植物蛋白酶提取纯化工艺
菠萝蛋白酶的提取实验报告
菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定12食安2班陈志廉摘要本文阐述了通过运用高速离心法提取粗酶，盐析分离提纯，透析除杂等方法提取出了菠萝蛋白酶并将其初步分离纯化且测定了各个步骤的酶活性的过程。
关键词菠萝蛋白酶纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。
其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。
本文主要验证了从新鲜菠萝皮中提取菠萝蛋白酶并将之纯化的方法，以求改进工艺等。
1实验材料与仪器1.1实验材料与试剂新鲜菠萝、0.1mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、0.01mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、1％酪蛋白、激活剂、10％三氯乙酸(TCA)、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G2501.2实验仪器722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司；AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司；BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司；DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2实验方法2．1菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm 离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。
生姜蛋白酶提取工艺- 副本
生姜蛋白酶提取纯化工艺研究1 生姜蛋白酶的常规提取纯化工艺1.1 生姜蛋白酶的提取取外形完好，无机械损伤和腐烂，富含纤维的生姜50 g，切成小块，按料液比1：2加入磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5），研磨匀浆30 min，所得浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）洗涤后，收集滤液4℃静置2 h，冷冻离心（10000rpm，5 min）去除沉淀，上清液用磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）定容至100mL（生姜蛋白酶溶液A），4℃冰箱贮存待用。
取样按4.1方法测定蛋白质含量，按4.2方法测定酶活。
1.2 乙醇沉淀法取生姜蛋白酶溶液A20mL，加入1.5 倍的无水乙醇进行沉淀，4℃静置 2 h后，冷冻离心（10000rpm，5 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。
沉淀用0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至10mL（生姜蛋白酶溶液B）。
取样按4.1方法测定蛋白质含量，按4.2方法测定酶活。
1.3 丙酮沉淀法取生姜蛋白酶溶液A20mL，加入1.5 倍的4℃预冷丙酮进行沉淀，4℃静置2 h后，冷冻离心（10000rpm，5 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。
沉淀用0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至10mL（生姜蛋白酶溶液C）。
取样按4.1方法测定蛋白质含量，按4.2方法测定酶活。
1.4 盐析法取生姜蛋白酶溶液A20mL，加入固体硫酸铵至40%饱和度，4℃静置30min后，冷冻离心（10000rpm，5 min），收集上清液继续加入硫酸铵至60%的饱和度，4℃静置2h后，冷冻离心（10000rpm，5 min），收集沉淀。
0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至10mL （生姜蛋白酶溶液D）。
取样按4.1方法测定蛋白质含量，按4.2方法测定酶活。
植物蛋白酶(生姜蛋白酶)的提取纯化工艺
生姜蛋白酶的提取纯化工艺一、实验目的1、掌握生姜蛋白酶提取纯化工艺的基本原理和操作步骤2、掌握生物工程下游加工技术的一些方法和技能二、实验原理生姜蛋白酶是从生姜中提取的有蛋白水解活性的酶，可用于肉类嫩化、酒类澄清等。
其提取分离技术有超滤法、盐析法、有机溶剂法、絮凝法、亲和层析法等。
然而，生姜蛋白酶属大分子物质，超滤过程中易在膜表面聚积而产生浓差极化现象，且生姜蛋白酶在有机溶剂中易变性以及存在有机溶剂残留等问题，盐析法提取的生姜蛋白酶活性较低，与应用要求相差甚远；絮凝法提取专一性不强,制得的生姜蛋白酶纯度不高；亲和层析法提取的酶纯度虽然较高，但是操作复杂，不易工业化生产。
相对来说，双水相萃取法能有效分离提取高纯度生姜蛋白酶。
原因是双水相萃取具有两相界面而张力低，有助于保持生物活性和强化相际间的质量传递，易于连续化操作，具有目标产物收率高, 不存在有机溶剂残留，分离过程经济等特点。
双水相萃取技术是利用一种高分子聚合物和无机盐的混合溶液或两种水溶性不同的聚合物，在一定浓度下将体系分成互不相溶的两相，由于表面性质、电荷间及各种作用力（如憎水键、氢键和离子键）等因素的影响，使得目标蛋白酶和其他蛋白质在两相间的分配系数不同，从而达到分离目的。
通过调整双水相系统中一系列参数就可选择性地萃取目标蛋白酶。
本实验对成相物质组成、浓度和萃取条件进行了初步探索，建立了操作条件温和、能耗低、易放大、可连续操作、无有机溶剂残留、简单可行的分离提取生姜蛋白酶的方法。
三、试剂与仪器试剂：生姜 TCA纯度99.0％，酪蛋白含氮14.5％-15.5％，考马斯亮蓝G-250，各种聚乙二醇（PEG800、PEG1000、PEG2000、PE G4000、PE G6000、PE G8000，）；磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，EDTA纯度99.5％，L-半胱氨酸含量98％～102,生姜蛋白酶, 主要仪器：紫外分光光度计，离心机，美菱榨汁·搅拌机，精密增力电动搅拌器，酸度计，四、操作步骤1、生姜蛋白酶的提取取外形完好、无机械损伤和腐烂、富含纤维的生姜，切成小块，与磷酸缓冲液（0.03mol/L，pH7.5，内含1 mmol/L EDTA和5mmol/L L-半胱氨酸）按料液比1：2打浆，所得浆液低速搅拌20m i n，搅拌过程中缓慢加入20％（m/v）固体硫酸铵，四层纱布过滤后，将姜汁4℃下静置2h，离心（4 800rpm，5min）去除沉淀，上清液用1.5倍的无水乙醇进行沉淀，再次离心去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。
