变现象发生[38].A oki等用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍作为诱变剂处理Z ygos accharo myces roux ii,然后涂布于含2mm o l/L L-脯氨酸作为唯一氮源和100μg/mL对氟苯丙氨酸的培养基中,得到PFP 抗性菌株,此菌株产2-苯乙醇的能力得到大幅度提高.为了检测出突变位点,A oki等对从头合成途径中的4种酶:DAHP合酶、分支酸变位酶、预苯酸脱水酶和预苯酸脱氢酶的酶活进行测定,结果表明,预苯酸脱氢酶被破坏[39].预苯酸脱氢酶是预苯酸转化成为酪氨酸的途径所必须,此酶的破坏导致胞内酪氨酸合成途径终止,酪氨酸浓度降低,解除了它对DAH P合酶和分支酸变位酶的反馈抑制,使预苯酸的浓度增大,同时使大部分预苯酸能转化成为苯丙酮酸,加强了合成2-苯乙醇的途径.Fukuda等通过诱变得到邻氟苯丙氨酸抗性菌株,该菌株解除了酪氨酸对DAHP合酶的反馈抑制.从该菌株的基因组中取得编码DAHP合酶的基因A RO4,通过YCp载体转化进入另一酿酒酵母中,受体酵母也表现出DAHP合酶活性对反馈抑制的不敏感性,同时获得了邻氟苯丙氨酸抗性,提高了2-苯乙醇和酪氨酸的产量[40].5 结语与展望对天然产品需求的激增和由此所带来的可观经济收益使得利用微生物合成天然产品成为重要的研究课题之一.酵母生物转化合成2-苯乙醇具有生产成本低、周期短、污染少、对环境温和等优点,最终必将成为2-苯乙醇生产的主流.特别是我国L-Phe产业已进入年产千吨级水平,使得酵母生物转化合成2-苯乙醇更具有开发价值.国外在对酵母中L-Phe代谢途径的研究,或是对艾利希途径相关基因本质的追寻,以及对2-苯乙醇生物合成产量的研究方面都有很多报道.但目前国内关于这方面的研究还较少,可以预见,该方面的开发研究在我国将会有广阔的前景.R eferences1 C lark GS.Phenethy l alcoho.l P erf um F l avor,1990,15:37～442 E tsc hm ann MMW,B l ue m ke W,S ell D,Sch rader J.B i otec hnological producti on of2-ph eny l et hano.l ApplM icr obi o lB i o t echno l,2002,59:1～83 US Food and D rug Ad m i nistrati on.Code of federal regu l ations of 21CFR101.22,20014 Jolli vetN,Bezenger M C,Vayssier Y,Belin J M.P rodu ction of vol atile co m pounds i n liqu i d cu lt ures by si x s trains of corynef or m bacteria.Appl M i cr obi ol B i otec hnol,1992,36:790～7945 Eh rlich F.Über die Bed i ngungen der Fuselölbil dung undüber i h ren143 1期杨霄等:酵母生物转化生产2-苯乙醇的研究进展 Zusa mm enhang m it de m E i w eiβaufbau der Hefe.B er D tsc h Che m Ges, 1907,40:1027～10476 M iao YY(缪元颖),LiH(李化),Yang 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利用生物质资源进行二代乙醇生产的技术优化研究
利用生物质资源进行二代乙醇生产的技术优化研究二代乙醇是一种可再生的生物质能源，其生产是通过将生物质资源转化为乙醇。
这种能源具有较低的碳排放和环境污染，可以替代传统的化石能源，对于应对全球能源危机和减少温室气体排放具有重要意义。
为了实现二代乙醇的可持续生产，相关技术需要进行优化研究。
首先，生物质资源的选择对于二代乙醇生产至关重要。
生物质资源的选取应基于其可再生性、可持续性以及生产成本。
木质纤维素是最常用的生物质资源之一，可以来自于农作物秸秆、林木废料和纸浆工业废料等。
除了木质纤维素，其他生物质资源如穀物秸稈和水生植物也可以被利用。
优化研究应聚焦于不同生物质资源的可用性、产量和质量等方面，以选择最为适宜的资源。
其次，生物质预处理是二代乙醇生产中的核心步骤之一。
生物质预处理的目标是破碎生物质的结构，使得其中的纤维素和半纤维素更易于被提取和转化为乙醇。
预处理方法包括物理方法（如磨碎、切割和热压等）、化学方法（如酸处理、氧化和脱木质素等）以及生物方法（如微生物发酵和酶处理等）。
优化研究应在保证预处理效果的前提下降低能耗和生产成本，同时考虑对环境的影响。
第三，生物质转化过程中的底物提取是二代乙醇生产技术优化的重点。
底物提取主要针对纤维素和半纤维素，在酶的作用下将其转化为可发酵的糖类。
传统的底物提取方法较为耗能，提取效果不稳定。
优化研究可以考虑使用高效的酶、微生物或者改进酶的固定化技术，提高糖类的提取率和转化效率，降低生产成本。
第四，乙醇发酵过程是二代乙醇生产中必不可少的一步。
优化乙醇发酵的关键是选择高效的发酵菌株，并调控发酵条件。
传统的发酵菌株如酵母菌和大肠杆菌等已经有较成熟的应用，但其产量和产率有限。
优化研究可以探索采用高效的发酵菌株，如工程酿酒酵母、大肠杆菌和放线菌等，通过遗传改造或合成生物学方法提高乙醇产量和产率。
此外，应注意在二代乙醇生产过程中产生的副产物的利用。
副产物如纤维素醇、酸和木质素等可以被进一步转化成具有附加价值的化学品，如生物柴油、生物塑料和化学原料等。
利用酵母细胞生物催化合成2_苯乙醇_梅建凤
文章编号:0253-9837(2007)11-0993-06研究论文:993～998收稿日期:2007-04-20. 第一作者:梅建凤,男,1973年生,博士研究生.联系人:闵 航.Tel /Fax :(0571)88206279;E -mail :minhang @zju .edu .cn . 利用酵母细胞生物催化合成2-苯乙醇梅建凤1,2, 闵 航1, 吕镇梅1(1浙江大学生命科学学院,浙江杭州310058;2浙江工业大学药学院,浙江杭州310032)摘要:比较了13个酵母菌株催化合成2-苯乙醇的活性,确定酿酒酵母菌株的催化活性较高.通过单因素和正交实验对酵母催化合成2-苯乙醇的培养基组成进行了优化,采用优化后的催化合成培养基,2-苯乙醇浓度可达4.654g /L ,摩尔产率为0.63.实验进一步采用Bo x -Behnken 中心组合设计和响应面分析,建立了2-苯乙醇合成浓度与培养基主要组分之间的二次多项式回归模型,该模型具有较高的准确性,可作为生物催化法合成2-苯乙醇培养基的最优化预测模型.由响应面分析及实验验证得出,在最优培养基条件下,2-苯乙醇浓度可达4.815g /L .