质粒转化、细胞转染步骤
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转化:将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性。转染(transfection):将含有目的gene的载体转到真核cell内
转导:指以噬菌体为载体,在细菌之间转移DNA的过程。有时也指在真核cell之间通过逆转录病毒转移和获得cellDNA的过程。
1.质粒转染(transfection)
6-well-plate每well60-70%时transfection
接种时2.5×105个/ml/well
质粒DNA转染液优化培养基opti-MEM
步骤:2.5ug质粒DNA+200ulopti-MEM+6ul转染液混匀室温静置15min 待转染cell换优化培养基opti-MEM1.3ml,切记要轻轻加培养基,勿冲起cell
把transfectioncomplex(200ul)轻轻均匀滴入cell培养基中,十字形摇晃plate,混匀
37℃,CO2培养箱培养
2.
转化:外源DNA(质粒作为载体)导入受体细胞(大肠杆菌感受态cell)步骤:
50ul感受态cell(一管)加入12ul质粒DNA→轻柔混合
↓
冰浴30min
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42℃热激90s
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迅速冰浴2min
↓
向管中加入培养基,混匀后37℃震荡培养(﹤225rpm)1h,使细菌恢复正常生长状态
↓
涂板正培1h后,倒培过夜