胰蛋白酶的提取

胰蛋白酶的提取原理和方法步骤
2010-03-29 14:21:31 来源：易生物实验浏览次数：404 网友评论0 条
在动物胰脏中除了存在胰蛋白酶外，还有另外两种与胰蛋白酶性质相似的蛋白水解酶：胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。

在胰蛋白酶提取过程中，三者彼此很难分开。

需采用合适的方法进一步分离纯化。

关键词：胰蛋白酶trypsin
［原理］
在动物胰脏中除了存在胰蛋白酶外，还有另外两种与胰蛋白酶性质相似的蛋白水解酶：胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。

在胰蛋白酶提取过程中，三者彼此很难分开。

需采用合适的方法进一步分离纯化。

从动物胰脏中提取胰蛋白酶，一般是用稀酸将胰腺细胞中含有的胰蛋白酶原提取出来，然后根据等电点沉淀的原理将提取液的pH值调至酸性（pH3.0左右），使大量的酸性蛋白沉淀出来。

经硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原沉淀。

沉淀物经水溶解并调至pH8.0，用极少量的胰蛋白酶将胰蛋白酶原激活，同时溶液中的胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原也被激活，三种酶原相互作用过程如下：
也可采用从胰脏中提取出胰蛋白酶原，利用合适的提取溶液的pH值促使胰蛋白酶原部分自溶，并通过溶液中Ca2+的环境，使胰蛋白酶原被开始自溶的少量具有活性的胰蛋白酶所激活，转变为具有活性的胰蛋白酶（胰凝乳蛋白酶原及弹性蛋白酶原亦同时被胰蛋白酶激活成
有活性的酶）。

激活后的酶溶液再进一步分离纯化。

［试剂和器材］
1、试剂
（1）pH2.5～3.0乙酸化的水溶液
（2）10%（体积分数）乙酸
（3）2mol/L硫酸
（4）固体硫酸铵
（5）无水CaCl2
（6）结晶胰蛋白酶
（7）25%乙醇溶液(含0.015mol/ＬHCl 、0.05mol/ＬCaCl2)
（8）95%（体积分数）乙醇
（9）5mol/ＬNaOH
（10）丙酮
2、器材
（1）胰脏
（2）组织捣碎机
（3）离心机
（4）磁力搅拌器
（5）透析袋、20目筛网、纱布、水浴锅
（6）烧杯、量筒、刻度吸管、试管、玻璃漏斗
（7）布氏漏斗、抽滤瓶、温度计、滴管、玻璃搅棒、纱布、pH试纸等
［方法和步骤］
方法一
1、胰蛋白酶原的提取
取新鲜胰脏约150g，剥去结缔组织和脂肪，取净重100g，切成碎块，在组织捣碎机中捣碎，并加入2倍体积预冷的pH2.5～3.0 乙酸化水溶液，制成匀浆。

浆液倒入500mL烧杯中，用10%（体积分数）乙酸调节pH在2.5～3.0之间，在5～10℃下提取6h以上，并间隙轻轻搅拌。

用4层纱布过滤，尽量挤出滤液。

组织残渣中再加入0.5倍体积（约50mL左右）预冷的pH2.5～3.0乙酸化水溶液再提取一次（放置1～2h），再用4层纱布过滤。

合并两次滤液，用2.5mol/L硫酸调节滤液pH在2.5～3.0之间，4℃放置4h（pH始终保持在2.5～3.0），使提取液中酸性蛋白沉淀析出。

提取液用折叠滤纸于玻璃漏斗中自然过滤，收集滤液，量取体积（约200mL左右）。

滤液中加入粉末状固体硫酸铵，使溶液达0.75饱和度（每升滤液加492g，5℃）。

放置过夜，使胰蛋白酶原完全析出。

次日抽滤，弃滤液，压紧并收集滤饼，即胰蛋白酶原粗品。

2、胰蛋白酶原的激活
将胰蛋白酶原粗品称重（湿重），分次加入10倍体积预冷的蒸馏水（按滤饼重量计算），使滤饼完全溶解（一般情况滤饼中硫酸铵含量约占饼重1/4）。

用5mol/L NaOH将溶液调至p H8.0，慢慢地搅拌下加入固体无水CaCl2使溶液的Ca2+终浓度达到0.1mol/L（要减去一部分氯化钙与硫酸铵结合生成硫酸钙的钙离子）。

取出2mL溶液用于测定激活前的蛋白含量及酶活性。

原溶液中加入5mg结晶胰蛋白酶，轻轻搅拌均匀，25℃放置2～4h，或4℃放置12～16h，使胰蛋白酶原活化。

每隔1h取样测定胰蛋白酶活性增长情况，直至酶激活速度变慢或停止增长。

一般比活可达到3 500～4 000 BAEE单位/mg。

留取2mL溶液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性。

激活酶溶液用2mol/L硫酸调pH至2.5～3.0，滤纸过滤，滤去硫酸钙沉淀，收集滤液，4℃保存备用。

方法二
称取冷冻猪胰脏100g，在2～5℃下解冻，切成小块，用组织捣碎机中绞碎成胰浆，在5～10℃
存放24h以上，使胰酶自身活化。

胰浆中加入25%（质量分数）乙醇溶液250mL（25%乙醇溶液中加0.015mol/L HCl 、0.05mol/L CaCl2），捣碎机中捣碎1min。

胰浆倒入500mL烧杯中，间隙搅拌，温度20℃左右，活化5～6h。

每隔1.5h，吸取2mL活化液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性。

活化反应结束后，胰浆3 500 r/min离心20min，将离心后上清液用二层纱布过滤。

滤液置250mL烧杯中，以过滤清液的体积为准，加入粉末状硫酸铵，搅拌溶解，使溶液硫酸铵饱和度为20%。

放置6h后，3 500 r/min离心20min，保存上清液待用，取沉淀。

沉淀分别用适量95%乙醇洗涤过滤，再用丙酮洗涤，过滤。

最后将沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶粗品Ⅰ。

在上述离心上清液中，加入粉末状硫酸铵，搅拌溶解，使上清液溶液达到55% 硫酸铵饱和度，放置6h后，3 500 r/min离心30min，取离心沉淀，分别用适量95%乙醇、丙酮洗涤，过滤后将沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶粗品Ⅱ。

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