层析技术PPT课件
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2009年3月
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K=0.1
2.7
0.36
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24.3
4.86
72.9
29.16
65.61
❖ 分配系数主要与下列因素有关： ➢ 被分离物质本身的性质 ➢ 固定相和流动相的性质 ➢ 层析柱的温度
2009年3月
2009年3月
一、层析的基本理论
➢ 层析： 一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特
性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同 而进行分离和分析的方法。 ➢ 溶解度 ➢ 吸附能力 ➢ 立体化学特性 ➢ 分子的大小 ➢ 带电情况 ➢ 亲和力的大小及特异
2009年3月
二、层析的基本概念
❖ 固定相： 层析的一个基质。
析的建立 1956年，Stahl系统研究了薄层色谱法(TLC)
2009年3月
1958年，Stein和Moore研制出氨基酸分析仪，确定了 核糖核酸的分子结构 1967年，Horvvath和Huber等研制了高效液相色谱 (high-performance liquid chromatography,HPLC)仪 1975年，Small等提出离子色谱 20世纪80年代，超临界色谱 20世纪90年代，毛细管电泳 21世纪，联用技术、大分子色谱分离、制备色谱取得 更大的发展
❖ 固体物质：吸附剂，凝胶，离子交换剂等 ❖ 液体物质：固定在硅胶或纤维素上的溶液
❖ 基质能与待分离的化合物进行可逆的反应 ➢ 吸附 ➢ 溶解 ➢ 交换
2009年3月
❖ 流动相： 在层析过程中，推动固定相上待分离的物
质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称 为流动相。
➢ 柱层析： 洗脱剂 ➢ 薄层层析：展开剂（展层剂）
被延滯
2009年3月
小分子
固 定 相
样品
流 动 相
大分子
较快流出
2009年3月
凝胶层析的基本原理
❖ 基本概念 ➢ 外水体积：指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的
体积，也就是凝胶颗粒间液体流 动相的体积 ➢ 内水体积：指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶 层析中固定相体积就是指内水体积 ➢ 基质体积：指凝胶颗粒实际骨架体积 ➢ 柱床体积：指凝胶柱所能容纳的总体积 ➢ 洗脱体积：指将样品中某一组分洗脱下来所需 洗脱液的体积
2009年3月
吸附层析
Liquid - Solid
分配层析
Liquid - Liquid
❖ 分配系数（K）及迁移率（或比移值）： 分配系数是指在一定（温度、压力）的条
件下，某种组分在固定相和流动相中含量 （浓度）的比值，常用K来表示。 ❖ 分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据
K=Cs/Cm Cs: 溶质在固定相中的浓度 Cm: 溶质在流动相中的浓度
2009年3月
（2）分配层析 ——利用不同组分在流动相和固定相中的分配
系数不同而进行分离的方法。
2009年3月
1
层析技术概述
2
凝胶层析
2009年3月
凝胶层析
❖ 凝胶层析 （gel chromatography） ❖ 凝胶排阻层析 （gel exclusion chromatography） ❖ 分子筛层析 （molecular sieve chromatography） ❖ 凝胶过滤 （gel filtration） ❖ 凝胶渗透层析 （gel permeation chromatography）
层析技术
倪培华
1
1 ① ② ③
2
2009年3月
讲课内容
层析技术概述 层析的基本理论
层析的基本概念
层析的分类
凝胶层析
1
层析技术概述
2
凝胶层析
2009年3月
概述
➢ 1903年 俄国植物学家 茨维特 发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱 分离植物色素，以石油醚冲洗，得 到黄色、绿色区带
2009年3月
1931年，Kuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素 1941年，Martin和Synge提出分配色谱法 1944年，Martin等又提出纸色谱法 1952年，Martin和James发明了气液色谱法 1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代色谱 分
三、层析法的分类 ❖根据固定相基质的形式分类 ➢纸层析 ➢薄层层析 ➢柱层析
2009年3月
纸层析
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
