耐低温乳酸菌的分离与优化培养

07 /2014
草 业 科 学 ( 第 31 卷 07 期)
菌的扩大培 养 及 工 业 生 产 提 供 依 据，这 对 于 促 进 高寒地区发展青贮具有积极的作用。
1 材料与方法
1． 1 实验材料 乳酸菌: 从青海大学农牧学院草科系实验室提
供的新鲜泡菜、全株玉米( Zea mays) 青贮中分离获 得。
MRS 培养基: 牛肉膏 10 g、蛋白胨 10 g、酵母膏 5 g、吐温 － 80 1 mL、柠檬酸二胺 2 g、乙酸钠 5 g、 K2 HPO4 2 g、MgSO4 ·7H2 O 2 g、MnSO4 ·4H2 O 0． 25 g、葡萄糖 20 g、琼脂 10 g、蒸馏水 1 L，调 pH 至 6． 2 ～ 6． 4，121 ℃ 灭菌 15 min。 1． 2 实验方法 1． 2． 1 乳酸菌的分离、初筛 取新鲜泡菜汁液体样 品 1 mL 于盛有 9 mL 无菌水的试管中，振荡混匀; 全 株玉米青贮固体样品称取 1 g，剪碎置于无菌烧杯 中，加 50 mL 无菌生理盐水，摇晃并浸泡数分钟。无 菌试管中利用 10 倍稀释法分别上述两样品溶液稀 释至 10 － 3 、10 － 3 以及 10 － 3 倍，并进行编号。对应编 号，吸管移取两滴于的含有 0． 5% CaCO3 的 MRS 培 养基上涂平板。10 ℃ 恒温培养 72 h 后，选取周围出 现溶钙圈的菌落，利用划线法在空白 MRS 平板上分 离出单菌落，观察菌落形态。分离出的单菌落菌株 进行革兰氏染色和接触酶实验，选择溶钙圈较大、革 兰氏染色 阳 性 且 接 触 酶 实 验 阴 性 的 菌 株，转 移 至 MRS 斜面培养基上，2 ℃ 恒温保存备用。 1． 2． 2 乳酸菌复筛 用接种环分别挑取上述菌种 约两环于 MRS 液体培养基中，10 ℃ 培养 48 h 得到 母液。将母液分别接入空白 MRS 液体培养基中，保 持接入后菌种浓度一致( 4． 78 lgCFU ·mL － 1 ) 。10 ℃ 恒温培养，每隔 12 h 测定一次菌体浓度及发酵液 pH。选出生长速度和产酸能力最好的 1 株菌种。 1． 2． 3 乳酸菌的鉴定 光学显微镜下对菌种进行 形态学鉴定; 参照伯杰氏细菌鉴定手册和《乳酸细 菌分类鉴定及实验方法》进行乳酸菌生理生化特性 鉴定。 1． 2． 4 培养条件对乳酸菌生长的影响 分别以 1% 、2% 、3% 、4% 、5% ( V / V) 的接种量将乳酸菌接 种于 MRS 液体培养基中( 初始 pH 为 6． 2) ，10 ℃ 恒
CHU Xu-jian，LI Chang-hui，LIU Ming-can，LI Cai-juan，ZHAO Ming-xia
( Agriculture and Animal Husbandry College of Qinghai University，Xining 810016，China)
Abstract: One lactic acid bacteria strain L2 with low temperature resistant and more lactic acid production was isolated and selected from corn silage and fresh kimchi． The strain was identified with morphological，physiological and biochemical characterization according to the Bergey' s manual of systematic bacteriology． The culture conditions of this strain were optimized as 3． 1% ( v / v) inoculation amount，initial pH 6． 4 and temperature of 18． 4 ℃ with Box-Behnken Design． Key words: low temperature lactic acid bacteria; isolation; optimization of culture Corresponding author: LI Chang-hui E-mail: lichanghui8@ yahoo． com． cn
