高中生物核心概念高考复习课件-PCR技术
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PCR技术教程PPT课件
Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的 阈值时所经历的循环数。
第10页/共71页
特别说明： 1、荧光探针和荧光染料：
分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高， 后者操作简单。
TaqMan探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5’端，淬灭基因连在3’
端。5’端荧光基团吸收能量后转移给临近的3’端淬灭基团，发生共振能 量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。
GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引 物二聚体。 5、Tm=(G+C)×4+(A+C) ×2 6、primer 5.0 7、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、 Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl）
第5页/共71页
PCR类型：
普通PCR RT-PCR TAIL-PCR Real-time PCR 数字PCR
循 环
56℃ 72℃
退火 延伸
目的：引物先与模板匹配 1-2 min 目的：聚合酶在引物3’端加
核苷酸，合成新链
12℃ 保存
特异性强、灵敏度高、快速、简便
第3页/共71页
循环次数 1 2 3 20 30
DNA数量 2 4 8
1048576 1073741824
第4页/共71页
特殊说明：
1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，无3’→5’外切酶活性， 不
第8页/共71页
第9页/共71页
原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如 SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如
Taqman探 针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，
再 通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 的方法。
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特别说明： 1、荧光探针和荧光染料：
分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高， 后者操作简单。
TaqMan探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5’端，淬灭基因连在3’
端。5’端荧光基团吸收能量后转移给临近的3’端淬灭基团，发生共振能 量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。
GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引 物二聚体。 5、Tm=(G+C)×4+(A+C) ×2 6、primer 5.0 7、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、 Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl）
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PCR类型：
普通PCR RT-PCR TAIL-PCR Real-time PCR 数字PCR
循 环
56℃ 72℃
退火 延伸
目的：引物先与模板匹配 1-2 min 目的：聚合酶在引物3’端加
核苷酸，合成新链
12℃ 保存
特异性强、灵敏度高、快速、简便
第3页/共71页
循环次数 1 2 3 20 30
DNA数量 2 4 8
1048576 1073741824
第4页/共71页
特殊说明：
1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，无3’→5’外切酶活性， 不
第8页/共71页
第9页/共71页
原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如 SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如
Taqman探 针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，
再 通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 的方法。
第二章-PCR技术ppt课件
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性 下降。
（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反 应产量。
（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度
低浓度引物
高浓度引物
2. 反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片 段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析 ,如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA的 克隆,扩增基因的插入DNA；建立基因组步移文 库。
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR） • 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 • 最初采用 E-coli DNA 聚合酶进行 PCR ，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
• PCR反应条件 72℃ 95℃ • PCR过程 • PCR的特点
PCR的基本原理
Taq
• PCR反应条件 72℃ 50℃ 95℃ Taq • PCR过程 • PCR的特点
Taq
TaqLeabharlann PCR的基本原理第2轮结束
• PCR反应条件 72℃ • PCR过程 • PCR的特点
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性 下降。
（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反 应产量。
（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度
低浓度引物
高浓度引物
2. 反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片 段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析 ,如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA的 克隆,扩增基因的插入DNA；建立基因组步移文 库。
