胃蛋白酶提取的分离纯化
胃蛋白酶提取的分离纯化
胃蛋白酶提取的分离纯化Last revised by LE LE in 2021胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。
其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。
纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。
综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。
关键词：胃蛋白酶分离纯化应用．生物提取法生产胃蛋白酶1．1 工艺路线（自溶、过滤）（脱脂、去杂质）猪胃黏膜→自溶液→上清液（浓缩、干燥）→胃蛋白酶成品工艺过程（1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。
一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。
（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。
用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。
（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。
（4）浓缩、干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。
球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。
2胃蛋白酶的分离技术有机溶剂法可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。
通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。
当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。
丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。
2．2盐析法盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。
酶学第五章 酶的分离纯化与制剂
主讲教师：赵丹丹
第五章 酶的分离纯化与制剂
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一、预处理和破细胞
4. 细胞破碎（cell disruption）
(2) ‘‘丙酮干粉’’（acetone powder）处理法 适用于微生物材料 一般程序是先将材料粉碎、分散，然后在0℃以下的低温条件下、加 入5～10倍预先冷至约-20℃的丙酮，迅速搅拌均匀，随即过滤，最后 低温干燥，研磨过筛 丙酮处理优点： ① 能有效地破坏细胞壁（膜）；② 有利于除去大量脂类物质，以免 它在以后的步骤产生干扰；③ 能使某些膜结合酶易于溶解；④ 丙酮 干粉含水量低，便于保存。 缺点：丙酮可能引起某些酶变性失效。
主讲教师：赵丹丹
第五章 酶的分离纯化与制剂
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第二节 酶的抽提
抽提的要求是要将尽可能多的酶、 尽量少的杂质从原料引入溶液。
主要内容：预处理和破细胞
抽提
浓缩
一、预处理和破细胞
着手酶的提取前，通常应先对酶的原料进行适当的预处理 (Pretreatmention)。例如： (1) 动物材料要先剔除结缔组织、脂肪组织和血污等 ； (2) 油质种子最好先用乙醚等脱脂； (3) 种子研磨前应去壳，以免丹宁等物质着色污染； (4) 对于微生物材料则应将菌体和发酵介质加以分离。 2. 在这些预处理后，尽可能以非常新鲜的状态直接应用; 否则，应将 完整材料立即冰冻保存。
最终目的（ 获得高度纯净的酶制剂 ）
整个工作包括三个基本环节： (1) 抽提（extraction）：是要将酶从原料中抽提出来作成酶溶液；
(2) 纯化（purification）：是将酶和杂质分离开来，或者选择地将酶从 包含杂质的溶液中分离出来，或者选择地将杂质从酶溶液中移除出去；
(3) 制剂（preparation）：是要将纯化的酶作成一定形式的制剂。
胃蛋白酶分离纯化技术研究进展
胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法 , 其主要目的是将酶液进行浓缩 、除盐及小分子物 质 。此法常配合盐析使用 , 以缩短提取时间 [ 5 ] 。 113 底物亲和法
