离子交换层析
离子交换层析的原理
离子交换层析的原理
离子交换层析是一种分离和富集离子的技术，基于离子的交换作用在固体和液相之间。
其原理主要基于离子的电荷和大小的差异，通过固体材料与溶液中的离子之间的相互作用，实现离子的分离和分析。
在离子交换层析过程中，采用具有离子交换基团的固体材料作为吸附剂。
这些固体材料通常是树脂或凝胶，具有高度交联的结构，能够提供大量的交换位点。
这些交换基团可以选择性地吸附相应离子，并释放其他离子。
离子交换层析的过程可以分为两个步骤：吸附和洗脱。
在吸附步骤中，固体材料中的交换基团与溶液中的目标离子发生相互作用，使目标离子被固定在固体表面上。
这种相互作用可以是电静力吸引力、静电作用力或配位作用等。
在洗脱步骤中，采用适当的洗脱剂，通过改变溶液条件，如pH值、离子浓度等，来解离吸附在固体表面上的离子，并将其溶解出来。
这样就实现了对离子的分离和富集。
离子交换层析的选择性主要取决于固体材料表面上的交换基团和目标离子之间的相互作用力。
不同的交换基团对离子的选择性也不同，可以选择适合分离目标离子的交换基团。
除了选择性外，离子交换层析的分离效果还与溶液条件、交换剂用量、洗脱剂的选择等因素有关。
因此，在进行离子交换层析实验时，需要根据具体情况进行优化条件，以达到较好的分
离效果。
总的来说，离子交换层析是一种常用的离子分离和富集技术，通过固体材料与溶液中离子之间的交换作用，实现离子的分离和富集。
其原理基于离子之间的相互作用力以及交换基团的选择性，通过调控条件和洗脱剂，达到对离子的有效分离。
离子交换层析
样品进柱
离子交换层析的基本操作
为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20% 为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高
交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数
样品洗脱
恒定洗脱
离子交换层析的基本操作
分子浓度 离子强度
pH值
阶段洗脱
梯度洗脱
弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱
弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换树脂：
最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯 乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物
离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大， 因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化
离子交换层析
离子交换层析的基本原理 离子交换介质的基本性质 离子交换介质的选择原则 离子交换层析的基本操作
离子交换层析的基本原理
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为 流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混 合物中不同离子进行分离的层析技术。
离子交换介质的基本性质
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换葡聚糖：
离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三 维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（Sephadex G） Sephadex的优点如下：
亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核 酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小
10 20 30 40 50 60 70 80 90
生化技术第六章 离子交换层析
3.不同离子型交换剂的选择 原则：选择结合力较小的反离子，有利于提高交 换容量。 强阳性——选H型；强阴性——选OH型； 弱酸性——选Na型；弱碱性——选Cl型。 4.不同基质离子交换剂的选择 疏水性的树脂交联度大，空隙小，大分子很难进 入，且骨架的疏水性不利于蛋白质的稳定。分离 大分子物质时一般用亲水性的基质。
疏水性离子交换剂
疏水性离子交换剂中的基质是人工合成的、与水结合
力较小的树脂。常用的树脂是由苯乙烯和二乙烯苯合成的
聚合物，其中二乙烯苯是交联剂，能把聚乙烯苯直链化合
物连接成类似海绵状的结构，在此结构中以共价键引入不
同的电荷基团。离子交换树脂以电荷基团的性质分则有：
阳离子交换树脂、阴离子交换树脂(分别包括强、中、弱
三、分离原理 离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主
要以离子交换方式进行。
假设以R-A+代表阳离子交换剂，其中A+为反离子，A+
能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应，反应式
为：R-A++B+
R-B++A+
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力， 这种结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。
+
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生物分离工程-离子交换层析(色谱)-精选文档