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR） • 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 • 最初采用 E-coli DNA 聚合酶进行 PCR ，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
• PCR反应条件 72℃ 95℃ • PCR过程 • PCR的特点
PCR的基本原理
Taq
• PCR反应条件 72℃ 50℃ 95℃ Taq • PCR过程 • PCR的特点
Taq
TaqLeabharlann PCR的基本原理第2轮结束
• PCR反应条件 72℃ • PCR过程 • PCR的特点
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
pcr技术课件ppt简短
通量PCR检测。
pcr技术的应用范围
01
02
03
基础研究
基因克隆、基因表达、基 因组测序、单核苷酸多态 性(SNP)检测等。
医学诊断
感染性疾病、遗传性疾病 、肿瘤等疾病的诊断。
生物多样性研究
物种鉴定、种群遗传学分 析、生态学研究等。
02
CATALOGUE
pcr技术的基本步骤
样本准备
样本类型
选择合适的样本类型，如 血液、组织等，以便后续 实验操作。
根据目的基因序列，选择特异性好、扩增 效率高的引物。
确认模板DNA的质量
设置合理的反应体系
确保使用的模板DNA无降解、无污染，浓 度和纯度适中。
根据引物、模板和PCR仪的规格，设置合理 的反应体系。实验Βιβλιοθήκη 的注意事项控制好反应温度和时间
PCR反应中，每个温度点的反应时间和升温/降温速度应保持一致。
避免出现非特异性扩增
将DNA模板、引物、dNTPs、酶等 试剂加入PCR反应管中。
进行PCR扩增
将PCR反应管放入PCR仪中，按照设 定的程序进行扩增。
产物检测和分析
收集PCR扩增产物，进行电泳分析或 荧光定量PCR等检测方法，确定目标 基因序列是否被成功扩增。
实验后处理
数据分析和结论
对实验数据进行统计和分析，得出结论。
将用过的引物和模板妥善储存，以备后续实验使 用。
仪器的维护与保养
定期对PCR仪进行维护和保养，确保设备的正常 运行。
05
CATALOGUE
pcr技术的优缺点
优点
01
02
03
04
灵敏度高
PCR技术可以检测出微量的 DNA，灵敏度非常高。
pcr技术的应用范围
01
02
03
基础研究
基因克隆、基因表达、基 因组测序、单核苷酸多态 性(SNP)检测等。
医学诊断
感染性疾病、遗传性疾病 、肿瘤等疾病的诊断。
生物多样性研究
物种鉴定、种群遗传学分 析、生态学研究等。
02
CATALOGUE
pcr技术的基本步骤
样本准备
样本类型
选择合适的样本类型，如 血液、组织等，以便后续 实验操作。
根据目的基因序列，选择特异性好、扩增 效率高的引物。
确认模板DNA的质量
设置合理的反应体系
确保使用的模板DNA无降解、无污染，浓 度和纯度适中。
根据引物、模板和PCR仪的规格，设置合理 的反应体系。实验Βιβλιοθήκη 的注意事项控制好反应温度和时间
PCR反应中，每个温度点的反应时间和升温/降温速度应保持一致。
避免出现非特异性扩增
将DNA模板、引物、dNTPs、酶等 试剂加入PCR反应管中。
进行PCR扩增
将PCR反应管放入PCR仪中，按照设 定的程序进行扩增。
产物检测和分析
收集PCR扩增产物，进行电泳分析或 荧光定量PCR等检测方法，确定目标 基因序列是否被成功扩增。
实验后处理
数据分析和结论
对实验数据进行统计和分析，得出结论。
将用过的引物和模板妥善储存，以备后续实验使 用。
仪器的维护与保养
定期对PCR仪进行维护和保养，确保设备的正常 运行。
05
CATALOGUE
pcr技术的优缺点
优点
01
02
03
04
灵敏度高
PCR技术可以检测出微量的 DNA，灵敏度非常高。
【课件】高三生物一轮复习课件微专题——PCR技术
。
图2中4次PCR对引物的使用不完全相同，如PCR1选择引物
A和B，PCR2选引物C和D，请问PCR3和PCR4应分别如何
选择引物： 不使用引物、
引物A和D 。
（2）该技术生产出来的蛋白A应属于 蛋白质 工程。
图1
图2
引物
扩增 特异性
扩增 高效性
发夹结构
二聚体
关于Taq酶（热稳定DNA聚合酶）
（1）从水生栖热菌（生存环境温度可高达80℃)中分离出 来具有热稳定的DNA聚合酶。 （2）作用原理：将脱氧核苷酸连接到引物的3’端，形成 磷酸二酯键。 （3）真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活， 因此PCR反应缓冲液中一般要加Mg2+。
关于PCR引物设计原则
PCR的首要任务就是引物设计。引物设 计的好坏，直接影响了PCR的结果。成 功的PCR反应既要高效，又要特异性扩 ①增引产物物长。度要适宜，通常为20-30个核苷酸
②引物GC含量要适宜，一般为45-55% ③退火温度要适宜 ④引物自身及引物之间不应存在互补序列
⑤引物5'端可以修饰，3'端不可修饰
3-5：不同循环次数的 PCR产物
6：清水
缺点：只能作定性分析，不能准确定量。易造成污染出现假阳性， 使其应用受到限制。
例题：利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，下列有关“DNA片段 的扩增及电泳鉴定”实验的相关叙述，错误的是 A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高
B. 设计引物时需考虑引物的长度、碱基序列和GC含量
√C. Taq酶的浓度过低会引起非特异性扩增产物量的增多
D. 目标DNA的获得取决于引物在模板DNA上的结合位置
热点专题13PCR技术及其应用-2025年生物学高考总复习课件
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高考总复习·生物学
(5)结果分析。
①两条单链等长DNA(目的基因)从第三轮循环开始出现(甲、乙)。随循
环次数的增加，目的基因含量会不断增加。
②通过以上分析可知，PCR反应的产物不都是所需的目的基因片段，除
目的基因外，还会存在四种类型的DNA分子(这四种类型同第二轮循环
产生的4个DNA分子)。
量PCR(RT-PCR)检测法，技术流程如下图所示，①②③表示相关步骤。
请回答：
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高考总复习·生物学
(1)PCR技术与DNA体内复制过程相比，两者的复制方式都是___________。
半保留复制
RT-PCR过程中，需先以RNA为模板合成cDNA，故装置中需添加
逆转录
酶。
蛋白酶K能催化
(2)过程①中，RNA提取裂解液可同时灭活病毒，原因是_______________
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2.PCR的原理
(1)DNA分子的热变性原理。
当温度超过90 ℃时，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称
为变性。温度缓慢降低到50 ℃左右时，两条彼此分离的DNA链重新结合
成双链，这个过程称为复性。
DNA双链
DNA单链
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(2)耐高温的DNA聚合酶。
高考总复习·生物学
热点专题13 PCR技术及其应用
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［热点归纳］
1.概念
PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制原理，在
体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，迅速扩增DNA片段的技