SUMO蛋白酶的发酵和纯化工艺的研究_冯秀萍
SUMO蛋白酶的发酵和纯化工艺的研究_冯秀萍SUMO蛋白酶是一种重要的酶类，广泛应用于生物医学和生物工程领域。
因此，研究SUMO蛋白酶的发酵和纯化工艺对于提高SUMO蛋白酶的产量和纯度具有重要意义。
本文将结合已有的文献，对SUMO蛋白酶的生产和纯化工艺进行综述。
SUMO（Small Ubiquitin-like Modifier）蛋白酶是一类参与蛋白质修饰的酶，它通过与底物蛋白结合并结合底物蛋白，参与了调控多种细胞生物学过程，如DNA复制、DNA修复、染色质结构等。
因此，SUMO蛋白酶的产量和纯度直接关系到其功能的发挥和应用的效果。
SUMO蛋白酶的发酵工艺主要包括发酵条件的优化和基因工程菌的构建。
发酵条件的优化主要涉及培养基的优化、发酵温度和pH的调控以及酶基因表达的调控。
培养基的优化包括碳源、氮源、微量元素等营养物质的调配，以及添加适量的表达诱导剂。
发酵温度和pH的调控对于细胞的生长和酶的活性具有重要影响。
另外，酶基因的表达调控也是提高SUMO 蛋白酶产量的关键。
研究者可以通过构建高效的表达载体，包括选择适合的启动子、优化信号序列等方式来提高酶基因的表达水平。
SUMO蛋白酶的纯化工艺主要包括细胞破碎、蛋白质提取和纯化、SUMO酶的活性检测和纯化后的鉴定。
细胞破碎可以选择机械破碎、超声波破碎和动物细胞基因工程等方法。
蛋白质提取和纯化可以通过溶解、清除杂质、浓缩等步骤实现。
SUMO酶的活性检测可以采用多种色谱技术，如酶联免疫吸附测定、酶活性测定等。
纯化后的鉴定主要利用SDS-和质谱分析等方法。
研究SUMO蛋白酶的发酵和纯化工艺需要综合考虑多种因素，例如工艺参数的选择和调控，以及酶活性的检测和鉴定等。
此外，在研究过程中还要注意保护环境和提高产品质量。
因此，有关SUMO蛋白酶的发酵和纯化工艺的研究仍然具有重要意义。
菠萝蛋白酶提取
菠萝蛋白酶提取一、实验目的：1、了解菠萝蛋白酶的提取和纯化工艺2、优化和加深熟悉菠萝蛋白酶提取技术二、实验原理：菠萝蛋白酶(Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。
其外观为浅灰色粉末状，分子量为33000 ，等电点为9.55 。
品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采用超滤方法进行过滤浓缩,低温冷冻干燥而得的。
产品已被广泛应用于食品、医药等行业。
结果表明。
提取菠萝中菠萝蛋白酶最佳提取工艺条件是添加单宁溶液的浓度为0．2％，提取时最适pH值为6．5～8．5左右，而最适提取温度为60℃。
菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化，啤酒澄清，还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。
三、实验步骤操作要点：菠萝蛋白酶的提取称取1 kg制备好的鲜果皮汁，加5％苯甲酸钠溶液10 ml搅匀，以4 000 r／min离心7 min，取上清液倒人干净烧杯中。
上清液分装在6个小烧杯中，每个装100 ml菠萝汁，分别缓缓加入空白、0．1％、0．2％、0．3％、0．4％、0．6％单宁溶液10 ml，边加边拌约1 5min，沉淀物析出，静止40 min。
虹吸除去上清废液，把酶复合沉淀物倒入离心杯中，以4 000 r／min。
离心5 min，倒掉上清废液，得到酶糊复合物。
分离、洗涤和保护把提取的蛋白酶糊倒人烧杯中，加0．1％EDTA溶液100 ml搅匀，再将1．5％氯化钠溶液200 ml倒人烧杯中搅匀，以4 000 r／min离心7 min，倒掉上清废液，得到洗涤剂I酶复合沉淀物。
把洗涤剂I酶复合沉淀物倒入烧杯中，加0．5％乙酸锌溶液20 min，搅拌均匀，静止5 min，加0．06％抗坏血酸溶液30 ml，搅匀，静止5 rain，加1．5％氯化钠溶液20 ml，搅匀，静止5 min，最后再加0．5％EDTA溶液20 ml，搅匀，静止5min，以4 000 r／min离心7 min，把上清废液倒掉，得到洗涤剂Ⅱ酶复合沉淀物。
[菠萝蛋白酶提取]果菠萝蛋白酶的提取失败原因
![[菠萝蛋白酶提取]果菠萝蛋白酶的提取失败原因](https://img.taocdn.com/s3/m/8ea02ca0ed630b1c59eeb5dd.png)
[菠萝蛋白酶提取]果菠萝蛋白酶的提取失败原因菠萝蛋白酶提取一、实验目的：1、了解菠萝蛋白酶的提取和纯化工艺2、优化和加深熟悉菠萝蛋白酶提取二、实验原理：菠萝蛋白酶(Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。
其外观为浅灰色粉末状，分子量为 33000 ，等电点为 9.55 。
品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采用超滤方法进行过滤浓缩,低温冷冻干燥而得的。
产品已被广泛应用于食品、医药等行业。
结果表明。
提取菠萝中菠萝蛋白酶最佳提取工艺条件是添加单宁溶液的浓度为0．2％，提取时最适pH值为6．5～8．5左右，而最适提取温度为60℃。
菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化，啤酒澄清，还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。
三、实验步骤操作要点：菠萝蛋白酶的提取称取1 kg制备好的鲜果皮汁，加5％苯甲酸钠溶液10 ml搅匀，以4 000 r／min离心7 min，取上清液倒人干净烧杯中。
上清液分装在6个小烧杯中，每个装100 ml菠萝汁，分别缓缓加入空白、0．1％、0．2％、0．3％、0．4％、0．6％单宁溶液10 ml，边加边拌约1 5min，沉淀物析出，静止40 min。
虹吸除去上清废液，把酶复合沉淀物倒入离心杯中，以4 000 r／min。
离心5 min，倒掉上清废液，得到酶糊复合物。
分离、洗涤和保护把提取的蛋白酶糊倒人烧杯中，加0．1％EDTA溶液100 ml搅匀，再将1．5％氯化钠溶液200 ml倒人烧杯中搅匀，以4 000 r／min离心7 min，倒掉上清废液，得到洗涤剂I酶复合沉淀物。
把洗涤剂I酶复合沉淀物倒入烧杯中，加0．5％乙酸锌溶液20 min，搅拌均匀，静止5 min，加0．06％抗坏血酸溶液30 ml，搅匀，静止5 rain，加1．5％氯化钠溶液20 ml，搅匀，静止5 min，最后再加0．5％EDTA溶液20 ml，搅匀，静止5min，以4 000 r／min离心7 min，把上清废液倒掉，得到洗涤剂Ⅱ酶复合沉淀物。
木瓜蛋白酶的提取
木瓜蛋白酶的提取和纯化前言：木瓜蛋白酶(Papain) , 又称木瓜酶，广泛存在于番木瓜茎叶和果实中,以未成熟果实的乳汁中为最高。
它既有很强的蛋白水解催化活性又含凝乳和溶菌活性,还具脂解能力及蛋白合成功能, 主要是催化蛋白质水解, 也能分解小肽。
它的切割分解点很多, 大致优先分解精氨酶, 苯丙氨酸的肽键。