羟基磷灰石层析
羟基磷灰石（hydroxyapatite, HAP): 是一种磷酸钙晶体，基本分子结构为
Ca ( PO ) ( OH ) 10 4 6 2
一般认为，HAP的吸附主要基于钙高子和磷酸根离子 的静电引力，即在HAP晶体表面存在两种不同的吸附晶面， 各存在吸附点c点和P点，前者起阴离于交换作用，后者 起阳离于交换作用．因此，在中性pH环境下酸性蛋白质 (pI<7)主要吸附于c点，碱性蛋白质(PI>7)主要吸附于P 点．利用磷酸盐缓冲液(K2HP04+KH2PO4）为流动相洗脱展 开时，磷酸根离子在c点竞争性吸附，交换出酸性蛋白质 ，而K+在P点竞争性吸附，交换出碱性蛋白质。所以HAP层 析通常以磷酸盐缓冲液为流动相，采用提高盐浓度的线 性梯度洗脱法。
多缓冲离子交换剂:
可利用普通的凝胶过滤介质偶联特殊的离子交换基制 备．如Pharmacia公司生产的PBEll8和94即为以Sepharose 6B 为载体的阴离子交换剂，前者与Pharmalyte 匹配使用，后 者与Polybuffer96和Polybuffer 74匹配使用。
Pharmacia生产的另一种多缓冲离子交换剂为Mono P，其离于交换基为具有不同pKa值的弱碱性胺基．Mono P可与上述三种多缓冲剂匹配使用，粒径仅10m，用作 高效层析聚焦柱的固定相。
poros层析介质包括离子交换疏水作用亲和吸附和反相介质等其中前三种介质的孔表面覆面有葡聚糖等亲水性多糖保证介质表面的亲水性和键合相应的配灌注层析的最大特点是分离速度快一般可在数分钟内完成而利用hplc则需数十分钟到一小时
离子交换层析（色谱）
一、原理
离子交换层析(Ion exchange chromatography, IEC)是 利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂 之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的层析法。 荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式表示：
离子交换层析讲解
三、离子交换剂的种类和性质 1.离子交换剂的基质
• 其中：聚苯乙烯离子交换剂（又称为聚苯乙烯树脂）是以
苯乙烯和二乙烯苯合成的具大、流速快。但它与 水的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的变 性。故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、 核苷酸等。 以纤维素（Cellulose）、球状纤维素（Sephacel）、葡聚 糖（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）为基质的离子交 换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离蛋白质等大分子 物质，葡聚糖离子交换剂一般以Sephadex G－25和G－50 为基质，琼脂糖离子交换剂一般以Sepharose CL－6B为基 质。关于这些离子交换剂的性质可以参阅相应的产品介绍。
离子交换层析
原理及应用
一、简介
• 1、定义：
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换 剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交 换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力 大小的差别而进行分离的一种层析方法
2、发展历程
• 1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交
二、基本原理 阴离子交换
• 通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子
强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加， 洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上 的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置 换出来，随洗脱液流出。 与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来， 而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度 才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与 离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下 来，从而达到分离目的。
X+ Y-↔ A-
二、基本原理
• 从上面的反应式中可以看出，如果A离子与离子交 •
离子交换层析法
五、缓冲液的选择
缓冲液酸碱度的选择，决定于被分离物质的等电点、稳定 性、溶解度和交换剂离子的pK值。使用阴离子交换纤维时要选 用低于pK值的缓冲液，若欲分离的物质属于酸性，则缓冲液的 pH值要高于该物的等电点；用阳离子交换纤维时要选用高于 pK值的缓冲液，目的物属于碱性物质的话，缓冲液要低于该物 等电点的pH值。 缓冲液离子以不干扰分离物活性测定、不影响待测物溶解 度、不发生沉淀为原则，如使用UV吸收法测样品，那么 pyridine或barbital这类会吸收UV的物质就不适用。
三、树脂的选择