术，它能以极少量的DNA为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA。
PCR技术介绍精品课件(一)
PCR技术介绍精品课件(一)PCR技术介绍精品课件——掌握基因分子生物学核心技术的利器PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种非常重要的基因分子生物学核心技术，在疾病检测、基因工程、药物研发、环境监测等方面具有广泛的应用。
PCR技术介绍的精品课件是掌握该技术的有效工具。
一、PCR技术实现的原理PCR技术是利用DNA聚合酶作为酶催化剂，最小量的DNA模板进行体外扩增，使其在几个小时内扩增成1000万甚至10亿份以上，实现DNA分子的大规模扩增和检测。
PCR反应分为三个步骤：变性、退火、延伸。
变性是使双链DNA变成单链DNA，退火是让引物与目标DNA序列的特定区域结合，从而制造重复扩增模板；延伸是将DNA聚合酶介导的dNTP延伸至3'-OH端，最终形成双链DNA。
PCR反应可以进行20-40次的循环，以成倍地扩增目标DNA。
二、PCR技术介绍的内容1. PCR技术的基本原理该部分对PCR技术的原理进行详细阐述，包括PCR反应的三个步骤、PCR反应体系的组成、PCR反应不同温度时，DNA的状态变化。
同时，应用画图软件进行动态模拟，使学生直观地感受PCR反应的过程。
2. PCR技术中引物的设计和合成方法引物是PCR反应中的重要组成部分，正确的引物设计对PCR反应结果的准确性有很大影响。
该部分将介绍引物的设计原则和方法，如引物长度的选择、GC含量的控制、引物序列的互补性等等，并展示引物合成的实验过程。
3. PCR技术的应用该部分主要介绍PCR技术在不同领域的应用，如遗传病的诊断、基因工程、药物研发、环境监测等，同时以实际案例为例进行深入探讨。
三、课件特色和优势1. 直观易懂该精品课件采用了动态模拟的方式，并借助图片、表格、视频等元素，使学生直观地感受PCR技术的核心原理和应用。
2. 实践操作该精品课件不仅介绍PCR技术的原理和应用，更是通过实验演示的方式，精准地展示样品制备、PCR反应、基因分析等关键步骤。
高中生物精品资源高三一轮复习生物：PCR技术及其应用课件
5 练习
5.在基因工程中，把选出的目的基因(共1 000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌 呤脱氧核苷酸460个)放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放 入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数至少是( )
A.540个 B.7 560个 C.8 100个 D.17 280个
6 小结
碱基互补配对
原则
DNA半保留复制 原理 PCR技术 过程 变性-复性-延伸
应用
扩增
敲除或增加基因 DNA鉴定 基因定位 基因测序 ……
录酶
DNA单链 cDNA DNA重组
返回
重叠延伸PCR第二轮：上一轮的产物分子作为本轮的引物
N基因的b链→ N基因的a链→
A3+Y↓ 5’ 3’
3’ 5’ A1+X↑
←N基因的b链 ←N基因的a链
4 PCR技术的应用
5.应用PCR技术进行基因敲除或增加基因 重叠延伸PCR第三轮：上一轮的产物作为本轮的模板
A1+X↑
A3+Y↓ A3+Y↓
5 练习
1.利用PCR扩增目的基因的过程中，子链延伸需要引物，有关引物 设计的说法错误的是( ) A.两种引物之间不能有互补性 B.每种引物自身不应存在互补性 C.设计引物时需要知道目的基因的全部碱基序列 D.引物的长度关系到PCR的特异性
2.三次循环后产生的DNA分子中，只含有一个引物的DNA分子有 几条？占DNA分子总数的几分之几？
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA D.10号确定反应体系等对结果没有干扰
5 练习
4.如果要用PCR扩增以下DNA模板中的基因1，需要的一对引物序列是( ) 5′CTTCGAAATTC—基因1—TCTCCCGATCGG—基因2—ATCCTTTGCTCT3′
PCR技术介绍专题知识课件
Real Time qPCR
基线（Baseline）
是指在PCR扩增反应旳最初数个循环
里，荧光信号变化不大，接近一条直线，
这么旳直线即基线。
。
光阈值（threshold）
一般将PCR反应前15个循环旳荧光信
号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR
3-15个循环荧光信号原则差旳10倍，荧
光域值设定在PCR扩增旳指数期
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶板旳制备(1.5%)
加样电泳（电压80V、时间2hr）
紫外
EB，它能和碱基间旳氢键结合，在 波长为254nm~365nm旳紫外光照射下 呈橘红色（530nm）旳荧光
03 衍生PCR技术
原位PCR
逆转录PCR
PCR技术
定量PCR
巢式PCR 多重PCR
逆转录 PCR
相对于基本PCR，在开始阶段增长环节：RNA →cDNA合成，是单链到双链旳过程。
引物 逆转录酶
RNA水解酶
Real Time qPCR
荧光嵌正当(TB Green™)
实时荧光定量PCR技术 (Real-Time Quantitative PCR) 是指在PCR反应
体系中加入荧光基团，利用荧光 信号积累实时监测整个PCR进程，
最终经过原则曲线对未知模板进 行定量分析旳措施。
荧光探针法
熔解曲线 确认PCR反应旳特异性。
Real Time qPCR
相对定量法分析成果
内参/管家基因 GAPDH、β-actin、18S rRNA、ACTB、β2M......（至少选择两个以上）
核酸体现量计算
R =2−ΔΔCt
例：
PCR
谢谢观看
Thanks
2024届高考生物 通过“PCR技术应用”构建PCR类试题 热点解题思维模型 教学课件
(1)利用 PCR 技术扩增 α-淀粉酶基因前，需先获得细菌的________________。 (2)为了便于扩增的 DNA 片段与表达载体连接，需在引物的________端加上限制 性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是 _____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________。
பைடு நூலகம்
(4)基因工程的基本操作流程是：目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建 (基因工程的核心)→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题 意，本基因工程的目的是获得大量的S蛋白，故具体流程为：获取S蛋白基因→ 构建S蛋白基因的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定(检测受体 能否产生S蛋白)。