薄层层析
2009年3月
■ 层析法的演变过程：
圆形滤纸
长条滤纸
加展开液
柱层析
薄层层析 (TLC)
2009年3月
容量变大
容量更大
❖纸层析： 指以滤纸作为基质的层析
❖ 薄层层析：将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺 成 一薄层，在薄层上进行层析
2009年3月
■ 层析分析法的基本原理：
A
B
C
非 极 性
两相系统
极
性
每次分离样本 都要做一次选择
样本
非 极 性
One Plate of 极 Separation
L
S
性 (理论板数)
样本
L L
Mobile Stationary phase phase
流动相 固定相
样本分子依其分子极性 选择亲和两相之一
2009年3月
吸附层析
❖ 常用的吸附剂
硅胶
氧化铝
碱性:碳氢化合物 中 性:醛,酮,醌,酯,内酯酸性: 酸性色素,醛,酸
活性炭
粉末:吸附力大,流速慢 颗粒:吸附力中,流速易控 锦纶-活性炭:吸附力弱
聚酰胺
锦纶66或锦纶6
酰胺
基团
对
酚,DNP-氨基酸, 醌,羧酸
氢键：羟基与羰基
磷酸钙
唯一用于生物活性物质 羟基磷灰石
❖柱层析： 指将基质填装在管中形成柱形，在柱 中进行层析
2009年3月
❖ 根据流动相的物态分类
➢ 液相层析：指流动相为液体的层析
➢ 气相层析：指流动相为气体的层析
气
气-固
相 以气体作为流动相
层
气-液
析
液
相
液-固
以液体作为流动相
层
析
2009年3月
液-液
❖ 根据层析机制分类
2009年3月
（1）吸附层析
2009年3月
固定相（凝胶）
❖ ——三维空间网状结构
A good gel for gel filtration contains about
95% water
2009年3月
■ 凝胶层析法：
分子筛效应：
分子大小不同, 在凝胶受到的 阻滞作用有差 异,从而造成各 组分在凝胶柱 中的迁移速度 不同得到分离。 小分子
❖定义 指混合物随流动相
通过吸附剂时，由于 吸附剂对不同物质的 吸附力而使混合物分 离的方法。
❖ 原理
在不同条件下，吸附剂与 被吸附物之间的作用
物理作用的范德华吸附：无 选择性，吸附速度快，吸 附的过程是可逆的
化学吸附：由原子价力的作 用引起。有选择性，吸附 速度较慢，不易解吸
在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和 同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡， 吸附层析就是不断地产生平衡与不平衡，吸附与解吸。
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K=0.1
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4.86
72.9
29.16
65.61
❖ 分配系数主要与下列因素有关： ➢ 被分离物质本身的性质 ➢ 固定相和流动相的性质 ➢ 层析柱的温度
2009年3月
2009年3月
一、层析的基本理论
➢ 层析： 一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特
性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同 而进行分离和分析的方法。 ➢ 溶解度 ➢ 吸附能力 ➢ 立体化学特性 ➢ 分子的大小 ➢ 带电情况 ➢ 亲和力的大小及特异
2009年3月
二、层析的基本概念
❖ 固定相： 层析的一个基质。
析的建立 1956年，Stahl系统研究了薄层色谱法(TLC)
2009年3月
1958年，Stein和Moore研制出氨基酸分析仪，确定了 核糖核酸的分子结构 1967年，Horvvath和Huber等研制了高效液相色谱 (high-performance liquid chromatography,HPLC)仪 1975年，Small等提出离子色谱 20世纪80年代，超临界色谱 20世纪90年代，毛细管电泳 21世纪，联用技术、大分子色谱分离、制备色谱取得 更大的发展
❖ 固体物质：吸附剂，凝胶，离子交换剂等 ❖ 液体物质：固定在硅胶或纤维素上的溶液
❖ 基质能与待分离的化合物进行可逆的反应 ➢ 吸附 ➢ 溶解 ➢ 交换
2009年3月
❖ 流动相： 在层析过程中，推动固定相上待分离的物
质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称 为流动相。
➢ 柱层析： 洗脱剂 ➢ 薄层层析：展开剂（展层剂）
被延滯
2009年3月
小分子
固 定 相
样品
流 动 相
大分子
较快流出
2009年3月
凝胶层析的基本原理
❖ 基本概念 ➢ 外水体积：指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的