最常见的离子交换树脂材质是聚苯乙烯苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene）， 它是由苯乙烯（styrene）和苯二乙烯 （divinylbenzene）聚合产生的三维网状结 构，举例来说，Dow化学公司所生产的树脂 Dowex 50×8，表示含8%苯二乙烯。 具体的，根据交换树脂的性能，树脂可分 为阳离子与阴离子交换树脂：
1. 阳离子交换树脂 分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型树脂含有－R－ SO3H，中强酸型树脂含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2， 弱酸型树脂含有－COOH或－OH。 阳离子交换树脂进行的反应 如下：
2. 阴离子交换树脂 分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有铵盐，四级铵盐 [ － N+(CH3)3] 为强碱型树脂，三级以下铵盐 [－N(CH3)2]、[ － NHCH3]、[ －NH2] 都属弱碱型树脂；同时具有强碱和弱碱型基 团的，为中强碱型的树脂。阴离子交换树脂进行的反应如下：
洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可 逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适 宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目 的物的位置，并回收目的物。
离子交换层析法
离
子
+ OH-
交 换 R-N+（CH3）2 OH- + H2O == R-N+（CH3）2
剂
H·OH-
2．亲水性离子交换剂
磷酸纤维素 CM-纤维素 DEAE-纤维素 CM-交联葡聚糖 DEAE-交联葡聚糖 CM-Sepharose CL-6B
二、离子交换剂性质
颜色与形状 交联度 吸水量或膨胀度 交换容量 稳定性 比重
CA 、CB ＝梯度混合器A瓶、 B瓶的浓度； A1 、B1 ＝A瓶、B瓶的横切面积； V2＝流经层析柱的体积，V1＝梯度洗脱液的总体积。
线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清 白蛋白的图谱
第五节 离子交换拄层析应用
一、去离子水的制备 二、制备、纯化生命物质 二、测定蛋白质的等电点
一价离子：Li+＜Na+＜K+＜Rb+＜Cs+ 二价离子：Mg2+＜Ca2+＜Sr2+＜Ba2+ 一价阴离子：F-＜Cl-＜Br-＜I不同价阳离子：Na+＜Ca2+＜Al3+＜Ti4+
磺酸基树脂和季胺基树脂 对各种离子的相对选择系数
阳离子树脂
反离子 相对选择系数
H+
1.0
Na+
1.5
NH4+
1.95
2、缓冲液离子组成的选择
①缓冲液离子的pK值要接近所用的pH， ②采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，
如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐 ③采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，
如：Tris ④缓冲液离子不影响被分离物的活性、测定、
溶解度。
3、缓冲液离子强度的选择
①起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换 剂结合，一般小于0.1mol/L。
离子交换层析
液。平衡缓冲液的离子强度和pH的选择首先要保证各个待分 离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子 交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交 换剂的结合有较大的差别。
一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。尽量使
杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。在一些情况下可以 使杂质与离子交换剂牢固地结合，而样品与离子交换剂结合 不稳定，也可以达到分离的目的。
离子交换层析的基本操作
（1） 层析柱
离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，
离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和 柱长比一般为1:10到1:50之间，层析柱安装要垂直。装 柱时要均匀平整，不能有气泡。
装柱用于平衡离子交换柱的缓冲
■ 胶体的组成与外型：
Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods p.24
Cellulose Sephcel Monobead
Pharmacia (1980) Separation News: 5
离子交换剂的选择、处理和保存
Buffer: 0.01 M Tris-HCl, pH 8.0
mg / mL gel
Adapted from Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods p.64
影响交换容量的因素很多，主要可分为两个方面。
换剂上的样品组份洗脱下来。
柱效
通过柱子分离得到窄而对称的洗脱峰的能力（分辨率）
装柱的质量
树脂颗粒的大小
正确的洗脱条件
离子交换层析原理
离子交换层析原理离子交换层析是一种常用的离子分离技术，它基于离子在固定相和流动相之间的交换作用，实现了对离子的有效分离和富集。
离子交换层析原理主要包括固定相的选择、离子交换作用和分离机理等方面，下面将详细介绍离子交换层析的原理及其应用。