______________________________________________________________ _______。
解析：(1)分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT-PCR法需要先得 到cDNA，由RNA合成cDNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆 转录酶。(2)PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷 酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时 必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每次循环分为 3步，分别为变性(温度超过90 ℃)、复性(50 ℃左右)、延伸(72 ℃左右)，故其中 温度最低的一步是复性。(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若 核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该个体曾经感染过新冠病毒， 机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为阴性，但由 于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸 检测和抗体检测结果均为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进 行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经感染新冠病毒，为患者。
பைடு நூலகம்
(4)基因工程的基本操作流程是：目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建 (基因工程的核心)→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题 意，本基因工程的目的是获得大量的S蛋白，故具体流程为：获取S蛋白基因→ 构建S蛋白基因的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定(检测受体 能否产生S蛋白)。
______________________________________________________________ _______。
解析：(1)分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT-PCR法需要先得 到cDNA，由RNA合成cDNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆 转录酶。(2)PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷 酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时 必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每次循环分为 3步，分别为变性(温度超过90 ℃)、复性(50 ℃左右)、延伸(72 ℃左右)，故其中 温度最低的一步是复性。(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若 核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该个体曾经感染过新冠病毒， 机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为阴性，但由 于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸 检测和抗体检测结果均为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进 行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经感染新冠病毒，为患者。
PCR技术ppt课件
组成：50mM KCl 10mM Tris.Cl (pH 8.4) 1.5mM MgCl2
Mg2+是Taq酶活性所必需的金属离子。 dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降 低。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非 特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的 活性，使反应产物减少。
（六）PCR反应标准体系
五、PCR的反应条件控制
（一）PCR反应的温度和时间控制
1、变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最
主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以 使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间， 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完 全变性，就会导致PCR失败。
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理， 合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
AFLP
兼并引物PCR
巢氏PC
免疫-PCR(immuno-PCR) 反向PCR
MSP甲基化特异 PCR
（一）温度梯度PCR
1、概念： 通过对复性温度比引物的Tm值低2-
10℃的范围内进行系列PCR预实验来 对复性条件进行优化.
温度梯度PCR
Thermal Image of 45-65°C Gradient
联合逆转录反应（reverse transcription，RT） 与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于 10个拷贝的RNA模板。 2、RNA扩增包括两个步骤： （1）在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合 成RNA的互补cDNA （2）加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引 物退火，并由DNA聚合酶催化物延伸生成双链 靶DNA，最后扩增靶DNA
Mg2+是Taq酶活性所必需的金属离子。 dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降 低。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非 特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的 活性，使反应产物减少。
（六）PCR反应标准体系
五、PCR的反应条件控制
（一）PCR反应的温度和时间控制
1、变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最
主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以 使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间， 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完 全变性，就会导致PCR失败。
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理， 合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
AFLP
兼并引物PCR
巢氏PC
免疫-PCR(immuno-PCR) 反向PCR
MSP甲基化特异 PCR
（一）温度梯度PCR
1、概念： 通过对复性温度比引物的Tm值低2-
10℃的范围内进行系列PCR预实验来 对复性条件进行优化.
温度梯度PCR
Thermal Image of 45-65°C Gradient