滑、隆起，菌体呈短杆状，单个、成对或成链。 2． 3． 2 生理生化及糖发酵实验 菌株 L2 的明胶液 化实验、吲哚实验、H2 S 实验、硝酸盐还原和联苯胺 实验均为阴性，而石蕊牛奶实验、淀粉水解实验为阳 性。可以判断该菌为乳杆菌属( 表 3) 。阿拉伯糖、 棉子糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖等发酵 产酸实验中，发现其除鼠李糖外其他糖类都可以利 用( 表 4 ) 。对 照 鉴 定 手 册，L2 、L3 为 植 物 乳 杆 菌 ( Lactobacillus plantarum ) ; R1 、R2 为 乳 明 串 珠 菌 ( Leuconostoc lactis) ; L1 为德氏乳杆菌 ( Lactobacillus delbrueckii) 。
图 1 各菌株生长曲线及培养液 pH 变化曲线 Fig． 1 Growth curve of each strain and pH curve of the culture fluid
储徐建，李长慧，刘明灿，李彩娟，赵明霞
( 青海大学农牧学院，青海 西宁 810016)
摘要: 从青贮玉米( Zea mays) 以及新鲜泡菜中分离乳酸菌，通过初筛和复筛获得 1 株产酸能力较强的耐低温乳酸
菌 L2 ; 对其进行了形态学描述和生理生化鉴定，对照伯杰式手册确定其种属; 采用 Box-Behnken 实验设计进行培 养条件优化实验，确定了该菌的最佳发酵条件。结果表明，该菌的最佳发酵条件为接种量 3． 1% 、初始 pH 6． 4、培
6 6． 5 7 16 19 22
1． 2． 6 数据处理 活菌计数采用血球计数板计数， 移液枪吸取培养液 1 mL 于无菌试管中，10 倍稀释 法稀释至合适倍数后，取数滴于血球计数板上，置于 显微镜下观察计数。利用 SAS 9． 1． 3 软件对数据进 行 t 检验分析，Design Expert 7． 0 软件进行响应面分 析。
温培养，每隔 12 h 进行一次活菌计数。观察接种量 对耐低温乳酸菌生长的影响。
调节 MRS 液 体 培 养 基 初 始 pH 分 别 为 5． 0、 5． 5、6． 0、6． 5 和 7． 0，按接种量 3% ( V / V) 进行接 种，10 ℃ 恒温培养，每隔 12 h 进行一次活菌计数。 观察初始 pH 对耐低温乳酸菌生长的影响。
按接种量 3% ( V / V) 进行接种，初始 pH 为6． 2， 分别在 10、13、16、19、22 ℃ 条件下恒温培养，每隔 12 h 进行一次活菌计数。观察培养温度对耐低温 乳酸菌生长的影响。 1． 2． 5 耐低温乳酸菌培养条件优化 利用 Design Expert 7． 0 软件按照 Box-Benhnken 实验设计原理设 计实验组，设置接种量、起始 pH 和培养温度 3 个因 素为自变量，活菌数( CFU) 作为响应值，通过响应面 分析( Response Surface Analysis，RSA) 确定最优培养 条件［9-11］。接种量、起始 pH 及培养温度 3 个自变量 因素的 Box-Benhnken 响应面设计因素水平如表 1 所示。
乳酸菌指能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产 生乳酸的 细 菌 的 统 称［1］。乳 酸 菌 通 常 不 移 动，不 产 孢 子 ，过 氧 化 氢 酶 反 应 普 遍 呈 阴 性 ，革 兰 氏 染 色 阳性。随着 越 来 越 多 的 被 人 们 所 了 解，乳 酸 菌 被 广 泛 的 应 用 于 饲 料 、食 品 、医 药 等 许 多 行 业［2］。 其 许多新的功能也正在被不断开发。在饲料领域， 乳酸菌主要 被 用 作 青 贮 添 加 剂，能 够 有 效 地 提 高 青贮 发 酵 品 质［3］，并 且 可 以 提 高 目 标 有 氧 稳 定 性［4-5］。乳酸菌 的 最 适 温 度 一 般 在 30 ～ 40 ℃ ，10 ℃ 及以下乳酸菌生长微弱甚至不生长［6］。青藏高
2 结果与分析