首先，固定相的选择对离子交换层析具有重要影响。
固定相通常是一种离子交换树脂，它具有一定的离子交换能力，能够与待分离的离子发生交换反应。
树脂的选择应根据待分离离子的性质和要求进行，常见的固定相包括阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。
阴离子交换树脂主要用于富集和分离阳离子，而阳离子交换树脂则用于富集和分离阴离子。
其次，离子交换作用是离子交换层析的核心原理。
在离子交换树脂中，固定相上的功能基团与待分离的离子发生交换反应，使得待分离的离子被富集或分离。
这种交换反应是可逆的，离子在固定相和流动相之间不断进行交换，最终实现离子的分离和富集。
离子交换作用的强弱取决于固定相的性质和离子的性质，如离子的电荷、大小和亲和力等。
离子交换层析的分离机理主要包括吸附-解吸附和排斥-吸附两种模式。
在吸附-解吸附模式中，离子在固定相上被吸附，随后在流动相中解吸附，实现了离子的分离。
而在排斥-吸附模式中，流动相中的离子与固定相上的离子发生排斥作用，随后被固定相吸附，实现了离子的分离。
这两种模式通常会同时存在，共同作用于离子的分离过程。
离子交换层析在实际应用中具有广泛的用途。
它常用于水质分析、生物化学分离、环境监测和工业生产等领域。
例如，离子交换层析可用于水中重金属离子的富集和分离，以及生物样品中蛋白质和核酸的纯化和分离。
此外，离子交换层析还常用于工业废水处理和环境监测中，实现了对有害离子的有效去除和分离。
总之，离子交换层析是一种重要的离子分离技术，它基于离子交换作用和固定相的选择，实现了对离子的有效分离和富集。
离子交换层析的原理及其应用对于理解和掌握离子分离技术具有重要意义，对于相关领域的研究和应用具有重要的指导作用。
离子交换层析法的原理
离子交换层析法的原理
离子交换层析法是一种根据物质带电性质差异，从而实现分离纯化的层析技术。
该方法的原理是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对需要分离的各种蛋白质结合力的差异，而将混合物中不同蛋白质进行分离。
离子交换的本质是目标物和介质功能配基之间的静电相互作用，蛋白质的带电性是由蛋白质多肽中带电氨基酸决定的，而蛋白质中氨基酸的电性又取决于介质中的pH，所以蛋白质的带电性也就依赖于介质的pH。
层析时，离子交换树脂的分子中有活性基并带有阴、阳电荷，在水溶液中可与其它阴、阳离子起交换作用，这种交换作用是可逆的，遵循化学平衡原理。
通过连续添加洗脱液，溶液平衡向右进行，可以把原有离子交换树脂上的活性离子洗脱下来，而带有相同电荷的离子被交换吸附在树脂上，然后被吸附的物质又可用另一种洗脱液洗下来，从而达到分离提取的目的。
离子交换层析
离子交换层析离子交换层析，是一种常用的分离纯化技术，通过固定相上的离子交换剂与溶液中的离子发生置换反应，实现对目标离子的选择性分离。
它广泛应用于水处理、制药、生物技术、食品工业等领域，发挥着重要的作用。
在离子交换层析中，离子交换剂是关键的分离介质。
一般来说，离子交换剂是具有离子可交换功能的均质材料。
根据介质的性质，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂，用于分离以阳离子或阴离子形式存在的目标物质。
离子交换剂的选择应考虑到分离的目标离子的性质和阳离子或阴离子交换剂的特性。
离子交换层析的工作原理是离子在固定相和液相之间的交换作用。
通过溶液中的离子与固定相上的离子交换剂发生反应，固定相上的离子交换剂也可释放出根离子或酸离子以与液相中的离子发生反应。
在离子交换的过程中，目标离子与固定相上的离子交换剂发生选择性的吸附与解吸，实现了目标离子的分离纯化。
离子交换层析的工艺流程通常包括前处理、进料、洗脱和再生等步骤。
前处理是为了使进料溶液与离子交换剂更好地接触，可以采用调整pH值、滤除杂质等方法。
进料环节是将目标离子溶液与离子交换剂接触，使离子发生交换反应。
洗脱是将目标离子被吸附在固定相上的离子交换剂从固定相上解吸出来，采用调整pH值、改变浓度等方法。
再生是将已经吸附的离子交换剂通过一定的操作条件重新得到可再使用的形式。
离子交换层析具有许多优点。
首先，层析介质的选择性强，可以实现高效的纯化分离。
其次，离子交换层析可以在常温下进行，避免了高温条件下目标物质的失活。
再次，操作简单，易于控制，适合大规模工业生产。
此外，离子交换层析还可以实现连续操作，提高生产效率。
总结起来，离子交换层析是一种重要的分离纯化技术，广泛应用于水处理、制药、生物技术、食品工业等领域。
通过选择合适的离子交换剂和优化工艺条件，可以实现对目标离子的高效分离纯化，为各个领域的生产提供了有力的支持。
离子交换层析ionexchangechromatography
强碱 含季胺基团 [-N+(CH3)3] 弱碱 含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2 阴离子互换树脂对化学试剂及热都不如阳离 子互换树脂稳定。
2.离子互换纤维素
▪ 阴离子互换纤维素 —如:DEAE-纤维素 pH8.6下列分离中性或酸性物质,具二乙 胺乙基
▪ 阳离子互换纤维素—如:CM-纤维素 一 般pH>4条件下使用,具有羧甲基
2、检测：从第2管起每搜集管中加入2ml茚三 酮显色液，充分混合，沸水浴15分钟，自 来水冷却，观察氨基酸与茚三酮旳显色反 应，若生成紫色化合物，则阐明搜集到氨 基酸。
Separation of amino acids on a cation exchange column
Different types of ion exchange resins (a) Cation exchanger (b) Anion exchanger.