关键词:2-苯乙醇;生物催化;酿酒酵母;香料中图分类号:O643/TQ 65 文献标识码:ABiocatalytic Synthesis of 2-Phenylethanol by Yeast CellsMEI Jianfeng 1,2,MIN Hang 1＊,L ¨U Zhenmei 1(1College of L ife Science ,Zhejiang University ,Hangzhou 310058,Zhejiang ,China ;2College of Pharmaceutical Science ,Z hejiang University of T echnology ,Hangzhou 310032,Zhejiang ,China )A bstract :The biocatalytic activity of 13yeast strains w as compared for the sy nthesis of 2-phenylethanol ,and a Sac charomyc es cerev isiae strain that had high biocataly tic activity w as screened out .The experiments of sing le factor and orthogonal design were carried out to optimize the composition of the medium for the biosy nthesis of 2-phenylethanol .The results showed that the conc entration of 2-pheny lethanol could reach 4.654g /L with a molar yield of 0.63in the optimized medium .Furthermore ,a model of polynomial reg ressive equation between the 2-phenylethanol concentration and main components in the medium was established after the Box -Behnken central composite desig n and response surface methodology were put into practice .The model exhibited fine ex -actitude and provided a predictive model for optimizing the medium in the biocataly tic synthesis of 2-phenylethanol .Response surface analy sis w as applied to optimize the medium constituents ,and upon applying the optimized medium ,the maxim um 2-phenylethanol concentration of 4.815g /L w as achieved in testing ex -periment .Key words :2-phenylethanol ;biocatalysis ;Saccharomyc es cerev isiae ;perfume 2-苯乙醇是一种具有柔和细腻玫瑰气味的芳香醇,自然界中许多植物因含2-苯乙醇而芳香怡人,如玫瑰、茉莉、黄兰和百合等.2-苯乙醇的香气颇受人们欢迎,是国际香精香料的主流风格,大量应用于玫瑰型及其他类型的香精配方中,在食品和日化用品等领域中也应用广泛.目前,2-苯乙醇主要采用苯-环氧乙烷合成法或氧化苯乙烯加氢法生产,存在诸如原料毒性高、产品纯度低、合成过程污染大等弊端[1～3].随着生活水平的提高和对健康的关注,人们越来越崇尚绿色和天然产品.在欧美国家,能标记为天然的产品必须是采用物理方法从天然材料中提取、酶催化或微生物发酵法生产[4].从玫瑰等植第28卷第11期催 化 学 报2007年11月Vol .28No .11Chinese Journal of CatalysisN ovember 2007物精油中提取天然2-苯乙醇,由于原料来源和提取成本等原因而难以满足市场需求,而生物技术迅猛发展,为天然2-苯乙醇的生产提供了新的途径[5,6]. 发酵食品气味芳香,其香味物质主要是酵母菌在生长过程中合成的2-苯乙醇.酵母菌可以自身合成2-苯乙醇,也可以通过艾氏代谢途径催化胞外的L-苯丙氨酸合成2-苯乙醇[7].因酵母自身合成2-苯乙醇浓度比较低,直接发酵法生产2-苯乙醇的工业化前景不大,而以L-苯丙氨酸为底物,由酵母细胞生物催化合成2-苯乙醇则具有很大的可行性.目前,市场上L-苯丙氨酸多是采用酶法或微生物发酵法生产,属天然产品,且价格低廉,可满足大规模生物催化法生产2-苯乙醇的需要[8].由此可见,采用生物催化法合成2-苯乙醇,产品具有天然属性,气味纯正,还有发酵周期短,生产过程污染小等优点,目前已成为国内外研究的热点. 本文研究了酵母细胞生物催化合成天然2-苯乙醇,首先对多个酵母菌株催化合成2-苯乙醇的活性进行比较,从中筛选作为生物催化剂的酵母菌株,对其催化合成2-苯乙醇的培养基进行优化,旨在提高2-苯乙醇的合成浓度,并采用中心组合设计和响应面分析(response surface analysis)建立2-苯乙醇合成浓度与培养基主要组分之间的回归方程,为生物催化合成2-苯乙醇最优化生产提供预测模型.1 实验部分1.1 2-苯乙醇催化合成 L-苯丙氨酸购自浙江康普达生物科技有限公司,纯度为99.5%;2-苯乙醇标准品购自Sigma公司,纯度为98.0%;其它试剂均为市售分析纯或生物试剂. 酵母斜面和种子培养基:葡萄糖10g/L,蛋白胨5g/L,酵母浸出粉3g/L,pH5.7.生物催化合成初始培养基:蔗糖30g/L,(NH4)2SO46.0g/L,酵母浸出粉2.5g/L,KH2PO45.0g/L,MgSO40.4 g/L,L-苯丙氨酸8.0g/L,pH5.5.培养基pH均为自然状态,121℃灭菌20min. 酵母斜面菌种经活化培养后,挑2～3环菌苔接入种子培养基,于30℃,200r/min的恒温振荡摇床(上海智城分析仪器制造有限公司,HWY2112型)中培养24h.按10%接种量移取新鲜种子液到催化合成培养基中,再加入实验设计浓度的L-苯丙氨酸,三角瓶用8层纱布扎口,于30℃,200r /min 恒温振荡摇床内催化反应40h.1.2 分析方法 生物催化反应结束后,取10ml反应液于5000 r/min的转速下离心20min,取0.5ml上清液到10 ml具塞试管中,再加入0.1ml浓度为20g/L的苯甲醇作内标物,用蒸馏水稀释到10ml,振荡混匀,用微量进样器取2μl进行气相色谱分析.气相色谱仪(上海精密科学仪器有限公司,GC112A型)分析条件为:色谱柱为PEG20M(30m×0.53mm×1.0nm),FID检测器,载气为N2;柱箱温度采用程序控温,初始温度为80℃,初始温度保持时间2min,升温速率为10℃/min,终止温度为220℃,终止温度保持时间为5min;进样口和检测器温度均为250℃[9]. 除菌株筛选和响应面实验外,实验数据均为3次重复的平均值,响应面实验设计和分析采用The SAS System for Window s8.0软件.表1 不同酵母菌株催化合成2-苯乙醇的浓度Table1 The concentration of2-phenylethanol(2-PE)bios ynthesized by different yeast strainsYeast strain2-PE concentration(g/L) Rhdotoru lar Glutinis NH0.557Pichia pas toris BC0.408Cand ida arbovea S J0.241Candida guillier mond M J0.456Can dida tr opica lis AS2.6170.279S por idiobolus johns onii ZB0.262 Kluyveromyces m ar xian us GIM2.1191.310Saccharom yces cerevisiae3141.871Saccharom yces cerevisiae3151.201Saccharomyces cerevisiae BD1.879Saccharomyces cerevisiae BR1.628 Saccharomyces cerevisiae GIM2.351.0512 结果与讨论2.1 高催化活性酵母菌株的筛选 高催化活性酵母菌种是提高催化反应效率的关键.我们收集了多个酵母菌株,特别收集了较多的酿酒酵母(Saccharomyces cerev isiae)菌株,用催化合成反应初始培养基对这些菌株进行筛选,结果见表1.可以看出,不同酵母菌株催化合成2-苯乙醇的活性有很大差异,酿酒酵母的催化活性普遍较高,但不同菌株也有一定的差别,其中酿酒酵母BD菌株催化合成2-苯乙醇浓度相对较高,达到1.879g/L;而其它酵母菌株中,除马克斯克鲁维酵母994催 化 学 报第28卷(K luyveromyces marxianus )外,催化活性都相对较低.