植物蛋白酶提取纯化工艺

植物蛋白酶提取纯化工艺

生物工程09-2班陈福泉学号：3090343214

一、实验目的

1、了解植物蛋白酶常用的提取纯化方法的基本原理和基本操作；

2、掌握双水相和反胶束萃取的原理和操作步骤；

3、掌握蛋白质含量和蛋白酶酶活的检测方法

二、实验原理

植物蛋白酶常用的提取纯化方法有缓冲盐溶液提取、初步纯化的方法有有机溶剂法、乙醇粉法、丙酮粉法、盐析法、双水相法、反胶束萃取法等

以pH6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为提取溶剂所得酶活力较高，最佳工艺为：以pH6.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液25℃提取2次，料液比1∶1；应用硫酸铵盐析及透析袋透析对粗酶液进行纯化，粗酶液再以60%硫酸铵盐析24h，透析袋（14000）低温透析12h，冻干；酶学性质研究表明：生姜蛋白酶以酪蛋白为底物其最适pH值为

6.0，30℃保温30min，酶活稳定。

三、实验材料

材料与试剂

新鲜生姜、酪蛋白（化学纯）、考马斯亮蓝G-250、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸、硫酸铵、丙酮等试剂均为分析纯。

0.01%（w/v）考马斯亮蓝G-250溶液：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 90%vol乙醇中，加入85%正磷酸100mL，蒸馏水定容至1000mL。

0.5%酪蛋白溶液：称取0.5g酪蛋白，先用少量0.55mol/L碳酸钠溶液润湿，再加少量

0.02 mol/L pH7.5的磷酸缓冲液稀释，水浴中煮沸溶解，定容至100mL。

四、实验步骤

方法一：生姜蛋白酶提取液制备: 取定量新鲜生姜,切成小块后加入10 倍体积的pH 6. 0, 0. 2 mol/ L 磷酸缓冲液( 4 e ) , 于粉碎机中匀桨, 8 层纱布过滤后于4000 rpm 离心10 min, 吸取上清液, 加入高饱和度的( NH4) 2SO4 液使盐析体系中( NH4) 2SO4 终饱和度为60% , 4000 rpm 离心15 min。收集上层不溶物, 用少量pH 7. 50 的柠檬酸缓冲液溶解, 在4 e 下对同种缓冲液透析8 h。透析液定容, 即为生姜蛋白酶提取液。

方法二：生姜蛋白酶的提取取外形完好、无机械损伤和腐烂、富含纤维的生姜，切成小块，与磷酸缓冲液（0.03mol/L，pH7.5，内含1 mmol/L EDTA和5mmol/L L-半胱氨酸）按料液比1：2打浆，所得浆液低速搅拌20m i n，搅拌过程中缓慢加入20％（m/v）固体硫酸铵，四层纱布过滤后，将姜汁4℃下静置2h，离心（4 800rpm，5min）去除沉

淀，上清液用1.5倍的无水乙醇进行沉淀，再次离心去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。

生姜蛋白酶的反胶束萃取：在生姜蛋白酶提取液加入等体积的AOT-异辛烷阴离子反胶束或CTAB-庚烷/ 辛醇阳离子反胶束, 用磁力搅拌器以200 rpm 的速度进行搅拌5~10 min, 8000 rpm 离心10 min, 萃余液( 下层) 用考马斯亮兰法测定残留生姜蛋白酶酶活力和蛋白质量。

生姜蛋白酶的pI= 5. 4~ 5. 5, 在pH 5. 4 以上, 用AOT-异辛烷反胶束不能萃取出生姜蛋白酶, 但是却可以萃取出71. 86% 的杂蛋白。用CTAB 庚烷/ 辛醇反胶束二次萃取AOT-异辛烷萃余液, 其蛋白质萃取率为60125%。

双水相萃取将不同分子量的聚乙二醇和成相盐按质量比配制一系列不同浓度及p H的双水相体系，每个双水相体系改变一个参数。由于备用溶液黏度很高，为减少误差，各组分含量均以质量分数（w）表示。加入一定量的聚乙二醇和下相盐后用去离子水调系统总质量至20g。充分溶解后倒入60m l的分液漏斗中进行分相，待分相完成后加入3m l的生姜蛋白酶粗酶液。将分液漏斗封口，反复倒置2～3m i n，每分钟10～15次，将体系各组分充分混合均匀后，室温下静置分相2h，使体系上下相分离完全。

资料表明，P E G-缓冲盐双水相萃取生姜蛋白酶的最佳萃取条件为：P E G分子量为4000，P E G浓度为20％，磷酸缓冲液的p H值为6.5，浓度为10％，生姜蛋白酶上相酶活力回收R和纯化倍数P F可达279.05％和1.86

生姜蛋白酶活力测定

绘制标准曲线

配制各取6 支刻度试管, 分别加入0. 4、0. 8、1.2、1. 6、2. 0、2. 4μg 牛血清白蛋白2 滴1:1 HCl,及3 mL 考马斯亮兰G-250 液, 室温下显色30 min后用蒸馏水

定容至10 mL, 于595 nm 下测定OD

595。以蛋白质质量为横坐标, OD

595

为纵坐标绘制标

准曲线。其线性回归方程为:

Y= 01019X- 0. 001。

蛋白质浓度测定

取定量蛋白溶液, 加入pH= 6. 0 的磷酸缓冲液3 mL, 3 mL 考马斯亮兰G-250 液及2 滴1:1 HCl,室温下显色30 min 后用蒸馏水定容至10 mL, 于595 nm 下测定OD

595

, 根据标准曲线或线性回归方程计算蛋白质含量。

生姜蛋白酶活力

各取0. 2 mol/ L、pH= 6. 0 的磷酸缓冲液3 mL,分别加入0. 2%牛血清白蛋白溶液2 mL 及1 mL 生姜蛋白酶溶液, 于60 e 下反应15 min, 反应完成后

加入2 滴1B1 HCl 以终止反应, 对照则在加入生姜蛋白酶溶液之前加入同量1B1 HCl 以阻止反应发生。加入3 mL 考马斯亮兰G- 250 液显色30 分钟后定容至10 mL。分别于分光光度计上测定OD595,以反应前后OD595 差表示生姜蛋白酶活力。以每分钟内每mL 蛋白酶提取液水解1 μg 牛血清白蛋白为生姜蛋白酶的活力单位。生姜蛋白酶活力=