又因其含量高、稳定性好、能有效地分解明胶、酪蛋白、谷蛋白、弹性蛋白、球蛋白和肌纤维蛋白等常用蛋白质，被广泛应用于肉类嫩化、啤酒澄清、明胶制造、蚕茧脱胶、皮革脱毛等工业，另外还在医学方面主要用于治疗消化不良、各种炎症和水肿，防止腹膜粘连，处理血检及创伤脱痂；此外，它还可以用于研究蛋白质结构等等。
在番木瓜的茎、叶中含有木瓜蛋白酶,但在实际生产中,主要是从未成熟的生番木瓜果实中收集果皮创口流出的白色浆液,经过加工提纯后得到。
木瓜蛋白酶的生产以番木瓜未成熟果实的新鲜乳汁为原料，但因番木瓜种植区主要分布在经济不发达地区，所以蛋白酶生产工艺相对落后，很多地区仍采用太阳暴晒的方式生产木瓜蛋白酶。
另外，对于木瓜蛋白酶的商业化生产来说，不同用途的酶所要求的纯度存在相当大的差异……近年来，木瓜蛋白酶在工业上的应用日趋广泛，对其纯度要求也更高，因此，有必要对提取纯化工艺开展深入的研究。
下面主要介绍一种简单的提取纯化途径。
提取与纯化途径：1.主要流程：番木瓜 (采集浆液)→浆液(过滤)→滤液(单宁法去杂质干燥)→粗酶制品(加半胱氨酸混合研磨)→研磨混合液(调PH后过滤)→滤液(硫酸铵和氯化钠两次盐析) →盐析物(低温半胱氨酸溶液中结晶)→结晶体(重结晶) →精酶2.具体操作：（1）番木瓜浆液的采集：番木瓜果实的浆液中富含木瓜蛋白酶,但是在果实完全成熟时,白色浆液就会逐渐减少。
因此,采集浆液时应选择绿色的未成熟果。
其采浆方法是：用薄不锈钢刀片沿番木瓜果实的纵线将果皮割破,深度为2-3mm，根据果实大小，每个果实可以割5-10条刀口。
木瓜蛋白酶的生产过程
木瓜蛋白酶的生产过程1.材料准备：生产木瓜蛋白酶的关键材料是木瓜果肉。
新鲜、成熟的木瓜果肉是首选材料，因为它含有丰富的蛋白酶酶源。
其他所需材料包括维生素、糖、盐和发酵基质等。
2.果肉处理：将木瓜果肉经过清洗、去皮去籽等处理，然后剁碎成细小的颗粒状。
细碎的果肉便于酶的分离和提取。
3.酶的提取：将细碎的果肉加入适量的缓冲液中，使果肉与缓冲液的比例合适。
然后用搅拌器或搅拌棒进行搅拌，破碎细胞壁，使酶释放到溶液中。
4.澄清和过滤：将搅拌后的果肉与提取液进行分离，采用澄清法或过滤法将酶液中的果肉残渣去除。
过滤可以使用滤纸、纱布或特殊的滤网等。
5.稳定和富集：将已澄清的酶液进行稳定处理，添加适量的酶稳定剂和防腐剂，在适宜的温度下进行保藏。
同时，也可以利用浓缩和富集等工艺步骤提高酶的含量。
6.发酵过程：取适量的酶液与发酵基质进行混合，然后将混合物装入发酵罐中。
发酵过程需要控制合适的温度、湿度和通气条件等因素，使菌株能够生长繁殖，并产生丰富的酶。
7.发酵结束后，进行酶液的提取和纯化。
通常采用加热杀菌、固液分离、过滤、浓缩等步骤对发酵液进行处理，除去微生物和杂质，并得到纯净的酶液。
8.酶液的活性测定和品质检测：利用标准测定方法对木瓜蛋白酶液的酶活进行测定，以评估酶液的品质和活性水平。
常用的活性测定方法包括凝胶电泳法、酶联免疫吸附测定法等。
9.包装和贮藏：将酶液进行分装和灭菌包装，然后存放在低温下进行贮藏。
包装后的酶液需要标示清楚产品名称、规格、生产日期和有效期等信息。
总而言之，在木瓜蛋白酶的生产过程中，关键步骤包括木瓜果肉处理、酶的提取和分离、酶液的稳定和富集、发酵过程、酶液的提取和纯化、活性测定及品质检测、包装和贮藏。
这些步骤的严格控制可以保证木瓜蛋白酶的质量和活性，以满足市场需求。
植物蛋白的研究进展
植物蛋白的研究进展高蕾蕾;李迎秋【摘要】植物蛋白来源广泛,营养全面,易被人体消化吸收,具有多种生理保健功能.从植物蛋白的提取、分离纯化、功能特性及其相应水解产物的生理作用四个方面阐述植物蛋白的研究进展,以期为植物蛋白的研究开发奠定基础.【期刊名称】《江苏调味副食品》【年(卷),期】2018(000)004【总页数】6页(P6-10,16)【关键词】植物蛋白;提取分离;功能特性;水解产物;生理作用【作者】高蕾蕾;李迎秋【作者单位】齐鲁工业大学食品科学与工程学院,山东济南250353;齐鲁工业大学食品科学与工程学院,山东济南250353【正文语种】中文【中图分类】TS201.21蛋白质可被定义为由多种氨基酸通过肽键彼此连接的具有一定空间结构的生物大分子,包含C、H、O、N,通常还含有P、S等元素,是所有细胞原生质的主要组成,广泛存在于动物与植物体内,为生命所必需[1]。
蛋白质体现着机体的生命现象,深入研究蛋白质的结构和功能,将有助于阐明生命的本质。
1 植物蛋白的概况蛋白质按照食物来源，可分为动物性蛋白质和植物性蛋白质。
动物性蛋白质的来源主要是肉、蛋、奶及鱼虾等,且大多属于优质蛋白质,包含人体必需的各种氨基酸,营养价值较高。
但是,动物性食品摄取的比重过大会导致一系列健康问题,诸如高血压、心脏病、肥胖症等[2]。
另外,世界人口的增长和蛋白质资源的不足,同样也促使人们去寻求替代动物蛋白的优质蛋白质资源——植物蛋白。
植物蛋白来源广泛,营养与动物蛋白类似,但更易被人体消化吸收[3]。
此外,植物蛋白具有多种生理保健功能,如降低胆固醇、抗氧化和降血压等,因此植物蛋白的研究开发变得尤为重要[4]。
李帅斐[5]利用碱法提取和酶法改性的方法得到米糠蛋白,并对米糠蛋白的功能和抗氧化性质进行了研究，且将其应用到面包生产中。
结果表明，添加了米糠蛋白的面包不仅品质得到改善,而且营养价值提高、货架期延长。
郑亚军[6]从植物蛋白资源丰富的油棕粕中分离筛选出具有降血压作用的蛋白质,采用超高压辅助复合酶解技术制备降血压肽。
植物蛋白工艺学
植物蛋白工艺学简介植物蛋白工艺学是研究植物中蛋白质的提取、纯化和加工的学科。
随着人们对健康饮食的重视和素食主义的兴起，植物蛋白作为一种高质量、低热量的蛋白质来源，受到越来越多人的关注和青睐。
植物蛋白工艺学的研究旨在提高植物蛋白的提取效率、纯化度和功能性，以满足人们对植物蛋白的需求。
提取植物蛋白的常用方法植物蛋白的提取方法多种多样，常用的包括水提法、酸提法、碱提法和酶解法等。
其中，水提法是最常见的方法之一。
它利用水的溶解性和温度对蛋白质的影响，将植物材料浸泡在水中，通过搅拌、升温、过滤等步骤，将蛋白质从植物中提取出来。
酸提法和碱提法则是利用酸或碱的化学性质将蛋白质与植物细胞壁等非蛋白质物质分离。
酸提法通常使用盐酸、硫酸等酸性物质进行提取，而碱提法则使用氢氧化钠、氨水等碱性物质进行提取。
这两种方法对蛋白质有一定的溶解和分离效果，但也容易引起蛋白质的变性和损失。
酶解法是利用特定的酶对植物中的蛋白质进行降解和分解。
常用的酶包括蛋白酶、胰蛋白酶、木糖醇酶等。
酶解法可以选择性地将目标蛋白质从植物中提取出来，同时保持其天然的结构和功能。
植物蛋白的纯化方法植物蛋白的纯化是植物蛋白工艺学中非常重要的一步。
常用的纯化方法包括离心法、过滤法、电泳法和层析法等。
离心法是通过离心机的离心力将混合物中的植物蛋白质沉淀下来，从而实现蛋白质的分离。
过滤法则是利用孔径大小的差异将植物蛋白与其他杂质分离。
电泳法是利用电流的作用，根据蛋白质的电荷以及大小来实现蛋白质的分离。
层析法是将混合物通过一系列固定相不同的柱子，利用蛋白质在不同固定相下的亲和性差异，将目标蛋白质从混合物中分离出来。
植物蛋白的加工和应用植物蛋白的加工和应用主要包括食品工业、饲料工业和医药工业等领域。
在食品工业中，植物蛋白常被用于制作各种素食产品，如豆腐、豆浆、素肉和素奶等。