因此我们选择酿酒酵母BD 菌株作为实验菌株.2.2 碳源种类及浓度对2-苯乙醇合成的影响 碳源是构成微生物细胞以及代谢产物的物质基础,是发酵培养基的主要成分,其种类和浓度均会影响作为催化剂的酵母细胞的数量.酵母细胞一般容易利用的碳源有葡萄糖、乳糖和蔗糖等,乳糖价格较高,一般不宜用作工业规模的培养基成分,因此实验考察了不同浓度的葡萄糖和蔗糖对2-苯乙醇合成的影响,结果见图1.可以看出,随着培养基中葡萄糖或蔗糖浓度增大,2-苯乙醇合成浓度有所提高,在糖浓度达到100g /L 时,2-苯乙醇浓度达到最大,过高浓度的葡萄糖或蔗糖则不利于酵母催化活性的提高.相同浓度的葡萄糖较蔗糖催化合成2-苯乙醇的浓度高,但差异并不显著,所以我们确定以价格低廉的100g /L 蔗糖为培养基组成的碳源.图1 葡萄糖和蔗糖浓度对2-苯乙醇合成的影响Fig 1 Effect of glucos e and sucrose concentrationon biocatal y tic synthesis of 2-PE(1)Glucose ,(2)Sucros e2.3 (NH 4)2SO 4浓度对2-苯乙醇合成的影响 氮源是微生物培养基的另一主要成分,为微生物细胞合成蛋白质及氨基酸类含氮代谢物提供氮素.实验考察了培养基中(NH 4)2SO 4浓度对2-苯乙醇合成的影响,结果见图2.由图可以看出,在培养基中不加(NH 4)2SO 4的情况下,合成2-苯乙醇的浓度最高,达到了3.749g /L .分析其原因,应该是在酵母以L -苯丙氨酸底物催化合成2-苯乙醇过程中,第一步反应中转氨酶作用下释放的NH 3最终足够作为酵母细胞生长的氮源,因此后续实验中培养基不再添加(NH 4)2SO 4.图2 (NH 4)2S O 4浓度对2-苯乙醇合成的影响Fig 2 Effect of (NH 4)2SO 4concentration onbiocatalytic synthesis of 2-PE2.4 酵母浸出粉浓度对2-苯乙醇合成的影响 酵母浸出粉中含有大量的氨基酸、维生素和微量元素等物质,是微生物培养基常用组分之一,可为微生物细胞生长提供多种生长因子和微量元素.实验考察了培养基中的酵母浸出粉浓度对2-苯乙醇合成的影响,结果见图3.可以看出,培养基中不添加酵母浸出粉,反应液中2-苯乙醇也能达到3.196g /L ,但适量添加酵母浸出粉对2-苯乙醇合成浓度有明显的促进作用,酵母浸出粉添加浓度为5.0g /L 时最高,进一步增加酵母浸出粉浓度,2-苯乙醇浓度开始降低.其原因是酵母浸出粉浓度过高时,培养基中氮素过多,进而影响酵母细胞利用L -苯丙氨酸转氨作用所释放的NH 3.图3 酵母浸出粉浓度对2-苯乙醇合成的影响Fig 3 Effect of yeast extract concentration onbiocatal ytic s ynthesis of 2-PE2.5 磷酸钾盐浓度及pH 对2-苯乙醇合成的影响 磷酸钾盐可以满足酵母生长对磷和钾的需要,实验先考察了KH 2PO 4浓度对2-苯乙醇合成的影响,结果见图4.可以看出,在KH 2PO 4浓度为15g /L (0.11mol /L )时,2-苯乙醇合成浓度达到最高.在此KH 2PO 4浓度下,培养基pH 为5.3,酵母细胞生995第11期梅建凤等:利用酵母细胞生物催化合成2-苯乙醇长时产生的酸可使培养基pH 进一步下降,而过低的pH 必然不利于2-苯乙醇的催化合成.图4 KH 2PO 4浓度对2-苯乙醇合成的影响Fig 4 Effect of KH 2PO 4concentration on biocatalyticsynthes is of 2-PE 在摩尔浓度不变的条件下,我们将KH 2PO 4改为KH 2PO 4和K 2HPO 4两种磷酸盐的混合液,改变两者比例以调节培养基的pH ,不同pH 对2-苯乙醇合成的影响见图5.可以看出,培养基pH 为6.8时,2-苯乙醇合成浓度最高,此时KH 2PO 4和K 2HPO 4浓度均为0.055mol /L (质量浓度分别为7.5和9.6g /L ).培养基中加入等摩尔浓度的KH 2PO 4和K 2HPO 4,不仅可满足酵母细胞生长所需的磷酸盐,还可作为缓冲溶液调节pH ,有利于酵母细胞催化活性的发挥.图5 培养基pH 对2-苯乙醇合成的影响Fig 5 Effect of medium pH on biocatalytic s ynthesis of 2-PE2.6 无机盐浓度对2-苯乙醇合成的影响 实验先后考察了M gSO 4,FeSO 4,ZnSO 4和CaCl 2等无机盐对2-苯乙醇合成的影响.结果表明,仅有M gSO 4对酵母细胞催化合成2-苯乙醇有促进作用,其他几种无机盐都不能明显促进2-苯乙醇的生物催化合成.MgSO 4浓度对2-苯乙醇合成的影响见图6.可以看出,在其浓度高于0.4g /L 时,有利于2-苯乙醇催化合成,但0.4g /L 以上浓度时对2-苯乙醇的催化合成几乎与0.4g /L 时完全相同.图6 MgSO 4浓度对2-苯乙醇合成的影响Fig 6 Effect of M gSO 4concentration on biocatalytics ynthesis of 2-PE图7 底物L -苯丙氨酸浓度对2-苯乙醇合成的影响Fig 7 Effect of substrate concentration on biocatalyticsynthesis of 2-PE2.7 底物浓度对2-苯乙醇合成浓度的影响 作为2-苯乙醇催化合成的底物L -苯丙氨酸浓度至关重要,浓度过低不能充分利用酵母菌的催化能力,浓度过高势必造成转化率低,底物浪费.实验在优化培养基组成后,考察了底物L -苯丙氨酸浓度对2-苯乙醇合成的影响,结果见图7.可以看出,在L -苯丙氨酸浓度低于6.0g /L 时,2-苯乙醇的浓度随底物浓度增加而增加,之后,2-苯乙醇合成浓度几乎不再增加,而摩尔转化率则呈下降趋势.在L -苯丙氨酸浓度为8.0g /L 时,2-苯乙醇浓度达到最高值4.204g /L ,底物浓度继续增加则不能提高2-苯乙醇的浓度,说明酿酒酵母BD 菌株催化合成2-苯乙醇的能力已达到最大.996催 化 学 报第28卷2.8 生物催化法合成2-苯乙醇其它条件优化 经单因素实验对培养基成分进行优化后,2-苯乙醇合成浓度由菌种筛选时的1.879g/L提高到4.204g/L.在此基础上,实验进一步优化了种子培养基组成、反应液装量、振荡转速、催化温度和时间等,并对催化反应培养基中的蔗糖、酵母浸出粉和L-苯丙氨酸浓度进行了正交优化.结果表明,在种子培养基组成为葡萄糖40g/L,蛋白胨20g/L,酵母浸出粉10g/L,反应培养基装量30ml(250ml 三角瓶),振荡转速200r/min,温度30℃,催化反应18h,催化合成培养基中的蔗糖、酵母浸出粉和L-苯丙氨酸的浓度分别为120,5和10g/L时,2-苯乙醇的合成浓度提高到4.654g/L.2.9 蔗糖、酵母浸出粉和L-苯丙氨酸浓度的响应面实验 采用优化后的催化合成培养基,2-苯乙醇的合成浓度有了较大提高,进一步采用响应面分析法考察了2-苯乙醇合成浓度与培养基主要成分间的关系,旨在建立它们之间的回归方程模型,并对模型进行分析,确定最佳培养基组成.实验采用Box-Behnken中心组合设计,以对2-苯乙醇合成有显著影响的蔗糖、酵母浸出粉和L-苯丙氨酸3个因素为自变量,以2-苯乙醇浓度为响应值,设计了3因素3水平响应面分析实验[10],实验的因素与水平选取见表2,15个实验点得出的实验结果见表3.表2 中心组合设计的因素与水平取值Table2 Variables and levels for central composite des ignLevel X1/(g/L)X2/(g/L)X3/(g/L)-1802.5601205.01011607.514 X1S ucrose;X2Yeast extracts;X3L-phenylalanine.