O OH
O
－CO2
R CH COOH +
NH2
O R
N CH2
－2H2O
O R
N CHCOOH
O O
H
R H2O
N CH
RCHO +
O O
H NH2
O OO
H N
O
O
OH OH
O
O O
H N
O O
O
O
紫色物质，用于α－氨基酸旳比色测定和纸层析显色
▪
Asp
His
▪ pH4.2
▪ pH >10
[器材]
原则：不能发生化学反应，所带电荷应与样 品一致。防止使样品变性
(三)洗脱剂 原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活 泼旳离子或基团
离子交换层析
离子交换层析在各方面的应用离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。
在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。
【2】2009年方希修，王冬梅等人应用平板式膜超滤技术与DEAE高子交换层析法对卵黄免疫球蛋白(IgY)进行分高纯化，经DEAE离子交换层析得到高纯度的IgY。
【4】2010年马江涛、陈昕等人使用Bio—Rad的DiaSTAT糖化血红蛋白检测系统(LPLC)和Biosystem.S.A的微柱离子交换层析法分别测定糖化血红蛋白，并进行精密度、网收率、干扰闪素及相关性的比较分析,证明了离子交换层析法测定糖化血红蛋白的方法适合临床常规应用。
【5】2010年蒋超，张或等人用超滤、阳离子交换层析方法从热钙法处理过的干酪乳清中分离纯化乳铁蛋白，其纯度达93.6%。
近年来，随着合成技术的发展和生产的需要，人工合成的刚性材料被陆续开发出来，这也是未来离子交换介质发展的一个趋势。
1.层析分离纯化家兔血清PONl条件的优化代恒、赵敏等人报道，Paraoxonase(PONl)是--个钙离子依赖的酯酶，它可以水解包括有机磷类，芳香酯类在内的多种化合物。
作为一种生物酶，PONl 可以在普通的生物环境下将有机磷类毒剂迅速水解，使之分解为无毒或低毒的化合物。
存在于血清中的PONl，可达到在有机磷毒物到达它的生物受体之前将其清除的目的。
在本研究中，使用Cibacron Blue F3GA琼脂糖的假亲和层析得到初步分离富含PONl的Cibacron流分，选定DEAE Sepharose Fast Flow为离子交换层析介质，通过AKTA purifier全自动层析仪，在PH值分别为7．0，7．5，8．0，8．5，9．0，9．5条件下对Cibacron流分进行离子交换层析。
离子交换层析纯化蛋白质的原理
离子交换层析纯化蛋白质的原理离子交换层析是一种重要的蛋白质分离纯化技术。
其原理是利用离子交换树脂库中树脂的静电荷性吸附靶分子，通过调节合适的洗脱条件使目标蛋白质逐步从树脂上溶解剂洗脱，最终获得高纯度的目标蛋白质。
离子交换层析基于了离子之间相互作用的原理。
树脂表面带有离子团，使得树脂能够吸附离子性化合物。
离子性化合物在电解质溶液中通常呈现出离子化的形式，离子化能力与化合物本身的酸碱性及离子外壳多少有关。
不同的离子性化合物在电解质水溶液中，因其不同的离子半径和电荷量而表现出不同的离子吸附效应，因此可通过调节离子交换树脂的固有电荷性质，控制所吸附蛋白质的亲和力。
一般来说，离子交换树脂会分为两种：阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。
阳离子交换树脂通常带有负电荷，用于吸附正电荷的蛋白质，如赖氨酸、精氨酸等。
阴离子交换树脂带有正电荷，用于吸附负电荷的蛋白质，如天冬酰胺酸、谷氨酸等。
蛋白质在交换树脂上的吸附与蛋白质表面的极性、电荷以及交换树脂的化学性质有关。
在离子交换层析中，吸附规律通常分为两种类型：强吸附和弱吸附。
强吸附是指交换树脂与目标蛋白质之间的非常紧密的结合，需要用高盐度、酸性或碱性的溶液才能使其从树脂上溶解剂洗脱。
相反，弱吸附是指交换树脂与目标蛋白质较松散的结合，可通过一些较弱溶剂去除目标蛋白质。
离子交换层析的优点在于具有高纯度和针对性、操作简便等特点，适用于表达量较高的蛋白质分离。
然而，由于蛋白质的结构多样性和多样化，交换树脂吸附效应的不确定性，以及强洗脱所带来的影响，都可能导致影响纯度和可行性的问题。
因此，在离子交换层析前，必须对样品的基本性质进行详细的研究和解析，以确定适当的实验条件，并实现当代生物技术领域的进一步深化。
离子交换层析实验报告
离子交换层析实验报告
实验目的：
通过离子交换层析技术，分离和纯化溶液中的离子。
实验原理：
离子交换层析技术是一种基于化学亲和力原理的分离技术，常
用于分离带电离子物种。
实验中，采用了阴离子交换树脂进行离
子交换层析。
树脂中固定有一定数量的正离子，来吸附溶液中的
负离子。
随着流动相的进出，树脂的正离子与溶液的负离子不断
交换，从而实现分离和纯化。
实验步骤：
1. 将阴离子交换树脂装入离子交换层析柱中，平衡至稳定状态；
2. 将样品溶液均匀注入离子交换层析柱，并以一定的流速进行
洗脱；
3. 通过读取峰值吸收率、紫外吸收率或放射性测量结果，确定分离物种的含量和纯度；
4. 再次平衡和清洗层析柱。
实验结果：
通过经过层析柱后的溶液，我们成功地分离出了目标离子，并得到了较高的纯度。
最终结果如下：
目标离子浓度：0.45mol/L
分离纯度：99.6%
实验结论：
离子交换层析技术是一种基于化学亲和力原理的有效分离和纯化方法。
在实验中，通过使用阴离子交换树脂，我们成功地分离出目标离子，并获得了高纯度的样品。