植物蛋白不仅能够提供必需的氨基酸，还能够赋予食品丰富的口感和营养特性。
在饲料工业中，植物蛋白常被用作动物饲料的主要蛋白质来源。
蛋白酶的分离提取的工艺流程
蛋白酶的分离提取的工艺流程我跟你说啊，这蛋白酶的分离提取啊，那可是个挺有意思又挺复杂的事儿。
我就瞅见过那实验室里啊，到处都是瓶瓶罐罐的，那些搞研究的人啊，一个个眼睛瞪得大大的，就跟那猫盯着老鼠洞似的。
那灯光啊，白花花的，照得那些玻璃仪器都反光。
首先呢，你得有原料啊。
这原料啊，就像是盖房子的砖头一样重要。
有的是从动植物里来的，你看那从植物里取原料的时候，那植物绿莹莹的，叶子上还带着露水呢，好像在说“我可藏着好东西呢”。
从动物里取的时候，那动物的组织啊，软乎乎的，得小心翼翼地处理。
拿到原料之后啊，就得破碎细胞了。
这就像是把一个小屋子给拆了，好把里面的东西拿出来。
那些研究员啊，操作着仪器，那表情严肃得很，手还微微有点抖呢，就怕哪一步弄错了。
这破碎细胞啊，有机械法，那仪器呼呼转，就像小旋风一样。
还有化学法和酶解法呢。
然后啊，就是离心了。
把那混合的东西往离心机里一放，这离心机一转起来啊，嗡嗡的，就像一群小蜜蜂在叫。
离心完了，就分层了，那蛋白酶啊，可能就在某一层里待着呢，就像个调皮的小孩躲在角落里。
接下来就是要把蛋白酶给粗提出来。
这就像是从沙子里淘金一样。
要用盐析啊啥的方法，看着那些研究员往里面加盐，一点一点的，眼睛都不敢眨，就盼着蛋白酶能乖乖出来。
再之后呢，就是纯化了。
这一步啊，就更精细了。
要过柱子，那些柱子就像一个个小卫兵，把杂质都给拦住，只让纯净的蛋白酶通过。
这时候的实验室啊，安静得很，只能听到液体滴答滴答流过柱子的声音，那研究员啊，大气都不敢出，死死盯着柱子，好像柱子里有啥宝贝似的。
最后啊，就是鉴定和保存了。
鉴定的时候啊，那检测仪器上的数据闪啊闪的，就像天上的星星一样。
要是鉴定合格了，就赶紧把蛋白酶保存起来，就像把宝贝小心翼翼地放进保险柜一样。
这整个过程啊，一环扣一环，哪一步都不能马虎，就像走钢丝一样，得稳稳当当的。
三种不同来源(植物、细菌和真菌)蛋白酶的纯化、性质及应用研究共3篇
三种不同来源（植物、细菌和真菌）蛋白酶的纯化、性质及应用研究共3篇三种不同来源（植物、细菌和真菌）蛋白酶的纯化、性质及应用研究1蛋白酶是一类具有水解蛋白质能力的酶，广泛存在于细胞中并参与多种生物学过程。
在生物制药等领域，蛋白酶的纯化、性质及应用研究具有重要的现实意义。
本文将重点介绍来自植物、细菌和真菌三种不同来源的蛋白酶在纯化、性质和应用方面的研究进展。
一、植物蛋白酶的纯化、性质和应用植物蛋白酶主要存在于种子、果实、根茎等植物组织中，其中的大多数是半胱氨酸蛋白酶。
植物蛋白酶的纯化主要采用柱层析法和电泳法等技术。
研究表明，植物蛋白酶的氨基酸序列存在着相似性和区别性，其中一些同源物可以分为家族或亚家族。
此外，植物蛋白酶的活性受到温度、pH值和抑制剂等因素的调节。
植物蛋白酶在食品加工和医药制品等方面可发挥重要作用。
例如，灵芝多肽可以被植物蛋白酶水解成具有生物活性的多肽物质，这对于灵芝多肽的生产具有重要意义。
另外，复合酶制剂SiOpro可以通过作用于面团中的酯酶、氧化酶和蛋白酶等多种酶的协同作用，达到改善松软度、延长保质期等目的。
二、细菌蛋白酶的纯化、性质和应用细菌蛋白酶主要可分为内质网蛋白酶和外源性蛋白酶两种。
前者在细胞内、后者在菌体周围均有分布。
细菌蛋白酶的纯化常常采用柱层析技术和亲和层析技术等，具有高效、快速、经济等优势。
细菌蛋白酶在医药、食品及皮革制品等方面应用广泛。
例如，基于外源性蛋白酶的制剂Accutase是用于脱离培养细胞的酶，具有无细胞毒性、操作简单等特点；生产蛋白药物方面，葡萄球菌的外源性蛋白酶已被用于制备重组蛋白；在食品加工过程中，外源性蛋白酶可以提高油脂的提取效率和品质。
三、真菌蛋白酶的纯化、性质和应用真菌蛋白酶可分为胶原酶和无胶原酶两大类。
前者主要用于胶原的加工，后者则广泛应用于食品加工、纸张制品、色谱等领域。
真菌蛋白酶的纯化方法有很多种，包括柱层析、电泳、反向相色谱法等。
真菌蛋白酶在pH值、温度、金属离子和阻碍剂等条件下均表现出不同的活性和特异性。
菠萝蛋白酶的提取纯化工艺研究
菠萝蛋白酶的提取纯化工艺研究梁 雪，方欢乐，刘建利（西安培华学院 医学院，陕西西安 710199）摘 要：为降低环境污染，提高菠萝蛋白酶的附加值以及延长菠萝的产业链，以菠萝废弃物为原料，采用盐析浓缩-透析提纯-乙醇有机溶剂沉淀相结合的方法提取菠萝蛋白酶。
实验考察料液比、缓冲液温度、搅拌时间、缓冲液pH值、盐析浓度以及透析时间对菠萝蛋白酶酶活性和酶活回收率的影响。
结果表明，菠萝蛋白酶的最佳工艺条件为料液比1.0∶1.5（m∶v）、缓冲液温度30 ℃、搅拌时间40 min、缓冲液pH值7、盐析浓度30%和透析时间28 h，该条件下菠萝蛋白酶酶活回收率为68.45%。
关键词：菠萝蛋白酶；盐析法；透析提纯；有机溶剂沉淀Study on Extraction and Purification of BromelainLIANG Xue, FANG Huanle, LIU Jianli(Medical College, Xi’an Peihua University, Xi’an 710199, China)Abstract: In order to reduce environmental pollution, increase the added value of bromelain, and extend the industrial chain of pineapple, a method combining salt precipitation concentration dialysis purification ethanol organic solvent precipitation was used to extract bromelain from pineapple waste as raw material. The experiment investigated the effects of material liquid ratio, buffer temperature, stirring time, buffer pH value, salting out concentration, and dialysis time on bromelain enzyme activity and enzyme recovery rate. The results showed that the optimal process conditions for bromelain were material to liquid ratio of 1.0∶1.5（m∶v）, buffer temperature of 30 ℃, stirring time of 40 minutes, buffer pH of 7.0, salt out concentration of 30%, and dialysis time of 28 hours. Under these conditions, the recovery rate of bromelain enzyme activity was 68.45%.Keywords: bromelain; salting out; dialysis purification; organic solvent precipitation菠萝蛋白酶为白色至淡棕黄色无定形粉末，是我国目前大规模生产的植物蛋白酶之一[1]。