表3 中心组合设计及其实验结果Table3 Central composite design and its experiment results Run X1X2X32-PE(g/L) 1-1-104.2472-1103.95731-104.563 41104.37350-1-13.97260-114.631 701-13.748 80114.7469-10-13.509 1010-13.76411-1014.359 121014.795 130004.624 140004.629 150004.679 以2-苯乙醇浓度为响应值,运用响应面分析程序进行回归拟合,各实验因子和响应值之间的关系可用函数表示为:Y=4.644+0.178X1-0.074X2 +0.442X3-0.263X21+0.025X1X2+0.045X1X3 -0.096X22+0.085X2X3-0.274X23. 实验结果的方差分析表明,用上述二次多项式回归方程描述各因子与响应值之间的关系,其应变量与自变量之间的线性关系极为显著(Prob>F= 0.0002,线性相关系数R2=0.9895),表明模型与实际实验值拟合较好,该模型可用于分析和预测生物催化法合成2-苯乙醇的浓度. 对上述回归方程取一阶偏导等于零,得三元一次方程组,求解方程组得X1=0.412,X2=0.044, X3=0.847,即培养基中的蔗糖、酵母浸出粉和L-苯丙氨酸的浓度分别为136.5,5.1和13.4g/L时, 2-苯乙醇浓度有最大值.将各因素值代入回归方程,解得预测2-苯乙醇的最优浓度Y=4.867g/L.为了证实预测的结果,用以上得到的最优配方重复实验3次,得2-苯乙醇平均浓度为4.815g/L,实验值与预测值之间良好的拟合性证实了模型的有效性,回归方程为2-苯乙醇催化合成提供了一个科学的模型.3 结论 利用未优化的培养基筛选出的酿酒酵母BD菌株,其合成2-苯乙醇初始浓度可达1.879g/L,而培养基经单因素和正交实验优化后,2-苯乙醇浓度提高到4.654g/L,再经响应面法优化,最高可达到4.815g/L.这是目前利用半合成培养基,非补料法生物催化合成2-苯乙醇达到的最高浓度.诚然,由于采用的菌种、培养基和培养条件有所不同,不同研究者取得的结果之间没有确切的可比性.本文采用的培养基组成相对简单,便于培养基的配制,但其中的碳源和磷酸钾盐浓度都比较高,这无疑会增加生物催化法合成2-苯乙醇的生产成本,不利于该技术的工业化应用.进一步研究可考虑催化合成过程的技术控制,如采用分批补料和产物原位分离等技术[11,12],降低培养基原料的消耗,提高2-苯乙醇的摩尔产率,探索有利于该技术工业化应用的途径.997第11期梅建凤等:利用酵母细胞生物催化合成2-苯乙醇参考文献1 Fabre C E,Blanc P J,Goma G.Per fum Flavor,1998, 23(3):432 梅建凤,陈虹.微生物学通报(Mei J F,Chen H.Micro-biology),2005,32(2):1143 Clark G S.Per fum Flavor,1990,15(5):374 U S Food and Drug A dministration.Code of Federal Regula-tions,21CFR101,2001.225 K ring s U,Berg er R G.Appl Microbiol Biotechnol,1998, 49(1):16 Savina J P,K ohler D,Brunerie 5965780.19997 Etschmann M M W,Bluemke W,Sell D,Schrader J.Ap-pl Micro biol Biotechnol,2002,59(1):18 Cheetham P S J.Case Studies in the Application of Biocata-ly sts for the Production of(Bio)Chemicals.In:Straathof A J J,A dlercreutz P eds.Applied Biocatalysis.Amsterdam: Harwood,2000.939 Huang C J,Lee S L,Chou C C.J Biosci Bioeng,2000,90(2):14210 Box G E P,Draper N R.Empirical M odel-Building and Response Surfaces.New York:John Wiley&Sons Inc.198711 Stark D,Mǜnch T,Sonnleitner B,M arison I W,von Stockar U.Biotechnol Progr,2002,18(3):51412 Stark D,Ko rnmann H,Mǜnch T,Sonnleitner B,M ari-son I W,von Stockar U.Biotechnol Bio eng,2003,83(4):376(Ed ChRH)《催化学报》2006年影响因子在国内化学类期刊中的排名N o.期刊名称影响因子总被引频次No.期刊名称影响因子总被引频次1燃料化学学报1.106871(16)18化学通报0.5571129(13) 2化学进展0.978737(17)19应用化学0.5201454(7) 3催化学报0.9771462(6)20分析科学学报0.517669(19) 4化学学报0.9682510(3)21结构化学0.508557(20) 5分析化学0.9603423(2)22感光科学与光化学0.503281(29) 6物理化学学报0.9571587(5)23高分子通报0.469516(21) 7分子科学学报0.925251(30)24分子催化0.408457(24) 8高分子学报0.8651452(8)25电化学0.373332(27) 9无机化学学报0.8511597(4)26合成化学0.366414(26)10高等学校化学学报0.7854192(1)27化学研究与应用0.340685(18)11有机化学0.7151175(10)28化学研究0.329190(32)12分析测试学报0.712979(15)29化学试剂0.287498(22)13中国科学B辑0.7051276(9)30Chin J Polym Sci0.263149(34)14分析试验室0.6981113(14)31Chem Res Chin Univ0.250179(33)15环境化学0.6921173(11)32化学与黏合0.242315(28)16煤炭转化0.614469(23)33化学与生物工程0.206223(31)17色谱0.6081130(12)34Chin Chem Lett0.151448(25) 上表数据来自中国科学技术信息研究所2007年11月15日发布的《2007年版中国科技期刊引证报告(核心版)》,括号中的数字为总被引频次的排名.另外,同时发布的还有中国科学技术信息研究所和万方数据股份有限公司编写的《2007年版中国期刊高被引指数》报告,该报告统计了5287种期刊2001～2005年发表的论文在2006年被引用的各项指数,其中化学类期刊共39种.《催化学报》的主要被引指数如下:五年影响因子为1.214,五年被引频次为1144,被引率为0.55,单篇文章最高被引次数为14次,学科高被引文章分布数为8.上述五个指数在39种化学类期刊中的排名分别为第3,第8,第3,第6和第3名.998催 化 学 报第28卷。
生物乙醇技术现状与进展
生物乙醇技术现状与进展生物乙醇是一种以植物或其他生物质材料为原料，通过发酵和蒸馏等工艺生产的乙醇燃料。
相比石油燃料，生物乙醇具有可再生、低碳排放、清洁燃烧等优势，因此在可持续能源发展和减排方面有着重要的地位和巨大潜力。
2020年全球生物乙醇产量约为1050亿升，其中美国、巴西、中国等国家是全球生物乙醇生产的主要国家。
浏览生物乙醇技术的现状与进展，以下几个方面是值得关注的：1.原料选择与开发：生物乙醇的原料主要包括玉米、甘蔗、小麦、木材等。
目前，以玉米和甘蔗为主要原料的生物乙醇工业化生产在全球范围内得到广泛应用，但存在着对粮食资源的竞争以及对土壤和环境的影响。
因此，开发新的生物质资源成为迫切需要解决的问题，例如废弃物、农林剩余物、微藻等都有潜力成为生物乙醇原料。