实验结果表明，离子交换层析技术在化学、生物等领域有着广泛的应用前景。
离子交换层析失败
离子交换层析失败
离子交换层析是一种常用的生物分离技术，如果离子交换层析失败，可能是由以下原因导致的：
1. 柱子选择不合适：柱子的选择对于离子交换层析的成功至关重要。
柱子的类型、颗粒大小、孔径等参数应根据目标蛋白质的特性进行选择。
如果柱子选择不合适，可能导致分离效果差或无法分离。
2. 缓冲液选择不当：缓冲液的选择会影响蛋白质与离子交换树脂的结合和解离。
缓冲液的 pH 值、离子强度和组成成分应根据目标蛋白质的等电点和稳定性来确定。
如果缓冲液选择不当，可能导致蛋白质无法结合或洗脱不完全。
3. 上样条件不正确：上样时，蛋白质溶液的浓度、体积和流速等条件会影响分离效果。
过高的上样浓度可能导致柱子过载，导致分辨率下降。
过快的流速可能导致蛋白质与树脂的结合不充分。
4. 洗脱条件不适当：洗脱条件包括洗脱缓冲液的种类、离子强度和 pH 值等。
如果洗脱条件不适当，可能导致目标蛋白质无法有效洗脱或洗脱不完全。
5. 柱子老化或污染：柱子在多次使用后可能会老化或受到污染，导致层析效果下降。
定期进行柱子的再生和清洗可以延长柱子的使用寿命。
6. 蛋白质性质异常：某些蛋白质可能具有特殊的性质，如高电荷、疏水性或分子量过大，这可能导致离子交换层析效果不佳。
对于这类蛋白质，可能需要尝试其他分离方法或进行预处理。
为了解决离子交换层析失败的问题，可以采取以下措施：仔细检查实验条件和步骤，优化柱子选择、缓冲液条件、上样和洗脱条件等。
如果问题仍然存在，可以考虑尝试其他分离方法或与专业人士进行讨论和咨询。
离子交换层析
1．上样阶段，此时离子交换剂与平衡离子结合；（平衡 阶段）
2．吸附阶段，混合样品中的分子与离子交换剂结合； 3．开始解吸阶段，杂质分子与离子交换剂之间结合较弱
而先被洗脱，目标分子仍处于吸附状态； 4．完全解吸阶段，目标分子被洗脱； 5．再生阶段，用起始缓冲液重新平衡层析柱，以备下次
使用。
On the evening of July 24, 2021
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两性离子如蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离
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子交换剂的结合力，主要取决于它们的物理化学性质和在
特定pH条件下呈现的离子状态。当pH低于等电点(pI)时，
它们带正电荷能与阳离子交换剂结合；反之，pH高于pI时，
此外，还可用于分离某些不易变性的蛋白质。
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阳离子交换树脂对氨基酸的分离
疏水性的离子交换剂对带 电荷多和疏水性强的被分 离物有较强的截留能力。
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RB++A+
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离子交换色谱中所进行的离子交换过程（以阳离子交换树脂为例）
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实验二离子交换层析纯化兔血清IgG【原理】DEAE-Sephadex A-50 （二乙氨基- 乙基- 葡萄糖凝胶A-50 ）为弱碱性阴离子交换剂。
用NaOH 将Cl - 型转变为OH - 型后，可吸附酸性蛋白。
血清中的γ球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85 ～7.5 ），其余均属酸性蛋白。
pH7.2 ～7.4 的环境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50 吸附，只有γ球蛋白便可在洗脱液中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG 。
【试剂与器材】1. DEAE-Sephadex A-502.0.5mol/L HCl 和NaOH3.0.1mol/L pH7.4 PBS4.0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4)5.0.02 ％NaN 36.PEG7. 无水乙醇8. 紫外分光光度计9.1cm×20cm 玻璃层析柱10. 自动部分收集器【操作步骤】1 ．DEAE-Sephadex A-50 预处理称DEAE-Sephadex A-50 （下称A-50 ）5g ，悬于500ml 蒸馏水内，1h 后倾去上层细粒。
按每克A-50 加0.5mol/L NaOH 15ml 的比例，将浸泡于0.5mol/L NaOH 液中，搅匀，静置30min ，装入布氏漏斗（垫有2 层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH 呈中性；再以0.5mol/L HCl 同上操作过程处理，最后以0.5mol/L NaOH 再处理一次，处理完后，将A-50 浸泡于0.1mol/L pH7.4 PBS 中过夜。
2 ．装柱（1 ）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。