木瓜蛋白酶生产工艺流程
木瓜蛋白酶生产工艺流程英文回答：Papain, the protease enzyme derived from papaya, is widely used in various industries such as food, pharmaceutical, and cosmetic. The production process of papain involves several steps, including extraction, purification, and drying.Firstly, the papain enzyme is extracted from the papaya fruit. The ripe papaya fruit is harvested and the latex containing the enzyme is collected. The latex is obtained by making incisions on the fruit's skin and allowing the milky sap to flow out. This latex is then collected and stored for further processing.Next, the collected latex is subjected to purification to remove impurities and unwanted substances. This is typically done through centrifugation or filtration processes. The aim is to obtain a clear and pure enzymesolution.After purification, the papain enzyme solution is concentrated to increase its potency. This can be achieved through various methods such as evaporation or membrane filtration. The concentrated solution is then further processed to remove any remaining impurities.Once the enzyme solution is purified and concentrated, it is dried to obtain the final papain product. There are different drying techniques that can be used, including spray drying, freeze drying, or vacuum drying. These methods remove the water content from the enzyme solution, resulting in a dry and stable papain powder.In addition to the production process, the fermentation of papaya fruit can also be utilized to produce papain. This involves the use of microorganisms such as bacteria or fungi to produce the enzyme. The fermentation process allows for a controlled and efficient production of papain.中文回答：木瓜蛋白酶是从木瓜中提取的一种蛋白酶酶，广泛应用于食品、制药和化妆品等多个行业。
木瓜蛋白酶的提取
木瓜蛋白酶的提取、分离纯化及其生物学研究综述及实验方法13生物技术第二大组第二小组组员：王玓玥（组长）、王子贺、王思瑶、王宇涛、王守鑫、谭国栋一、研究背景：在经济飞速发展的今天，人们的生活水平已远远不只在于吃饱穿暖，食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注，绿色健康的生活也成为大家共同的追求，木瓜蛋白酶以它自身耐热及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业，如何分离纯化得到高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点，本小组便也以此为研究主题展开实验。
二、木瓜蛋白酶基本介绍：木瓜蛋白酶，又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。
木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。
木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，这种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。
至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。
它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。
木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。
木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI）为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。
另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。
酶的提取和分离纯化.pptx
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11.2.1 机械破碎法 • 指通过机械运动所产生的剪切力使细胞破碎的方法，常用的有如下几种：
• 1.机械捣碎法
• 利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。 10000r/min
• 此法在实验室和生产规模均可采用。
• 2.研磨法
• 突然降压法的另一种形式为爆破性减压法是将菌体悬浮在高压 容器中，用氮气或二氧化碳加压到几十至几百大气压，振荡几 分钟，使气体扩散到细胞内，然后突然排出气体，压力骤降， 使细胞破碎。