2.发酵技术改进：发酵是生物乙醇生产的核心步骤，对于提高产量和降低成本具有重要意义。
目前，常见的生物乙醇发酵菌主要包括酿酒酵母，但其对废弃物和木质纤维素等复杂底物的利用能力有限。
因此，研究人员通过基因工程、杂交育种等手段，改进发酵菌的抗性能力和底物适应性，提高发酵效率。
3.技术集成与共生发酵：采用共生发酵技术可以利用底物的多种组分，生产多种附加产品，提高资源利用效率。
例如，将生物乙醇生产与生物氢、生物丁醇等其他生物质燃料生产相结合，能够提高资源的综合利用效率，促进循环经济发展。
4.生物乙醇纯化技术改进：生物乙醇的纯化是保证其质量和燃烧效率的重要环节。
传统的蒸馏和萃取等方法需要大量的能量和化学试剂，对环境造成一定的压力。
因此，研究人员致力于开发低能耗、低成本的纯化技术，例如膜分离、离子液体等新技术，以实现生物乙醇快速高效纯化。
5.生物乙醇与燃料电池的结合：生物乙醇是一种燃料电池的理想燃料，可以通过与燃料电池技术的结合，实现乙醇的直接转换为电能，从而提高能源利用效率和减少碳排放。
近年来，研究人员不断改进生物乙醇燃料电池的催化剂和电极材料，提高其效率和稳定性。
生物过程—生物催化法生产2-苯乙醇的研究现状
Bioprocess 生物过程, 2012, 2, 89-97doi:10.4236/bp.2012.22015 Published Online June 2012 (/journal/bp)The Study of Biotechnological Production of 2-Phenylethanol*Mingle Cao2, Xinglin Jiang1, Haibo Zhang1, Mo Xian1, Feng Huang21Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao2State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Ji’nanEmail: zhanghb@Received: Feb. 21st, 2012; revised: Mar. 14th, 2012; accepted: Mar. 24th, 2012Abstract: 2-Phenylethanol (β-Phenylethanol) is aromatic flavour and fragrance compound with an elegant, fine, endure, rose-like odour. It can be used as additives in perfume, cosmetic, food industries. It also can be used as pharmaceutical intermediates and fine chemicals. So far, 2-PE is mainly produced chemically. The biosynthesis of 2-PE is receiving more attentions, because of its low energy consumption, environmentally friendly, and the demand for the “natural” 2-PE. This review introduces the production of 2-PE especially the biosynthesis method, metabolic pathway, and fer-mentation method.Keywords: 2-Phenylethanol; Spices; Bio-Catalytic; Ehrlich Pathway; ISPR生物催化法生产2-苯乙醇的研究现状*曹明乐2，姜兴林1，张海波1，咸漠1，黄峰21中国科学院青岛生物能源与过程研究所，青岛2山东大学，微生物技术国家重点实验室，济南Email: zhanghb@收稿日期：2012年2月21日；修回日期：2012年3月14日；录用日期：2012年3月24日摘要：2-苯乙醇(2-Phenylethanol)也叫β-苯乙醇，英文简称2-PE，具有淡雅、细腻、持久、玫瑰香味的芳香族香气物质。
大肠杆菌2--苯乙醇合成途径的构建和优化
大肠杆菌2--苯乙醇合成途径的构建和优化
近年来由于能源价格上涨以及环境保护意识加深，生物合成芳香族化合物受到了极大的关注，大肠杆菌2在苯乙醇合成途径的构建和优化成为了研究的热点。
首先，通过遗传工程的方法来构建一条苯乙醇合成途径，并将大肠杆菌2作为载体基因组来进行转基因。
使用噬菌体izf1和事件C58-3载体表达系统，目前已经在大肠杆菌2中构建出高效的苯乙醇生产途径。
其次，通过优化细菌代谢物质代谢路线，提高苯乙醇的生产率，可以合理分配2-羟丙腈的浓度和形态，促进胞外糖醛的逆流，并实现两个细菌酶在相同条件下的有效协同作用。
此外，质量控制的重要性也不容忽视，对大肠杆菌2而言，主要是控制批次培养的环境参数，促进其生物活性中细胞膜的形成和运转，以及结构稳定性和功能维持。
最后，合理设计生产过程，比如采用培养瓶结晶反应法，以确保实验条件的一致性，同时减少产Material损失，并减少收集和纯化产物的工作量。
综上所述，经过构建和优化，大肠杆菌2的苯乙醇合成途径可以得到高效的生产，为芳香族化合物的生物合成提供有力的支撑，也为高校的相关科研提供了可行的方案。
中国β-苯乙醇行业市场环境分析
中国β-苯乙醇行业市场环境分析1. 简介β-苯乙醇，又称为苯基乙醇或2-苯乙醇，是一种常用的化学品。
它具有溶解性强、稳定性好等特点，在药品、化妆品、生物化学等领域有广泛的应用。
本文将对β-苯乙醇市场环境进行分析，包括市场规模、竞争态势、发展趋势等方面。
2. 市场规模β-苯乙醇市场的规模主要受到需求量的影响。
目前，全球化妆品和药品行业的快速发展推动了β-苯乙醇市场的增长。
据统计，2019年全球β-苯乙醇市场规模达到XX 万吨，价值约XX亿元。
预计未来几年，市场规模将进一步扩大。
3. 竞争态势β-苯乙醇市场存在一定的竞争，主要来自国内外的企业。
国内企业包括XX公司、XX集团等，它们拥有成熟的生产技术和完善的销售网络。
国外企业如XX公司、XX公司等，获得了全球化的市场份额。
在竞争中，企业需要提高产品质量、创新技术以及提供差异化的服务，以保持竞争优势。
4. 发展趋势（1）创新技术：随着科技的进步，新的生产技术和工艺不断涌现，使得β-苯乙醇的生产更加高效和环保。
企业应该不断关注和采纳新的技术，提高产品质量和降低生产成本。
（2）市场多元化：除了传统的化妆品和药品行业，β-苯乙醇的应用领域正在不断扩展。
例如，在新型能源领域中，β-苯乙醇可以作为合成液体燃料的原料。
企业应该积极开拓新的市场，寻找更多的应用领域。
（3）可持续发展：环境保护和可持续发展是未来发展的重要趋势。
企业在生产过程中应该注重环境保护，采用清洁生产技术，减少对环境的负面影响。
此外，企业还应该加大研发力度，推动生态友好型产品的开发和应用。
5. 总结β-苯乙醇市场正处于快速发展阶段，市场规模逐年扩大。
竞争态势较为激烈，企业需要不断提高竞争力。
未来的发展趋势包括创新技术、市场多元化和可持续发展。
企业应该根据市场需求和趋势，制定合适的发展战略，提高自身竞争力和市场份额。
2024年合成乙醇市场发展现状
2024年合成乙醇市场发展现状引言乙醇是一种重要的化工原料，广泛用于燃料、溶剂、消毒剂和药物等领域。
传统上，乙醇主要通过天然发酵生产，如农作物和食物加工废弃物等。
然而，随着科技的进步，合成乙醇的技术也得到了快速发展。
本文将对合成乙醇市场的发展现状进行综合分析和讨论。
1. 合成乙醇的生产技术1.1 传统乙醇发酵法传统乙醇发酵法是一种利用微生物（如酵母菌）将可糖化物质转化为乙醇的方法。
这种方法适用于农作物废弃物和食品加工废弃物等可再生材料。
然而，传统乙醇发酵法的生产过程相对复杂，生产效率较低。
1.2 合成乙醇法合成乙醇法是一种通过化学反应将天然气或石油等碳氢化合物转化为乙醇的方法。
该方法通过催化剂和高温高压条件下的合成反应实现。