（2 ）将0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 沿玻璃棒倒入柱中至1/4 高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50 。
待A-50 凝胶沉降2 ～3cm 高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min ，同时连续倒入糊状A-50 凝胶至所需高度。
（3 ）关闭出水口，待A-50 凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。
3 ．平衡启开出水口螺旋夹，控制流速4 滴/min ，使约2 倍床体积的洗脱液流出。
并以pH 计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH 值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。
4 ．加样及洗脱启开上口橡皮塞及下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（0.5ml 血清，体积应小于床体积的2% ，蛋白浓度以＜100mg 为宜）。
松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2 ～ 3 次；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。
并控制流速，4 滴/min.5 ．收集开始洗脱的同时就以试管进行收集；每管收集4ml. 共收集10 ～15 管。
6 ．测蛋白以751 型紫外分光光度计分别测定每管A 260 ，按公式计算各管蛋白含量。
并以A 280 为纵坐标，绘制洗脱曲线。
`7 ．合并、浓缩将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG （Mw6000 ）浓缩至所需体积，加入0.02 ％NaN 3 防腐，于4℃保存备用。
长期保存时应贮于-40℃冰箱。
8 ．A-50 凝胶的再生在柱上先以2mol/L NaCl 洗脱杂蛋白至流出液的 A 280 <0.02 ，再以蒸馏水洗去柱中盐。
然后按预处理过程将A-50 再处理一遍即达再生。
近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存；近期不用时，以无水酒精洗2 次，再置50℃温箱烘干，装瓶内保存。
离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。
（一）原理在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。
如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素。
在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素―O―C6H14 N+ H，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。
当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。
纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO－），其反离子为阳离子（如Na+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。
溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。
反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。
溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。
反之则越少。
血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异，以白蛋白为最多，依次为球蛋白，球蛋白和球蛋白。
在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。
由于各种蛋白质所带的电荷不同。
它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。
交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。
当Cl-的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl- 浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。
因此，在离子交换层析中，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。
一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。
pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。
pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。