联合逆转录反应（reverse transcription，RT） 与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于 10个拷贝的RNA模板。 2、RNA扩增包括两个步骤： （1）在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合 成RNA的互补cDNA （2）加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引 物退火，并由DNA聚合酶催化物延伸生成双链 靶DNA，最后扩增靶DNA
全国卷高考生物一轮复习 精品课件 13.2 PCR技术
1. PCR原理
（2）PCR技术的原理、条件
热变性原理 在80-100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称 为变性；当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链，这 个过程为复性。PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解 聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动控制温度的仪器。
②遵循碱基互补配对原则
③需要引物
④过程可分为变性、复性、延伸等步骤．
A．①②
B．②③
C．③④
√D．①④
PCR技术
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考点
精易讲错精易练混
-13-
3.PCR过程一般经历下述三十多次循环：95℃使模板DNA变性→55℃下复性 →72℃下引物链延伸。下列有关PCR过程叙述不正确的是（ ） A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键 B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依照碱基互补配对原则完成 C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸 D．PCR与细胞中DNA复制相比所需要酶的最适温度较高
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考点
精易讲错精易练混
-14-
3.PCR过程一般经历下述三十多次循环：95℃使模板DNA变性→55℃下复性
→72℃下引物链延伸。下列有关PCR过程叙述不正确的是（ ）
A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键
B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依照碱基互补配对原则完成
√C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸 D．PCR与细胞中DNA复制相比所需要酶的最适温度较高
PCR技术
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考点1
考点2
考点3
1. PCR原理
pcr技术ppt课件
在适中温度下进行延伸，完成一个DNA的复制循环。
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
高考生物专题复习——PCR技术精品PPT课件
The foundation of success lies in good habits
28
谢谢大家
荣幸这一路，与你同行
It'S An Honor To Walk With You All The Way
讲师：XXXXXX XX年XX月XX日
❖合成的方向都是5’→3’。
【基础知识】
二、PCR条件：
➢胞内DNA复制与PCR技术的比较：
解旋 酶
模板 引物 能量+原料 温度 缓冲液 子链合成
胞内DNA复制 解旋酶，边解旋边复制
解旋酶/DNA聚合酶 DNA母链 RNA dNTP 最适温度
Mg2+,缓冲对 半不连续复制
PCR 变性
Taq DNA聚合酶
➢1988年美国穆里斯 （K.Mullis）等人发明，荣 获1993年诺贝尔化学奖。
【基础知识】
一、PCR原理：
➢DNA复制：半保留复制； ➢DNA的热变性原理。
Taq DNA聚合
酶
❖耐高温。
【基础知识】
一、PCR原理：
➢DNA复制：半保留复制；
❖需要提供合成模板；
DNA聚合酶 ❖不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3’-OH；
20世纪自然科学的两大成就
核技术： ➢能量的放大
计算机芯片： ➢信息的集成
20世纪生命科学的两大成就
PCR技术： ➢生命信息的放大
基因芯片： ➢生命信息的集成
高考专题复习
PCR技术
基因工程的基本操作程序的步骤： 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
【基础知识】
三、PCR过程：
28
谢谢大家
荣幸这一路，与你同行
It'S An Honor To Walk With You All The Way
讲师：XXXXXX XX年XX月XX日
❖合成的方向都是5’→3’。
【基础知识】
二、PCR条件：
➢胞内DNA复制与PCR技术的比较：
解旋 酶
模板 引物 能量+原料 温度 缓冲液 子链合成
胞内DNA复制 解旋酶，边解旋边复制
解旋酶/DNA聚合酶 DNA母链 RNA dNTP 最适温度
Mg2+,缓冲对 半不连续复制
PCR 变性
Taq DNA聚合酶
➢1988年美国穆里斯 （K.Mullis）等人发明，荣 获1993年诺贝尔化学奖。
【基础知识】
一、PCR原理：
➢DNA复制：半保留复制； ➢DNA的热变性原理。
Taq DNA聚合
酶
❖耐高温。
【基础知识】
一、PCR原理：
➢DNA复制：半保留复制；
❖需要提供合成模板；
DNA聚合酶 ❖不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3’-OH；
20世纪自然科学的两大成就
核技术： ➢能量的放大
计算机芯片： ➢信息的集成
20世纪生命科学的两大成就
PCR技术： ➢生命信息的放大
基因芯片： ➢生命信息的集成
高考专题复习
PCR技术
基因工程的基本操作程序的步骤： 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
【基础知识】
三、PCR过程：
《PCR检测技术》课件
新一代测序技术的发展为PCR检测
高通量PCR技术的兴起
2
技术带来更大的应用空间和未来发 展前景。
高通量PCR技术的快速发展使得同
时检测多个目标序列成为可能，推
动了高效PCR检测的发展。
3
底物扩增技术的突破
底物扩增技术的不断改进和突破将
为PCR检测技术带来更高的灵敏度
微流控PCR技术的应用
4
和准确性。
PCR反应系统及反应体系的优化
1 优化引物设计
2 优化反应条件
选择合适的引物序列，确保其互补性和 特异性，提高PCR反应的选择性和灵敏 度。
调整反应液的温度、离子浓度和pH等 参数，提高PCR反应的效率和特异性。
3 采用热启动酶
4 控制反应体系污染
使用能在PCR反应开始前抑制活性的热 启动酶，避免非特异性扩增产物的形成。
犯罪学鉴定
DNA指纹技术利用PCR扩增特定DNA区域，通过分析DNA条带模式来确认个体的身份和亲缘 关系。
PCR检测技术的优势与局限
优势
• 高灵敏度 • 高特异性 • 快速便捷
局限
• 易受污染影响 • 需要已知序列的引物设计 • 难以扩增较长的DNA片段
PCR检测技术的发展和前景
1
新一代测序技术的兴起
PCR检测技术
PCR检测技术是一种广泛应用于生物医学领域的分子生物学方法，它通过放大 目标DNA片段，实现高灵敏度的检测和定量。本课件将带您深入了解PCR检测 技术的概述、反应原理、基本步骤，以及其在生物医学中的应用和发展前景。
PCR检测技术概述
W hat is PCR?