合成乙醇法具有生产效率高、原料来源广泛和生产成本低等优势，在工业生产中得到了广泛应用。
2. 合成乙醇市场的发展现状2.1 产能和产量随着合成乙醇技术的不断进步，全球合成乙醇的产能和产量也在持续增长。
当前，美国、巴西和中国是全球合成乙醇的主要生产国家。
其中，美国和巴西主要采用生物质发酵法生产乙醇，而中国则主要采用合成乙醇法生产乙醇。
2.2 消费市场合成乙醇主要用于汽油混合物、溶剂和化工原料等领域。
当前，汽车工业是合成乙醇消费的主要市场。
随着环保意识的增强和低碳经济的推动，合成乙醇在燃料替代领域有着广阔的应用前景。
另外，合成乙醇还广泛应用于化学工业，如溶剂和药物等。
2.3 市场竞争和趋势当前，合成乙醇市场竞争激烈。
全球许多国家都在加大合成乙醇的生产和研发力度。
美国、巴西、中国和印度等国家在合成乙醇市场中具有较强的竞争力。
此外，可再生能源的发展和政府政策的支持也促进了合成乙醇市场的增长。
3. 合成乙醇市场的挑战和机遇3.1 环境影响合成乙醇的生产和使用对环境有一定的影响。
传统乙醇发酵法生产乙醇会产生大量废物和二氧化碳等气体排放，加剧温室效应和全球变暖。
另一方面，合成乙醇法使用化石燃料作为原料，也会增加对化石能源的依赖。
利用酵母细胞生物催化合成2-苯乙醇
项 式 回归 模 型 ， 模 型具 有 较 高 的 准 确 性 ， 作 为 生 物催 化 法 合 成 ２苯 乙 醇 培 养 基 的 最 优 化 预 测 模 型 ．由 响 应 面 分 析 及 实 验 该 可 一
验证 得 出 ， 最 优 培 养 基 条 件 下 ， 一 乙 醇浓 度 可 达 ４ ８ ５ｇ Ｌ 在 ２苯 ． １ ／ ． 关键 词 ： 一 乙 醇 ； 物 催 化 ；酿 酒 酵母 ； 料 ２苯 生 香
Ｓ ｃ ｈ ｏ ｃ ｓｃ ｒ ｖｉｉ ｔａ ｎ ｔ ｔ ｈ ｄ ｈｉ ｉ ｃ ｔ ｌ ｉ ｃ ｉ ｉｙ ｗ ａ ｃ ｅ ｎ ｄ ｏ ． Ｔ ｈ ｘ ｅ ｉ ｅ ｔ ｆｓｎ ｌ ａ ｃ ａｒ ｍｙ ｅ ｅ ｅ ｓａｅ ｓ ｒ ｉ ｈａ ａ ｇｈ ｂ ｏ ａ ａｙｔｃ ａ ｔｖ ｔ ｓ ｓ ｒ ｅ ｅ ｕｔ ｅ ｅ ｐ ｒｍ ｎ ｓｏ ｉ ｇ ｅ ｆ ｃｏ ｎ ｒｈ ｇ ａ ｅ ｉ ｎ ｗ ｅ ｅ ｃ ｒ ｉｄ ｏ ｔ ｔ ｐ ｉ ｉｅ ｔ ｏ ｐ ｓｔｏｎ ｏ ｈ ｅ ｉ ａ ｔ ｒａ ｄ ｏ ｔ ｏ ｏｎ ｌｄ ｓｇ ｒ ａ ｒｅ ｕ ｏ ｏ ｔｍ ｚ ｈｅｃ ｍ ｏ ｉｉ ｆｔ ｅ ｍ ｄｕｍ ｏ ｈ ｏ ｙ ｈｅ ｉ ｆ ｆ ｒｔ ｅ ｂｉｓ ｎｔ ｓｓ ｏ ２ ｐｈ ｎ ｌｔ ａ ｏ ． Ｔｈｅ ｒ ｓ ｔ ｈ ｗ ｅ ｈ ｔ ｔ ｅ ｃ ｎ ｅ ｔ ａ ｉｎ ｏ 一 ｈ ｎｙｅ ｈａ ｏｌｃ ｕｌ ｅ ｃ ６５ Ｌ ｉｈ ａ 一 ｅ ｙｅｈ ｎ １ ｅ ｕｌｓ ｓ ｏ ｄ ｔ ａ ｈ ｏ ｃ ｎ ｒ ｔｏ ｆ ２ ｐ ｅ ｌｔ ｎ ｏ ｄ ｒ ａ ｈ ４． ４ ｇ／ ｗ ｔ ｍ ｏａ ｉｌ ｆ０． ３ ｉ ｈｅｏｐ ｉ ｉｅ ｅ ｉ ｍ ． Ｆｕｒｈ ｒ ｏ ｅ，ａ ｍ ｏ ｅ ｆｐ ｌ ｎ ｍ ｉ ｌｒ ｇ ｅ ｓｖ ｑ ａ ｉ ｎ ｂｅ ｗｅ ｎ ｌｒｙ ｅｄ ｏ ６ ｎ ｔ ｔｍ ｚ ｄ ｍ ｄ ｕ ｔｅｍ ｒ ｄ ｌｏ ｏ ｙ ｏ ａ ｅ ｒ ｓ ｉ ｅ ｅ ｕ ｔｏ ｔ ｅ ｔ ｅ ２一 ｅ ｌｔ ａ ｏ ｏ ｅ ｒ ｔｏ ｎｄ ｍ ａｎ ｃ ｍ ｐ ｎ ｎｔ ｎ ｔ ｅ ｍ ｅ ｉ ｍ ａ ｓａ ｉｈｅ ｆｅ ｈ ｈ ｐｈ ｎｙ ｅ ｈ ｎ ｌｃ ｎｃ ｎｔａ ｉ ｎ ａ ｉ ｏ ｏ ｅ ｓ ｉ ｈ ｄ ｕ ｗ ｓ ｅ ｔｂｌ ｓ ｄ ａ ｔ ｒ ｔ ｅ Ｂｏｘ Ｂｅ ｋ ｎ — ｈｎ ｅ ｃ ｎｔａ ｏ ｐ ｓｔ ｅ ｉｎ ａ ｄ ｒ ｓ ｏ ｓ ｕ ｆ ｃ ｅ ｈ ｄ ｌ ｇ ｅ ｅ ｐ ｎｔ ｒ ｃ ｉｅ．Ｔ ｈ ｏ ｅ ｘ ｂｉｅ ｉ ｅ ｅ ｅ ｒ ｌｃ ｍ ｏ ｉｅ ｄ ｓｇ ｎ ｅ ｐ ｎ ｅ ｓ ｒａ ｅ ｍ ｔ ｏ ｏ ｏ ｙ ｗ ｒ ｕｔｉ ｏ ｐ ａ ｔｃ ｅ ｍ ｄ ｌ ｈｉ ｔｄ ｆｎ ｘ— ｅ ａ ｔｔ ｄ ａ ｄ ｐ ｏ ｄ ｄ ａ ｒ ｄｉｔｖ ｍｏｄ ｌ ｏ ｏ ｔｍ ｉｉｇ ｈ ｍ ｅ ｉ ｍ ｉ ｔ ｅ ｃ ｉｕ ｅ ｎ ｒ ｖｉｅ ｐ ｅ ｃ ｉ ｅ ｅ ｆ ｒ ｐ ｉ ｚｎ ｔ ｅ ｄｕ ｎ ｈ ｂｉｃ ｔ ｌ ｔｃ ｙ ｔ ｅ ｉ ｏ ２ ｏ ａ ａ ｙ ｉ ｓ ｎ ｈ ｓｓ ｆ 一 ｐｈ ｎｙｅ ｈ ｎ １ Ｒｅ ｐ ｓ ｕ ｆ ｃ ｎ ｌ ｓｓ ｗ ａ ｐ ｌｅ ｏ ｏ ｉ ｉｅ ｔ ｅ ｕ ｃ ｎ ｔｔ ｅ ｔ ， ａ ｄ ｕｐ ｐ ｌ ｉｇ ｅ ｌｔ ａ ｏ ． ｓ ｏｎ ｅ ｓ ｒａ ｅ ａ ａ ｙ ｉ ｓ ａ ｐ ｉｄ ｔ ｐｔｍ ｚ ｈｅ ｍ ｄｉ ｍ ｏ ｓ ｉｕ ｎ ｓ ｎ ｏｎ ａ ｐ ｙｎ ｔ ｅ ｏ ｔｍ ｉｅ ｅ ｉ ｍ ．ｔ ｅ ｍａ ｍ ｕ ２ ｐ ｅ ｙ ｅ ｈａ ｏ ｏ ｅ ｒ ｔｏ ｆ４． １ Ｌ ａ ｃ ｅ ｄ ｉ ｅ ｔｎ ｘ— ｈ ｐ ｉ ｚ ｄｍ ｄｕ ｈ ｘｉ ｍ 一 ｈ ｎ ｌ ｔ ｎ ｌｃ ｎｃ ｎｔａ ｉ ｎ ｏ ８ ５ ｇ／ ｗ ｓ ａ ｈｉｖｅ ｎ ｔ ｓ ｉ ｇ ｅ
植物和微生物合成2-苯乙醇的研究进展 (2)
中．与化学合成法相比，生物合成具有毒性小，环境 污染少，产品纯净等优点． 在植物方面，某些关键性的酶（如ＡＡＤＣｓ和 ＰＡＲ）的相关基因的发现和研究为调控２－苯乙醇在 植物体内的合成奠定了基础． 在微生物方面，我国生产Ｌ一苯丙氨酸已进入产 业化规模，为微生物发酵合成天然２．苯乙醇提供了 基础．目前发酵２．苯乙醇工艺所需要解决的技术问 题是产物抑制效应．为提高了生物合成２一苯乙醇的 产量，一方面可以通过筛选２一苯乙醇高耐受性菌 株，另一方面可以通过补料分批发酵和原位分离技 术来降低发酵液中２．苯乙醇的产物抑制作用．因 此，若能将原位分离技术与高产量菌株和高效发酵 工艺有效结合，将有望实现微生物转化合成２一苯乙 醇的工业化生产．
ｇ／Ｌ．Ｅｔｓｃｈｍａｎｎ等…。在２００６年用Ｋ．ｍａｒｘｉａ． ＣＢＳ６００发酵２一苯乙醇，为消除终产物２．苯乙醇
对细胞生长的毒性，在培养过程中用聚丙二醇１２００ 作为提取剂，可使有机相中的２．苯乙醇产量提高到
２６．５
ｇ／Ｌ．梅建凤等‘１ ８。研究了生物转化２一苯乙醇在
水／有机溶剂两相体系中合成工艺，实验结果说明，油 酸是两相体系的最佳萃取溶剂，但油酸可能会导致反 应体系的溶氧降低，所以可以考虑在加入油酸的同时， 适当的增加体系中的通氧速率．同时，有机萃取有几个 缺点：１）萃取剂如油酸的沸点高，在２８６℃（１００
苯丙氨酸）确定了在番茄中２一苯乙醇的合成途径： 首先，ＡＡＤＣ（芳香族氨基酸脱羧酶）催化苯丙氨酸 转化为苯乙胺；其次，ＭＡＯ（单胺氧化酶）催化苯乙 胺生成苯乙醛；最后，经ＰＡＲ（苯乙醛还原酶）催化 转化为２一苯乙醇．在整个反应过程中，关键酶包括
收稿日期：２０１３—０５—２７ 作者简介：黄友和，男，工程师，硕士，主要从事生物香料的研究与开发工作； ＋姜兴涛，男，高级工程师，主要从事天然风味化学成分的研究与开发工作．通讯作者
生物转化法合成2-苯乙醇的研究进展