当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。
当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。
（二）常用离子交换剂的种类与特性1.离子交换纤维素离子交换纤维素的种类很多，其种类与特性如表1－1所示。
表1-1 离子交换剂的类型与特点在交换纤维素中，最常用的是DEAE―纤维素和CM纤维素。
由于剂型不同，其理化性质和作用也有所差异。
一般而言，微粒型要优于纤维素型，因为微粒型是在纤维素型的基础上进一步提炼而成。
它的交换容量大，粒细、比重大，能装成紧密的层析柱，要求分辨力高的实验可用此型纤维素（见表1－2）。
离子交换纤维素的优点为：①离子交换纤维素为开放性长链，具有较大的表面积，吸附容量最大；②离子基团少，排列稀疏，与蛋白质结合不太牢固，易于洗脱；③具有良好的稳定性，洗脱剂的选择范围广。
2．离子交换交联葡聚糖离子交换交联葡聚糖也是广泛使用的离子交换剂，它与离子交换纤维素不同点是载体不同，常用交联葡聚糖的类型与特性见表1-3。
非特异性吸附少；③交换容量大。
离子交换葡聚糖的选用，一般根据蛋白质的分子量而定。
中等分子量（30 000-200 000）一般选A50 和C50，而低分子量（＜30 000和高分子量＞200 000）均宜选用A25和C25 。
（三）试验方法阴离子交换剂与阳离子交换剂的装柱和层析过程基本相同。
交联葡聚糖的预处理只需充分溶胀和平衡，不需要除去细粒碎片和酸碱处理。
其他步骤也基本同离子交换纤维素。
1．剂型的选择根据蛋白质在所用缓冲液pH值下带电荷的种类选择，如pH高于蛋白质等电点，应选阴离子交换剂，反之应选阳离子交换剂。
一般情况下，DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白，而CM纤维素用于分离碱性蛋白质。
下面以DEAE-纤维素操作为例，介绍试验方法2．膨胀活化此步的目的在于除去杂质，暴露DEAE-纤维素上的极性基团。
DEAE-纤维素的用量则根据柱容积的大小和所需过柱样品的量来决定。
一般是1.0g DEAE-纤维素相当于6ml～8ml柱床体积。
15倍NaOH液），浸泡1h左右，不时搅拌。
抽滤（以布氏漏斗加两层滤纸或尼龙纱布抽滤），以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将纤维素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h，同样抽滤液至近中性。
再将纤维素浸于0.5Mol/L NaOH 液中，同样处理，洗至中性。
3．平衡将DEAE―纤维素放入0.0lMol/L pH 7.4 PB液中（即起始缓冲液），静止1h，不时搅拌，待纤维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体的pH值与加入的PB液的pH值相近时为止。
4．装柱层析柱的选择要大小、长度适当。
一般而言，柱长和柱直径之比为10：1～20：1，柱的内径上下要均匀一致。
用前将层析柱在清洁液内浸泡处理24h，然后依次用常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤。
装柱时，先剪一块圆形的尼龙纱布（直径与层析柱内径一致），放入层析柱底部。
将柱下端连接细塑料管，夹上螺旋夹。
把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一半的柱高，除去死区及塑料管内的气泡。
再将平衡的DEAE －纤维素糊状物沿管壁倒入柱中。
注意不要产生气泡，如有气泡应排除或重装。
拧开螺旋夹，使流速至1ml/5min，待缓冲液快接近纤维素面时，继续倒入纤维素糊，同时用玻璃棒搅拌表面层，以免使两次加入的纤维素形成分界层，通过进出缓冲液调节流量，也可通过塑料管的升降来控制，至柱床体积不变为止。
剪一圆形滤纸（与柱内径大小一致），从柱的上端轻轻放入，使其沉接于纤维素床表面，以免在加样时打乱纤维素层。
装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层。
继续平衡，使流出液的pH值与流入液的pH值完全一致为止。
5．上样要层析的样品首先必须用起始缓冲液（4℃）平衡过夜，中间可换液数次。
将柱的上端打开，用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入。
沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱纤维素表层。
拧开下端的螺旋夹，使样品进入交换剂中，快要进完时，加1ml～2ml缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。
样品的加量与DEAE―纤维素有一个最适比的关系，超过这个比值，吸附就不完全，直接影响到分离的纯度。
经过粗提的―球蛋白50mg～100mg，用干重约4g DEAE－纤维素装柱分离，可获得理想结果。
6．洗脱对于阴离子交换剂而言，洗脱的办法是使pH逐渐降低，而离子浓度逐渐升高。
一般的办法，是稳定一个因素而改变另一个因素洗脱。
洗脱可采用分段洗脱和连续洗脱法，前者较实用，后者较准确。
当蛋白液下来时，开始分管收集，至无蛋白液为止。
8．交换柱的再生将使用过的DEAE－纤维素移入烧杯中，用2Mol/L NaCl 液浸泡，抽滤并洗涤数次。