PCR（聚合酶链式反应）是一种体外放大DNA片段的技术，它能够在短时间内从极微量的 DNA模板放大到足够数量并进行检测。
高中生物核心概念高考复习课件-PCR技术(共43张PPT)
No. Amplicon Copies of Target
Cycles
2 cycle = 4 Amplicon
1 2 3 4 5
2 4 8 16 32 64 1,048,576
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
PCR反应体系
模板：DNA 引物：P1 P2 DNA聚合酶：Taq 原料：dNTP 反应缓冲液 辅助因子：Mg2+
P1 Mg2+ dCTP dTTP dATP dGTP
Taq
P2
PCR技术的反应条件
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 200umol/L 800ul 引物 100pmol 模板DNA 2ug Taq DNA聚合酶 Mg2+ ol/L 加双或三蒸水至
2018/4/23
DNA的体内复制基本过程
DNA 解旋解链
5’ 3’
合成引物
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
解旋酶解链酶 5’
子链延长
DNA的体内复制基本过程
DNA 解旋解链
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC GGAUCG
End of the 1st PCR Cycle –
Results in two copies of target sequence
每完成一
个循环需2～4 分钟， 2～3 小时就能将待 扩目的基因扩 增放大几百万 倍。
Target Amplification
PCR技术PPT课件
一、PCR的定义：
PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增 技术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
.
2
DNA扩增的传统方法： 一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基 因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛 选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针 杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂， 需数周到数月的时间，且不利于普及。
.
6
3. 延伸 (Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合
酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物 的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的
新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新 一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
.
28
四、PCR反应体系：
常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选
用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓 度进行核算。
.
29
10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
MgCl2: dNTPs:
1.5×30 / 5 = 1.8μl 0.2×30 / 10 = 0.6μl
引物 P：
0.4×30×2 / 10 = 2.4μl
.
5
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步：
1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两
条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling):
PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增 技术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
.
2
DNA扩增的传统方法： 一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基 因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛 选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针 杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂， 需数周到数月的时间，且不利于普及。
.
6
3. 延伸 (Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合
酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物 的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的
新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新 一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
.
28
四、PCR反应体系：
常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选
用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓 度进行核算。
.
29
10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
MgCl2: dNTPs:
1.5×30 / 5 = 1.8μl 0.2×30 / 10 = 0.6μl
引物 P：
0.4×30×2 / 10 = 2.4μl
.
5
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步：
1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两
条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling):
2025版高考生物一轮总复习选择性必修3情境拓展9PCR和基因编辑技术课件
(4)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基 因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌 细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能 大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细 胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：C_R__I_S_P_R_/_C_a_s_9_重__ 组__质___粒__在__受__体__细__胞__内__进__行__转__录__和__表__达__，___转__录__的__产__物__是__S_g_R_N__A_，__表___达__的_ 产__物___是__C_a_s_9_蛋__白__，__二__者__形__成__复__合__体__，___该__复__合__体__中__的__S_g_R_N__A_可__识___别__并__与_ 目__标__D__N_A__序__列__特__异__性__结__合__，__从__而__插__入__到__基__因__组__D_N__A_中_______。
ห้องสมุดไป่ตู้
解析：(1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负 责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需 对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相 同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。
(2)大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞 之前需要用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子 的生理状态。
CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一 条单链向导RNA(SgRNA)引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进 行切割(如图)。
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DNA聚合酶的延伸速度共同决定。 4、循环次数：
多数为25-35，主要取决于模板属性、模板丰度、引物退火 效率DNA聚合酶的扩增能力。裸露DNA、杂质少、高丰度模板、 引物结构好、DNA聚合酶扩增能力强时，循环数宜少，以尽量减 少突变。否则宜多，以保证获得必要的PCR产物量。