生物转化法合成2-苯乙醇的研究进展丁东栋;崔志峰;徐翔;汪琨;朱廷恒【摘要】2-phenylethanol (2-PE) as an aromatic alcohol with a rose-like fragrance was widely used in food,cosmetic and pharmaceutical industry.However,the yield of natural 2-PE extracted from the certain flowers was low and its extraction process was costly.Therefore,the production of 2-PE by microorganisms became the hot spot of research.In this paper,recent strategies for improving 2-PE production by microbial biotransformation were reviewed,especially the strain screening for high yield and fermentation process optimization,moreover,the future research was proposed.It would provide reference for the production of 2-PE by microorganisms.%2-苯乙醇(2-phenylethanol,2-PE)是具有玫瑰香味的芳香醇,在食品、化妆品以及药品领域有着广泛的应用.但是从植物花卉中提取的天然2-苯乙醇产量低,成本高.目前,用微生物转化生产“天然”2-苯乙醇越来越受到关注.本文对近年来国内外报道的提高微生物转化合成2-苯乙醇产量的研究,尤其是生产菌株选育和发酵工程优化的研究进行了综述,并提出今后研究的新思路,旨在为利用微生物发酵进行2-苯乙醇生产提供参考.【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2017(047)002【总页数】8页(P53-60)【关键词】2-苯乙醇;生物转化法;菌株选育;发酵条件优化【作者】丁东栋;崔志峰;徐翔;汪琨;朱廷恒【作者单位】浙江工业大学生物工程学院,杭州310004;浙江工业大学生物工程学院,杭州310004;浙江工业大学生物工程学院,杭州310004;浙江工业大学生物工程学院,杭州310004;浙江工业大学生物工程学院,杭州310004【正文语种】中文2-苯乙醇(2-Phenylethanol，简称2-PE)，分子式为C10H8O，分子量为122.17，是一种具有愉悦而持久玫瑰香味的高级芳香醇，自然存在于许多植物叶、花及提取的精油中，其对碱和氧的作用都很稳定。
生物转化法生产2-苯乙醇动力学研究
生物转化法生产2-苯乙醇动力学研究
梅建凤;王鸿;易喻;陈建澍;应国清
【期刊名称】《化学工程》
【年(卷),期】2010(38)5
【摘要】考察了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在5 L发酵罐中转化生成2-苯乙醇过程中的菌体生长、产物生成和基质消耗的变化规律,并基于得到的实验数据,建立了转化过程中菌体生长的Logistic模型、2-苯乙醇生成的Luedeking-Piret模型和蔗糖消耗的Luedeking-Piret相似模型.将3个动力学模型的理论值和实验值进行了比较,表明模型具有较高的拟合精度,能准确反映2-苯乙醇生物转化过程及其动力学特征,可用于酿酒酵母转化生产2-苯乙醇过程的预测.
【总页数】4页(P72-75)
【作者】梅建凤;王鸿;易喻;陈建澍;应国清
【作者单位】浙江工业大学,药学院,浙江,杭州,310032;浙江工业大学,药学院,浙江,杭州,310032;浙江工业大学,药学院,浙江,杭州,310032;浙江工业大学,药学院,浙江,杭州,310032;浙江工业大学,药学院,浙江,杭州,310032
【正文语种】中文
【中图分类】TQ920.6
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马克斯克鲁维酵母生物转化2-苯乙醇工艺优化及耐高温特性分析
马克斯克鲁维酵母生物转化2-苯乙醇工艺优化及耐高温特性分析牛明福;李亚恒;陈金帅;李阳【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2018(044)002【摘要】以耐高温的马克斯克鲁维酵母LY1为试验菌株,通过单因素试验和响应面法分析培养基主要成分L-苯丙氨酸、碳源、氮源等对天然香料2-苯乙醇合成的影响,优化结果为:L-苯丙氨酸8.39 g/L,蔗糖43.25 g/L,酵母浸粉6.68 g/L,2-苯乙醇产量达到1.450 g/L,较优化前提高了51.0％.进一步对LY1菌株进行耐受性能和高温发酵性能分析,结果表明,36℃时对2-苯乙醇耐受的质量浓度为2.0 g/L,42℃高温时为1.5 g/L,合成2-苯乙醇的最佳温度范围为28～32℃,42℃时2-苯乙醇产量为0.809 g/L.【总页数】6页(P15-20)【作者】牛明福;李亚恒;陈金帅;李阳【作者单位】河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳,471023;洛阳市微生物发酵工程技术研究中心,河南洛阳,471023;河南科技大学,微生物资源开发与利用重点实验室,河南洛阳,471023;河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳,471023;河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳,471023;河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳,471023;洛阳市微生物发酵工程技术研究中心,河南洛阳,471023;河南科技大学,微生物资源开发与利用重点实验室,河南洛阳,471023【正文语种】中文【相关文献】1.马克斯克鲁维酵母Y51-6发酵稀奶油工艺优化及挥发性风味成分分析 [J], 王丹;李伟;芮昕;马宇潇;徐笑;黄璐;吴寒;董明盛2.一株马克斯克鲁维酵母菌的生长及酒精发酵特性分析 [J], 陈文静;柏永昊;杨团元;缪礼鸿3.耐高温马克斯克鲁维酵母菌剂固体发酵工艺优化 [J], 陈瑾;陈丹;刘晓红;缪礼鸿4.耐高温马克斯克鲁维酵母菌剂固体发酵工艺优化 [J], 陈瑾;陈丹;刘晓红;缪礼鸿;5.马克斯克鲁维酵母与酿酒酵母混合发酵对液态法黄酒风味的影响 [J], 刘梦;缪礼鸿;刘蒲临;王霜;高瑞杰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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Bioprocess 生物过程, 2012, 2, 89-97doi:10.4236/bp.2012.22015 Published Online June 2012 (/journal/bp)The Study of Biotechnological Production of 2-Phenylethanol*Mingle Cao2, Xinglin Jiang1, Haibo Zhang1, Mo Xian1, Feng Huang21Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao2State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Ji’nanEmail: zhanghb@Received: Feb. 21st, 2012; revised: Mar. 14th, 2012; accepted: Mar. 24th, 2012Abstract: 2-Phenylethanol (β-Phenylethanol) is aromatic flavour and fragrance compound with an elegant, fine, endure, rose-like odour. It can be used as additives in perfume, cosmetic, food industries. It also can be used as pharmaceutical intermediates and fine chemicals. So far, 2-PE is mainly produced chemically. The biosynthesis of 2-PE is receiving more attentions, because of its low energy consumption, environmentally friendly, and the demand for the “natural” 2-PE. This review introduces the production of 2-PE especially the biosynthesis method, metabolic pathway, and fer-mentation method.Keywords: 2-Phenylethanol; Spices; Bio-Catalytic; Ehrlich Pathway; ISPR生物催化法生产2-苯乙醇的研究现状*曹明乐2，姜兴林1，张海波1，咸漠1，黄峰21中国科学院青岛生物能源与过程研究所，青岛2山东大学，微生物技术国家重点实验室，济南Email: zhanghb@收稿日期：2012年2月21日；修回日期：2012年3月14日；录用日期：2012年3月24日摘要：2-苯乙醇(2-Phenylethanol)也叫β-苯乙醇，英文简称2-PE，具有淡雅、细腻、持久、玫瑰香味的芳香族香气物质。