2． 1 筛选获得乳酸菌 通过两次筛选，从泡菜和全株青贮玉米中得到
有溶钙圈、革兰氏染色呈阳性、接触酶实验呈阴性的 菌株共 5 株。通过光学显微镜观察可知其中球菌两
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PRATACULTURAL SCIENCE( Vol． 31，No． 07)
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株，杆菌 3 株。现记球菌为 R、杆菌为 L，分别对其进 行编号，5 株菌种表示为 R1 、R2 、L1 、L2 、L3 ，其中 R1 、 L1 、L3 来源于泡菜，R2 、L2 来源于全株青贮玉米。 2． 2 优良菌株筛选结果
表 1 响应面设计因素水平表 Table 1 Levels and codes of variables of response
surface analysis( RSA)
因素 Factor
水平 Level
－1 0
1
A 接种量 Inoculum / %
2
3
4
B 起始 pH Initial pH
C
培养温度 Incubation temperature / ℃
结果显示，L2 菌稳定期菌体浓度最大，为 6． 30 lgCFU·mL － 1 ( 图 1) ，培养液 pH 下降的也最快，表 明 L2 产酸能力最好。所以，在 5 株菌种中选取 L2 作为目的菌种。 2． 3 乳酸菌鉴定 2． 3． 1 形态学鉴定 分离获得的 5 株菌种菌落形 态( 菌落颜色、透明度等) 及菌体形态如表 2 所示。 其中，L2 菌落呈乳白色、不透明、边缘整齐、表面光
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草业科学 PRATACULTURAL SCIENCE
DOI: 10． 11829 \ j． issn． 1001-0629． 2013-0536
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后生物 生产层
Baidu Nhomakorabea
耐低温乳酸菌的分离与优化培养
31 卷 07 期 Vol． 31，No． 07
櫧櫧毥
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原多在秋季 开 展 青 贮，此 时 平 均 气 温 低 于 10 ℃ ， 市售乳酸菌 青 贮 添 加 剂 在 此 温 度 下 活 性 微 弱、几 乎 不 生 长 ，对 提 高 低 温 环 境 青 贮 品 质 的 作 用 微 弱 。 因 此 ，要 提 高 青 藏 高 原 青 贮 饲 料 品 质 ，须 选 育 耐 低 温乳酸菌菌种。目前有关耐低温乳酸菌的研究国 内 外 报 道 较 少 ，已 有 研 究 多 集 中 于 低 温 冷 藏 肉 、泡 菜 等 食 品 方 面［7-8］，尚 未 见 到 针 对 青 贮 的 耐 低 温 乳 酸菌的选 育 与 应 用 的 研 究。鉴 于 此，本 研 究 从 青 贮饲料和泡 菜 中 分 离 耐 低 温 乳 酸 菌，并 对 其 进 行 优 化 培 养 实 验 ，以 确 定 该 菌 的 最 佳 发 酵 条 件 ，为 该
养温度 18． 4 ℃ 。
关键词: 耐低温乳酸菌; 分离; 优化培养
中图分类号: Q939． 11 + 7
文献标识码: A
文章编号: 1001-0629( 2014) 07-1380-09〔1 〕
Isolation and optimization of low temperature lactic acid bacteria
〔1 〕 收稿日期: 2013-09-13 接受日期: 2013-11-29 基金项目: 青海高原放牧家畜营养与生态国家实验室培育基地项目基金 第一作者: 储徐建( 1989-) ，男，安徽潜山人，在读硕士生，研究方向为牧草饲料开发与利用。E-mail: xiaojian302@ yeah． net 通信作者: 李长慧( 1969-) ，男，山东齐河人，教授，博士，研究方向为牧草饲料开发与利用。E-mail: lichanghui8@ yahoo． com． cn