2020/3/2
22
94
能研究，但构建好的表达载体必须测序才能证明 PCR产物的身份正确且没有突变。
2、TA克隆
这是目前最通行的PCR产物克隆方法，基本思 路是先将PCR产物与特制的T载体进行连接重组，测 序证明正确无误后，再从T载体上亚克隆到表达载 体上进行功能研究。
Taq酶PCR产物的特点：该酶具有末端转移酶活
性，通常在其产物DNA分子每条链的3’末端加上一个 突出的A。
PCR的特点
50℃
Taq
72℃
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件72℃
PCR的特点
第2轮结束
模板DNA
第1轮扩增 第2轮扩增
PCR反应条件
第PC3R轮过程扩增
PCR的特点
PCR的基本原理
理想拷贝数=2n
重n 循复环次数30轮后
第4轮扩增第5轮2扩3增0=1,0第763轮,扩增741,824 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数
1
2
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
20
1,048,576
30
1,073,741,824
二、有关PCR反应体系常 识
1 缓冲液
10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，pH=8.3-9.0(室温 时约为7.2)，还可有添加剂、共溶剂等。
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性
Mg2+ ol/L
1.5mm
加双或三蒸水至
100ul
PCR Cycle - Step 1 –
Denature template DNA by heat (95 oC)
Target Sequence
Target Sequence
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解 离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准 备；
T载体：通过特定制作技术制作的在多克隆位 点中间已开环的质粒载体，其每条链的3’末端具有 一个突出的T。
TA克隆：将3’末端具一个突出的A的PCR产物与T
载体连接重组，转化大肠杆菌，对鉴定为阳性的重
2020/3/2
35
组克隆子的多克隆位点区的插入片段进行测序，然
3、反向PCR (reverse PCR)
温
度 72
（℃）
55
22
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
5
模板DNA
95℃
PCR的基本原理
引物2
DNA引物
PCR反应条件 PCR过程
PCR Cycle - Step 3 -
At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated
③引物的延伸： DNA模板--引物 结合物在Taq DNA聚合酶的 作用下，以 dNTPs为反应原 料，靶序列为模 板，按碱基配对 与半保留复制原 理，合成一条新 的与模板DNA 互补 链。
辅助因子：Mg2+
Taq
P2
Mg2+
P1
dATP dCTP
dTTP dGTP
PCR技术的反应条件
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物
200umol/L 800ul
10ul 各
引物 100pmol
各10～
模板DNA 2ug
0.1～
Taq DNA聚合酶
2.5u
合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶 序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚 合酶作用下得以延伸。 这种热变性-复性-延伸的 过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这 种循环的不断重复。
PCR反应体系
模板：DNA 引物：P1 P2 DNA聚合酶：Taq 原料：dNTP 反应缓冲液
PCR的特点50℃
引物1
PCR的基本原理
PCR反应条件
PPCCRR过的程特点72℃
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件72℃
PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
PCR的基本原理
Taq
Taq
Taq
PPCCRR反过应程条件95℃
➢ 引物长度一般以18～30bp为宜，过短降低特异性，过长会引 起退火时结合的模板数减少，降低反应效率。
➢ 解链温度(Tm值)很重要，直接决定了扩增中可使用的退火温 度(Ta值)的高低，两条引物间的Tm值越接近越好。
➢ 避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构。 引物3’端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任何 修饰，也不能形成二级结构的可能。
合成引物
5’
DNA
AUCGCGATAGCGTAGCTGCGAGG聚AT合C酶G3’
子链延长
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
1985 年 ， 美 国 PE-Cetus 公 司 的 Mullis等人发明了聚合酶链反应 （PCR）
基本原理是在试管中模拟细胞内 的DNA复制
有多种，均从耐热性的细菌中分离出来，均耐高温，普遍 具有5’→3’聚合酶和5’→3’外切酶活性。常用的有：1）Taq DNA聚合酶 2）Tth DNA聚合酶 3）Vent DNA聚合酶 4）
Pwo DNA聚合酶 5）Pfu DNA聚合酶 6）混合DNA聚合酶。
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19
PCR引物的设计一般原则
最 初 采 用 E.coliDNA 聚 合 酶 进 行
PCR，由于该酶不耐热，使这一过 程耗时，费力，且易出错
耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能 高效率的进行，随后PE-Cetus公 司推出了第一台PCR自动化热循环 仪
Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组 织的粗提DNA
PCR操作（录像）
PCR中其它注意的事项
1.防止污染
试剂小量分装 吸头及EP管(离心管)一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作
2.设立对照：
阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板、无模板 试剂对照： 除模板外的所有组分
PCR应用举例
PCR的特点 灵敏度高
1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞 3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU 4.细菌检测的最小检出率为3个细菌
简便、快速
1.一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 2.扩增产物一般用电泳分析
对标本的纯度要求低
丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。
2、脱氧三磷酸核苷(dNTPs)
dATP、dGTP、dCTP、dTTP四种的等量混合物。
3、引物 使用浓度为0.1-0.5 mol/L。浓度过低则产量低，过高则
易导致错配。
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18
4、模板
单、双链DNA均可。一个PCR反应中104至107个模板分子可 获得较理想的效果，但由于PCR较灵敏，更少的模板分子数在 循环数增加时也会得到大量扩增。不能混有蛋白酶、核酸酶、 DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类，模板纯度不高往往是限制 PCR扩增的重要因素。 5、耐热性的DNA聚合酶
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十 余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆 炸年,穆利斯荣获1993年度诺贝尔化学奖。
Mullis 的构思
引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR技术原理和基本操作
一、PCR的基本原理
类似于DNA的体内复制。 首先待扩增DNA•模板加热变性解链，随之将反应混
3’
解旋解链
GGAUCG
引物酶 5’
合成引物
5’ 引物酶
AUCGCG
子链延长
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
DNA的体内复制基本过程
DNA
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链 聚D3合N’A酶TAGCGCTATCGCATCGACGGCGTAUCG 5’
三、PCR反应程序
1、常规程序：
94℃左右预变性几十秒至几分钟；
94℃左右变性10秒至1分钟；
50-65℃左右退火30秒至1分钟； 20-35个循环
多数为25-35，主要取决于模板属性、模板丰度、引物退火 效率DNA聚合酶的扩增能力。裸露DNA、杂质少、高丰度模板、 引物结构好、DNA聚合酶扩增能力强时，循环数宜少，以尽量减 少突变。否则宜多，以保证获得必要的PCR产物量。