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压力差破碎法
• （3）渗透压差法是利用渗透压的变化而使细胞破碎。 • 应用时先将对数生长期的细胞从培养液中分离出来，再悬浮在20%左右的蔗糖
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球蛋白溶解度-溶液离子强度关系
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盐析
• 中性盐类使蛋白质发生沉淀的原因： • 1).中和蛋白质分子表面电荷 • 2).与蛋白质颗粒竞争水分子 • 不同蛋白质表面极性基团、带电数目及分布等不
同，因而可以分级沉淀。 • 盐析法应控制pH使接近等纯化酶的等电点。蛋
• 性质
方法
• 分子大小
离心，超离心法、凝胶过滤，
膜分离技术（超滤，反渗透，
微孔过滤，透析，电渗析等）
• 溶解度
法，
盐析法，有机溶剂沉淀法，共沉淀
选择性沉淀法，结晶
• 电荷或基团
离子交换色谱，电泳，等电聚焦，
吸附 色谱，疏水色谱，聚焦色 谱
• 稳定性
选择性变性法（热，酸碱，
表面活性剂）
• 特殊（专一性结合）第30亲页/共和13色9页谱，亲和洗脱，亲和电
蛋白酶的提取工艺
蛋白酶的提取工艺
蛋白酶是一种重要的酶类，在许多工业领域都有广泛的应用。
蛋白酶的提取工艺是关键环节，直接影响到蛋白酶的纯度和产量。
蛋白酶的提取工艺包括以下步骤：
## 1. 破碎细胞
蛋白酶大多存在于微生物的细胞内，因此需要先将微生物细胞破碎，释放蛋白酶。
常用的破碎方法包括高压均质和超声波破碎。
## 2. 去除杂质
破碎后的细胞中还有很多杂质，如细胞壁、脂质等，需要通过离心、过滤等方法去除。
## 3. 分离蛋白酶
经过前两步处理后，蛋白酶已经被释放并且杂质已经去除，但是还需要将蛋白酶与其他蛋白质分离。
这可以通过离子交换、凝胶过滤、亲和层析等方法实现。
## 4. 纯化蛋白酶
分离后的蛋白酶仍然可能存在杂质，需要进行进一步的纯化。
这可以通过逆流层析、高效液相色谱等方法实现。
最终得到的蛋白酶可以用于工业生产。
以上是常见的蛋白酶提取工艺步骤，不同的蛋白酶可能需要针对性的调整工艺流程才能达到理想的纯度和产量。
木瓜蛋白酶生产工艺流程
木瓜蛋白酶生产工艺流程英文回答：Papain, a protease enzyme derived from papaya, is widely used in various industries such as food, pharmaceutical, and cosmetic. The production process of papain involves several steps, including raw material preparation, enzyme extraction, purification, and drying.The first step in the production process is the preparation of raw materials. Ripe papaya fruits are selected and washed thoroughly to remove any dirt or impurities. The fruits are then peeled and the seeds and skin are discarded. The remaining flesh is cut into small pieces and mashed to form a pulp.Next, the enzyme extraction step takes place. The papaya pulp is mixed with a suitable extraction buffer, such as phosphate buffer, and the mixture is stirred gently for a specific period of time. This allows the enzyme to bereleased from the pulp into the extraction buffer. The mixture is then centrifuged to separate the solid pulp from the liquid enzyme extract.After extraction, the crude enzyme extract undergoes a purification process. This is done to remove impurities and other unwanted substances. Various methods can be used for purification, such as precipitation, filtration, and chromatography. For example, the extract can be treatedwith ammonium sulfate to precipitate the enzyme, which can then be collected by centrifugation. Filtration can also be used to remove larger particles and debris. Finally, chromatography techniques, such as ion exchange or affinity chromatography, can be employed to further purify the enzyme.Once the enzyme is purified, it is dried to obtain the final product. This can be done through various drying methods, such as spray drying or freeze drying. For example, in spray drying, the enzyme solution is sprayed into a hot chamber, where the water evaporates, leaving behind dried enzyme particles. Freeze drying involves freezing theenzyme solution and then subjecting it to a vacuum, which causes the frozen water to sublimate, leaving behind freeze-dried enzyme powder.中文回答：木瓜蛋白酶是从木瓜中提取的一种蛋白酶酶制剂，广泛应用于食品、医药和化妆品等各个行业。
蛋白酶生产工艺流程