2-苯乙醇可以作为香料广泛应用于香水、化妆品、食品等行业，此外2-苯乙醇在医药中间体及精细化工等行业也有重要的开发价值。
目前2-苯乙醇主要是通过化学方法合成，生物催化法具有能耗低、环境污染小及人们对“天然”产品的要求也越来越高使得生物催化法来合成“天然”的2-苯乙醇受到越来越多的重视。
本综述主要介绍了2-苯乙醇的合成现状，并且着重对生物合成方法、代谢途径及当前发酵方法优缺点进行了论述。
关键词：2-苯乙醇；香料；生物催化；艾利氏途径；原位萃取1. 引言2-苯乙醇是一种具有玫瑰花香味的芳香醇[1]，中文名称有：β-苯乙醇，苯乙醇，苄基甲醇，β-苯基乙醇，2-苯基乙醇；英文名称有：Phenethyl alcohol，Benzeneethanol，2-Phenylethanol，2-Phenylethyl al-cohol，β-Phenylethanol，β-Phenylethyl alcohol，Benzyl -carbinol，β-Hydroxyethylbenzene。
2-苯乙醇最早是作为玫瑰花中特征性的香气化合物被发现的[2]。
在大马士革玫瑰的香精油中，2-苯乙醇占到其总挥发物含量的60%以上[3]。
2-苯乙醇由于具有玫瑰花的芳香而备受人们欢迎和喜爱，使2-苯乙醇成为在香水和化妆品行业中应用最广泛的香料化合物[4]。
此外，2-苯乙醇还作为香精广泛应用在食品行业中，如饮料、面包、饼干、口香糖等。
*基金项目：Y112131105，Y2008B43。
据估计在1990年全球市场对2-苯乙醇的销售量大约为7000 t·a−1[5]。
目前市场上的2-苯乙醇主要是靠化学合成方法生产的，但由于2-苯乙醇的应用领域而使人们更倾向于使用“天然”来源的2-苯乙醇；而且利用标记为“天然”的原材料来合成的2-苯乙醇价格要远高于化学法合成的2-苯乙醇。
其差别在于生产方法不同，在欧美国家标记为“天然”的香料在生产时必须利用天然原材料通过物理方法，酶催化方法及微生物转化法来生产[6]。
在2002年全球“天然”2-苯乙醇的全球市场销售只有0.5 t，其价格在US $1000 kg−1左右[1,7]。
这篇综述将从2-苯乙醇的生产方法、生物合成、生理学作用以及应用等方面对2-苯乙醇进行详细的总结。
2. 苯乙醇的性质及化学合成法2.1. 2-苯乙醇的性质2-苯乙醇的分子式为C8H10O，分子量122.17，外观呈无色至淡黄色液体，色泽不超过4号色标。
具有新鲜面包香、清甜的玫瑰样花香，易溶于醇、醚，一升水中大约能够溶解19 g苯乙醇。
其在空气中的嗅觉阀值为12~24 ng/L，在水中时嗅觉阀值在1000 µg/L 左右。
2.2. 化学法合成2-苯乙醇化学法合成2-苯乙醇主要有三条路线。
第一条是以苯乙烯为原料合成2-苯乙醇。
首先是将苯乙烯氧化为环氧苯乙烷，然后环氧苯乙烷在铂等催化剂催化下加氢生成2-苯乙醇[8]。
第二条是以苯为原料的Friedel-Craft反应。
苯和环氧乙烷在以氯化铝为催化剂条件下反应，最后反应产物水解生成2-苯乙醇。
这个反应在1925年最先由Schaarschmidt发现[9]。
这两条路线图如图1所示。
第三种方法是回收氧化丙烯的副产物。
在低于环境压力下，于150℃~250℃之间时用无机强酸对氧化丙烯的残余副产物进行脱水，可以产生苯乙烯并回收得到2-苯乙醇[1]。
化学法合成的2-苯乙醇产品纯度较低，纯化难度较大，产物中往往混合一些难以除去的副产物以及有毒有害的重金属催化剂等杂质，达不到食品级的要求。
如果进行进一步的分离纯化又会大大增加生产成本，而且往往效果很不理想。
而且化学催化底物转化率低，常需要高温高压等苛刻的工业条件，对设备的要求较高。
化学法合成的2-苯乙醇达不到欧洲和美国食品药品管理局的“天然”标准，因此产品售价低廉，市场竞争力弱。
2008年1月份化学合成的2-苯乙醇国际市场价格为5.5美元[11]，价格不到“天然”2-苯乙醇的百分之一。
3. 苯乙醇的天然来源及生理学作用3.1. 2-苯乙醇的天然来源天然2-苯乙醇主要存在于花类和一些植物的香精油中，比如玫瑰、康乃馨、风信子、苹果、香蕉、杏仁、桃、梨、草莓、可可、茉莉花、阿勒颇松树、水仙花、橙花、铃兰、天竺葵、百合花、茶叶和烟草等，在蜂蜜中也含有2-苯乙醇。
但是天然2-苯乙醇在植物中含量极少，只有在玫瑰花的玫瑰精油中含量较高，在一些品种的玫瑰花中，2-苯乙醇的含量甚至可以达到玫瑰精油总量的一半以上。
目前生产“天然”2-苯乙醇主要有两种方法，一种是较古老的方法，即直接从植物的香精油中提取；另一种是以细胞为生物化剂，在生物反应器中生产。
其中，前者必须从催Figure 1. Styrene oxide reduction for 2-PE synthesis and the main product. Friedel-Craft reaction for 2-PE synthesis[1]图1. 环氧苯乙烷催化加氢反应的主要产物(styrene oxide，环氧苯乙烷；2-phenylethanol，2-苯乙醇；1-phenylethanol，1-苯乙醇；phenylacetaldehyde，苯乙醛)[10]合成2-苯乙醇的Friedel-Craft反应[1]玫瑰花植物体内提取，受到原材料供给和价格的影响，产品生产呈现季节性特点而导致较高的成本，并且产品产量很低远远满足不了市场需求。
而使用微生物催化法来替代从植物中直接提取可以大大的降低生产的成本。
后者主要有两种生物细胞催化法，目前最常用的就是以酵母细胞为生物催化剂，通过Ehrlich 途径以L-苯丙氨酸为底物来生产2-苯乙醇[12]；另一条在日本相关文献中报道较多的途径是以玫瑰花植物原生质体通过莽草酸途径来合成2-苯乙醇[13]。
3.2. 2-苯乙醇的生理学作用3.2.1. 抗菌活性在1962年Berrah等人就已经发现0.25%浓度的2-苯乙醇就能明显抑制革兰氏阴性菌的生长，抑制机制是2-苯乙醇能够抑制菌体中DNA的合成[14]。
1967年Silver等人对E. coli进行的研究表明，2-苯乙醇抑制机制是能够使细胞的渗透性屏障崩溃，首先是使细胞膜崩解，改变细胞膜功能，随后才是抑制核酸合成和其它的细胞功能[15]。
1982年Sasser等人的实验表明，1.024 g/L以上浓度的2-苯乙醇可以明显抑制烟草中Pseudomonas pisi的菌体活性[16]。
2003年Fraud更进一步研究了2-苯乙醇对革兰氏阴性菌，球菌和杆菌的抑制[17]。
2-苯乙醇植物果实、鲜花等有保护作用，机制是2-苯乙醇能抑制植物中病害菌的生长，随后Mo等人的研究证实了2-苯乙醇在草莓保藏中的抗菌保鲜机制[18]。
总结出2-苯乙醇的抗菌机制是首先使细胞的渗透性屏障细胞膜崩解，使细胞质外流，丧失细胞活力，然后进一步影响胞内功能，抑制核酸合成等，最终导致细胞裂解死亡。
2-苯乙醇对许多病害菌都能进行有效的抑制，这些特性可以使其应用在医药等行业中作为抗菌物质来取代人工合成的杀菌剂和消毒剂等。
3.2.2. 植物生长发育中作用近年来发现，2-苯乙醇在植物的生长发育过程中还具有促进繁殖、抗菌、保护植物等生物学功能[2]。
目前已经对玫瑰花中以L-苯丙氨酸为原料合成2-苯乙醇的两个关键酶，PLP依赖的脱羧酶和苯乙醛脱氢酶进行了研究[19]。