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能研究，但构建好的表达载体必须测序才能证明 PCR产物的身份正确且没有突变。
2、TA克隆
这是目前最通行的PCR产物克隆方法，基本思 路是先将PCR产物与特制的T载体进行连接重组，测 序证明正确无误后，再从T载体上亚克隆到表达载 体上进行功能研究。
Taq酶PCR产物的特点：该酶具有末端转移酶活
性，通常在其产物DNA分子每条链的3’末端加上一个 突出的A。
PCR的特点
50℃
Taq
72℃
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件72℃
PCR的特点
第2轮结束
模板DNA
第1轮扩增 第2轮扩增
PCR反应条件
第PC3R轮过程扩增
PCR的特点
PCR的基本原理
理想拷贝数=2n
重n 循复环次数30轮后
第4轮扩增第5轮2扩3增0=1,0第763轮,扩增741,824 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数
1
2
2
4
3
8
4
16
5
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6
64
20
1,048,576
30
1,073,741,824
二、有关PCR反应体系常 识
1 缓冲液
10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，pH=8.3-9.0(室温 时约为7.2)，还可有添加剂、共溶剂等。
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性
Mg2+ ol/L
1.5mm
加双或三蒸水至
100ul
PCR Cycle - Step 1 –
Denature template DNA by heat (95 oC)
Target Sequence
Target Sequence
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解 离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准 备；
T载体：通过特定制作技术制作的在多克隆位 点中间已开环的质粒载体，其每条链的3’末端具有 一个突出的T。
TA克隆：将3’末端具一个突出的A的PCR产物与T
载体连接重组，转化大肠杆菌，对鉴定为阳性的重
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组克隆子的多克隆位点区的插入片段进行测序，然
3、反向PCR (reverse PCR)
温
度 72
（℃）
55
22
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
5
模板DNA
95℃
PCR的基本原理
引物2
DNA引物
PCR反应条件 PCR过程
PCR Cycle - Step 3 -
At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated
③引物的延伸： DNA模板--引物 结合物在Taq DNA聚合酶的 作用下，以 dNTPs为反应原 料，靶序列为模 板，按碱基配对 与半保留复制原 理，合成一条新 的与模板DNA 互补 链。
辅助因子：Mg2+
Taq
P2
Mg2+
P1
dATP dCTP
dTTP dGTP
PCR技术的反应条件
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物
200umol/L 800ul
10ul 各
引物 100pmol
各10～
模板DNA 2ug
0.1～
Taq DNA聚合酶
2.5u
合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶 序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚 合酶作用下得以延伸。 这种热变性-复性-延伸的 过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这 种循环的不断重复。
PCR反应体系
模板：DNA 引物：P1 P2 DNA聚合酶：Taq 原料：dNTP 反应缓冲液
PCR的特点50℃
引物1
PCR的基本原理
PCR反应条件
PPCCRR过的程特点72℃
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件72℃
PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
PCR的基本原理
Taq
Taq
Taq
PPCCRR反过应程条件95℃
➢ 引物长度一般以18～30bp为宜，过短降低特异性，过长会引 起退火时结合的模板数减少，降低反应效率。
➢ 解链温度(Tm值)很重要，直接决定了扩增中可使用的退火温 度(Ta值)的高低，两条引物间的Tm值越接近越好。
➢ 避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构。 引物3’端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任何 修饰，也不能形成二级结构的可能。
合成引物
5’
DNA
AUCGCGATAGCGTAGCTGCGAGG聚AT合C酶G3’
子链延长
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
1985 年 ， 美 国 PE-Cetus 公 司 的 Mullis等人发明了聚合酶链反应 （PCR）
基本原理是在试管中模拟细胞内 的DNA复制
有多种，均从耐热性的细菌中分离出来，均耐高温，普遍 具有5’→3’聚合酶和5’→3’外切酶活性。常用的有：1）Taq DNA聚合酶 2）Tth DNA聚合酶 3）Vent DNA聚合酶 4）
Pwo DNA聚合酶 5）Pfu DNA聚合酶 6）混合DNA聚合酶。
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PCR引物的设计一般原则
最 初 采 用 E.coliDNA 聚 合 酶 进 行
PCR，由于该酶不耐热，使这一过 程耗时，费力，且易出错
耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能 高效率的进行，随后PE-Cetus公 司推出了第一台PCR自动化热循环 仪
Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组 织的粗提DNA
PCR操作（录像）
PCR中其它注意的事项
1.防止污染
试剂小量分装 吸头及EP管(离心管)一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作
2.设立对照：
阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板、无模板 试剂对照： 除模板外的所有组分
PCR应用举例
PCR的特点 灵敏度高
1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞 3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU 4.细菌检测的最小检出率为3个细菌
简便、快速
1.一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 2.扩增产物一般用电泳分析
对标本的纯度要求低
丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。
2、脱氧三磷酸核苷(dNTPs)
dATP、dGTP、dCTP、dTTP四种的等量混合物。
3、引物 使用浓度为0.1-0.5 mol/L。浓度过低则产量低，过高则
易导致错配。
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4、模板
单、双链DNA均可。一个PCR反应中104至107个模板分子可 获得较理想的效果，但由于PCR较灵敏，更少的模板分子数在 循环数增加时也会得到大量扩增。不能混有蛋白酶、核酸酶、 DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类，模板纯度不高往往是限制 PCR扩增的重要因素。 5、耐热性的DNA聚合酶
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十 余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆 炸年,穆利斯荣获1993年度诺贝尔化学奖。
Mullis 的构思
引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR技术原理和基本操作
一、PCR的基本原理
类似于DNA的体内复制。 首先待扩增DNA•模板加热变性解链，随之将反应混
3’
解旋解链
GGAUCG
引物酶 5’
合成引物
5’ 引物酶
AUCGCG
子链延长
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
DNA的体内复制基本过程
DNA
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链 聚D3合N’A酶TAGCGCTATCGCATCGACGGCGTAUCG 5’
三、PCR反应程序
1、常规程序：
94℃左右预变性几十秒至几分钟；
94℃左右变性10秒至1分钟；
50-65℃左右退火30秒至1分钟； 20-35个循环