蛋白酶生产工艺流程English Answer:Proteinase production process flow:1. Raw material selection and preparation: The first step in the proteinase production process is to select and prepare the raw materials. The most common raw materials used for proteinase production are animal and plant tissues, such as pancreas, stomach, and soybeans. These rawmaterials are typically ground into a fine powder and then mixed with a buffer solution to create a slurry.2. Fermentation: The slurry is then fermented with a strain of bacteria or yeast that produces proteinase. The fermentation process typically takes place in a bioreactor, which is a controlled environment that provides the optimal conditions for the growth of the microorganisms.3. Extraction: After fermentation, the proteinase isextracted from the fermentation broth. This is typically done using a combination of methods, such as centrifugation, filtration, and precipitation.4. Purification: The extracted proteinase is then purified to remove any impurities, such as other proteins, enzymes, and nucleic acids. This is typically done using a series of chromatography steps.5. Formulation: The purified proteinase is then formulated into a final product. This typically involves adding stabilizers, preservatives, and other ingredients to improve the stability and performance of the proteinase.6. Packaging and storage: The final proteinase productis then packaged and stored in a controlled environment to maintain its stability and activity.Chinese Answer:蛋白酶生产工艺流程：1. 原料选择和准备，蛋白酶生产工艺的第一步是选择和准备原料。
庞博生物 木瓜蛋白酶 工艺流程
庞博生物木瓜蛋白酶工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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植物蛋白酶提取纯化工艺
生物工程09-2班陈福泉学号：3090343214
一、实验目的
1、了解植物蛋白酶常用的提取纯化方法的基本原理和基本操作；
2、掌握双水相和反胶束萃取的原理和操作步骤；
3、掌握蛋白质含量和蛋白酶酶活的检测方法
二、实验原理
植物蛋白酶常用的提取纯化方法有缓冲盐溶液提取、初步纯化的方法有有机溶剂法、乙醇粉法、丙酮粉法、盐析法、双水相法、反胶束萃取法等
以pH6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为提取溶剂所得酶活力较高，最佳工艺为：以pH6.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液25℃提取2次，料液比1∶1；应用硫酸铵盐析及透析袋透析对粗酶液进行纯化，粗酶液再以60%硫酸铵盐析24h，透析袋（14000）低温透析12h，冻干；酶学性质研究表明：生姜蛋白酶以酪蛋白为底物其最适pH值为
6.0，30℃保温30min，酶活稳定。
三、实验材料
材料与试剂
新鲜生姜、酪蛋白（化学纯）、考马斯亮蓝G-250、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸、硫酸铵、丙酮等试剂均为分析纯。
0.01%（w/v）考马斯亮蓝G-250溶液：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 90%vol乙醇中，加入85%正磷酸100mL，蒸馏水定容至1000mL。
0.5%酪蛋白溶液：称取0.5g酪蛋白，先用少量0.55mol/L碳酸钠溶液润湿，再加少量
0.02 mol/L pH7.5的磷酸缓冲液稀释，水浴中煮沸溶解，定容至100mL。
四、实验步骤
方法一：生姜蛋白酶提取液制备: 取定量新鲜生姜,切成小块后加入10 倍体积的pH 6. 0, 0. 2 mol/ L 磷酸缓冲液( 4 e ) , 于粉碎机中匀桨, 8 层纱布过滤后于4000 rpm 离心10 min, 吸取上清液, 加入高饱和度的( NH4) 2SO4 液使盐析体系中( NH4) 2SO4 终饱和度为60% , 4000 rpm 离心15 min。
收集上层不溶物, 用少量pH 7. 50 的柠檬酸缓冲液溶解, 在4 e 下对同种缓冲液透析8 h。
透析液定容, 即为生姜蛋白酶提取液。
方法二：生姜蛋白酶的提取取外形完好、无机械损伤和腐烂、富含纤维的生姜，切成小块，与磷酸缓冲液（0.03mol/L，pH7.5，内含1 mmol/L EDTA和5mmol/L L-半胱氨酸）按料液比1：2打浆，所得浆液低速搅拌20m i n，搅拌过程中缓慢加入20％（m/v）固体硫酸铵，四层纱布过滤后，将姜汁4℃下静置2h，离心（4 800rpm，5min）去除沉
淀，上清液用1.5倍的无水乙醇进行沉淀，再次离心去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。
生姜蛋白酶的反胶束萃取：在生姜蛋白酶提取液加入等体积的AOT-异辛烷阴离子反胶束或CTAB-庚烷/ 辛醇阳离子反胶束, 用磁力搅拌器以200 rpm 的速度进行搅拌5~10 min, 8000 rpm 离心10 min, 萃余液( 下层) 用考马斯亮兰法测定残留生姜蛋白酶酶活力和蛋白质量。