体积，也就是凝胶颗粒间液体流 动相的体积 ➢ 内水体积：指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶 层析中固定相体积就是指内水体积 ➢ 基质体积：指凝胶颗粒实际骨架体积 ➢ 柱床体积：指凝胶柱所能容纳的总体积 ➢ 洗脱体积：指将样品中某一组分洗脱下来所需 洗脱液的体积
2009年3月
吸附层析
Liquid - Solid
分配层析
Liquid - Liquid
❖ 分配系数（K）及迁移率（或比移值）： 分配系数是指在一定（温度、压力）的条
件下，某种组分在固定相和流动相中含量 （浓度）的比值，常用K来表示。 ❖ 分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据
K=Cs/Cm Cs: 溶质在固定相中的浓度 Cm: 溶质在流动相中的浓度
2009年3月
（2）分配层析 ——利用不同组分在流动相和固定相中的分配
系数不同而进行分离的方法。
2009年3月
1
层析技术概述
2
凝胶层析
2009年3月
凝胶层析
❖ 凝胶层析 （gel chromatography） ❖ 凝胶排阻层析 （gel exclusion chromatography） ❖ 分子筛层析 （molecular sieve chromatography） ❖ 凝胶过滤 （gel filtration） ❖ 凝胶渗透层析 （gel permeation chromatography）
层析技术
倪培华
1
1 ① ② ③
2
2009年3月
讲课内容
层析技术概述 层析的基本理论
层析的基本概念
层析的分类
凝胶层析
1
层析技术概述
2
凝胶层析
2009年3月
概述
➢ 1903年 俄国植物学家 茨维特 发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱 分离植物色素，以石油醚冲洗，得 到黄色、绿色区带
2009年3月
1931年，Kuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素 1941年，Martin和Synge提出分配色谱法 1944年，Martin等又提出纸色谱法 1952年，Martin和James发明了气液色谱法 1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代色谱 分
三、层析法的分类 ❖根据固定相基质的形式分类 ➢纸层析 ➢薄层层析 ➢柱层析
2009年3月
纸层析
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
薄层层析
2009年3月
■ 层析法的演变过程：
圆形滤纸
长条滤纸
加展开液
柱层析
薄层层析 (TLC)
2009年3月
容量变大
容量更大
❖纸层析： 指以滤纸作为基质的层析
❖ 薄层层析：将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺 成 一薄层，在薄层上进行层析
2009年3月
■ 层析分析法的基本原理：
A
B
C
非 极 性
两相系统
极
性
每次分离样本 都要做一次选择
样本
非 极 性
One Plate of 极 Separation
L
S
性 (理论板数)
样本
L L
Mobile Stationary phase phase
流动相 固定相
样本分子依其分子极性 选择亲和两相之一
2009年3月
吸附层析
❖ 常用的吸附剂
硅胶
氧化铝
碱性:碳氢化合物 中 性:醛,酮,醌,酯,内酯酸性: 酸性色素,醛,酸
活性炭
粉末:吸附力大,流速慢 颗粒:吸附力中,流速易控 锦纶-活性炭:吸附力弱
聚酰胺
锦纶66或锦纶6
酰胺
基团
对
酚,DNP-氨基酸, 醌,羧酸
氢键：羟基与羰基
磷酸钙
唯一用于生物活性物质 羟基磷灰石
❖柱层析： 指将基质填装在管中形成柱形，在柱 中进行层析
2009年3月
❖ 根据流动相的物态分类
➢ 液相层析：指流动相为液体的层析
➢ 气相层析：指流动相为气体的层析
气
气-固
相 以气体作为流动相
层
气-液
析
液
相
液-固
以液体作为流动相
层
析
2009年3月
液-液
❖ 根据层析机制分类
2009年3月
（1）吸附层析
2009年3月
固定相（凝胶）
❖ ——三维空间网状结构
A good gel for gel filtration contains about
95% water
2009年3月
■ 凝胶层析法：
分子筛效应：
分子大小不同, 在凝胶受到的 阻滞作用有差 异,从而造成各 组分在凝胶柱 中的迁移速度 不同得到分离。 小分子
❖定义 指混合物随流动相
通过吸附剂时，由于 吸附剂对不同物质的 吸附力而使混合物分 离的方法。
❖ 原理
在不同条件下，吸附剂与 被吸附物之间的作用
物理作用的范德华吸附：无 选择性，吸附速度快，吸 附的过程是可逆的
化学吸附：由原子价力的作 用引起。有选择性，吸附 速度较慢，不易解吸
在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和 同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡， 吸附层析就是不断地产生平衡与不平衡，吸附与解吸。