生姜蛋白酶的pI= 5. 4~ 5. 5, 在pH 5. 4 以上, 用AOT-异辛烷反胶束不能萃取出生姜蛋白酶, 但是却可以萃取出71. 86% 的杂蛋白。
用CTAB 庚烷/ 辛醇反胶束二次萃取AOT-异辛烷萃余液, 其蛋白质萃取率为60125%。
双水相萃取将不同分子量的聚乙二醇和成相盐按质量比配制一系列不同浓度及p H的双水相体系，每个双水相体系改变一个参数。
由于备用溶液黏度很高，为减少误差，各组分含量均以质量分数（w）表示。
加入一定量的聚乙二醇和下相盐后用去离子水调系统总质量至20g。
充分溶解后倒入60m l的分液漏斗中进行分相，待分相完成后加入3m l的生姜蛋白酶粗酶液。
将分液漏斗封口，反复倒置2～3m i n，每分钟10～15次，将体系各组分充分混合均匀后，室温下静置分相2h，使体系上下相分离完全。
资料表明，P E G-缓冲盐双水相萃取生姜蛋白酶的最佳萃取条件为：P E G分子量为4000，P E G浓度为20％，磷酸缓冲液的p H值为6.5，浓度为10％，生姜蛋白酶上相酶活力回收R和纯化倍数P F可达279.05％和1.86
生姜蛋白酶活力测定
绘制标准曲线
配制各取6 支刻度试管, 分别加入0. 4、0. 8、1.2、1. 6、2. 0、2. 4μg 牛血清白蛋白2 滴1:1 HCl,及3 mL 考马斯亮兰G-250 液, 室温下显色30 min后用蒸馏水
定容至10 mL, 于595 nm 下测定OD
595。
以蛋白质质量为横坐标, OD
595
为纵坐标绘制标
准曲线。
其线性回归方程为:
Y= 01019X- 0. 001。
蛋白质浓度测定
取定量蛋白溶液, 加入pH= 6. 0 的磷酸缓冲液3 mL, 3 mL 考马斯亮兰G-250 液及2 滴1:1 HCl,室温下显色30 min 后用蒸馏水定容至10 mL, 于595 nm 下测定OD
595
, 根据标准曲线或线性回归方程计算蛋白质含量。
生姜蛋白酶活力
各取0. 2 mol/ L、pH= 6. 0 的磷酸缓冲液3 mL,分别加入0. 2%牛血清白蛋白溶液2 mL 及1 mL 生姜蛋白酶溶液, 于60 e 下反应15 min, 反应完成后
加入2 滴1B1 HCl 以终止反应, 对照则在加入生姜蛋白酶溶液之前加入同量1B1 HCl 以阻止反应发生。
加入3 mL 考马斯亮兰G- 250 液显色30 分钟后定容至10 mL。
分别于分光光度计上测定OD595,以反应前后OD595 差表示生姜蛋白酶活力。
以每分钟内每mL 蛋白酶提取液水解1 μg 牛血清白蛋白为生姜蛋白酶的活力单位。
生姜蛋白酶活力=
( 酶反应液OD
595-空白OD
595
) / mL 酶液·min- 1, 即μg牛血清白蛋白/ mL·min- 1。
1．安装夹心式垂直板电泳槽：目前，夹心式垂直板电泳槽有很多型号，虽然设置略有不同，但主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。
同学们可根据具体不同型号要求进行操作。
主要注意：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。
2．配胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度
3．制备凝胶板：
（1）分离胶制备：按表配制20ml 10%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm 高，用1ml 注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约3—4mm 高，以进行水封。
约30min 后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。
倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。
（2）浓缩胶的制备：按表配制10ml 3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm 处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。
约30min后凝胶聚合，再放置20—30min。
待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm 以上，即可准备加样。
4．样品处理及加样
各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.5~1mg/mL，沸水浴加热3 分钟，冷却至室温备用。
处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1 分钟，以消除亚稳态聚合。
一般加样体积为10－15μL（即2－10μg 蛋白质）。
如样品较稀，可增加加样体积。
用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。
5．电泳
将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10mA。
待样品进入分离较时，将电流调至20－30 mA。
当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。
拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。
6．染色及脱色
将染色液倒入培养皿中，染色1h 左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰，即用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离。
计算
1.相对迁移率mR =样品迁移距离（cm）/染料迁移距离（cm）
2.以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。
五、注意事项
1. 不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种
方法测出的分子量是不可靠的。
包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。
例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35,000。
因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。
2．有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS 和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。
因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。
为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。