底物亲合法是利用酶 (胃蛋白酶 ) 与其底物 (酪蛋白 ) 的亲和性 , 从胃黏膜中提取得到胃蛋 白酶 。使底物和酶在 pH215的乳酸缓冲液中充分 结合 , 然后调 pH 至 410 (底物的等电点 ) 沉淀 底物和酶的结合物 , 随后让沉淀物再溶解于乳酸 缓冲液中 , 添加低浓度的 SDS将底物和酶分离 , 得到酶 - SDS复合物 , 再进一步分离纯化 。陈躬 端 (2001) 成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了 实验室分离 , 得率大约为 30%。与传统的分离方 法比较 , 此法具有简单高效的优点 , 为后续的纯 化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用 , 同 时具有较高的特异性 [ 9 ] 。
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1955年美国专利 ( 2, 701, 228 ) 记载了有 机溶剂法提取胃酶和胃酶素的联产工艺方法 。其 方法的核心主要是将胃黏膜用酸性溶液浸提后加 入乙醇或丙酮 , 使其比重达 0194 0196 先沉淀 胃膜素 , 继续加入乙醇或丙酮 , 使其比重达 0189
有机溶剂法可用于胃蛋白酶的初步提 取浓 缩 , 通常使用的有机溶剂有乙醇和丙酮 。此种方 法是利用生化物质在不同浓度的有机溶剂中溶解 度的差异而实现分离的 [ 3 ] 。
收稿日期 : 2007 - 10 - 10 作者简介 : 王莹 (1981 - ) , 女 , 在读硕士 , 研究方向 : 畜产品加工 。
胃蛋白酶原料
胃蛋白酶原料全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：胃蛋白酶是一种重要的酶类，在人体消化过程中发挥着重要作用。
它主要由胃腺细胞分泌，可促进蛋白质的分解和消化吸收。
而胃蛋白酶原料则是用于制备胃蛋白酶的原始材料，其质量和来源对最终产品的质量起着至关重要的作用。
胃蛋白酶原料通常来自于动物源和植物源，动物源主要包括猪胃、牛胃等；植物源主要包括木瓜、菠萝等。
这些原料中含有丰富的胃蛋白酶活性成分，经过提取和加工处理，可以得到高纯度的胃蛋白酶。
在制备胃蛋白酶的过程中，选择合适的胃蛋白酶原料至关重要。
首先要保证原料的新鲜度和质量，只有优质的原料才能得到优质的胃蛋白酶产品。
原料的处理和加工技术也是影响胃蛋白酶质量的关键因素，要采用科学合理的方法提取和纯化目标产物，避免杂质的干扰。
胃蛋白酶原料的选择还要考虑其安全性和可持续性。
在现代生产过程中，越来越重视环保和可持续发展，因此应选择符合相关标准和法规的原料，尽量减少对环境的影响。
胃蛋白酶原料的研究和开发也是一个不断深入的领域。
通过对原料的性质和作用机制进行深入研究，可以优化生产工艺，提高产品的品质和效果，满足不同需求和应用场合的要求。
胃蛋白酶原料在制备胃蛋白酶过程中具有重要意义，其选择和处理直接影响最终产品的质量和效果。
未来随着科学技术的不断进步，相信胃蛋白酶原料的研究和开发会有更大的突破，为人类健康和生活质量带来更多的益处。
【字数：404】第二篇示例：胃蛋白酶是一种消化酶，主要由胃部分泌，可以帮助人体消化蛋白质，促进食物消化和吸收。
胃蛋白酶的原料是许多植物和动物源的食物，如肉类、鱼类、奶制品、豆类等。
在人体内，胃蛋白酶是一个重要的消化酶，能够帮助人体分解蛋白质成为氨基酸，提供人体所需的营养物质。
胃蛋白酶原料的来源多种多样，动物源的食物是最主要的原料之一。
动物源的食物中含有丰富的蛋白质，如肉类和鱼类，其中含有大量的肌肉蛋白和肌肉组织，是制备胃蛋白酶的理想原料。
奶制品也是胃蛋白酶的重要原料来源，乳制品中含有丰富的乳清蛋白和酪蛋白，可以为胃蛋白酶提供充足的蛋白质原料。
酶的分离与纯化注意事项
在酶的分离纯化过程中为什么进行酶活力及酶比活力测定
1、防止酶变性失活。一旦活力明显下降，就要考虑换一种纯 化方法；
2、计算纯化效率。通过总活力和比活，评估纯化效率，寻找 最佳方法。
酶都能溶解于水通常可用酶都能溶解于水通常可用水或稀酸水或稀酸??酶都能溶解于水通常可用酶都能溶解于水通常可用水或稀酸稀碱稀盐溶液等进行水或稀酸稀碱稀盐溶液等进行提取提取有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团则可用有有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团则可用有机溶剂提取
酶的分离与纯化注意事项及酶分离纯化 为什么进行酶活力和酶比活力测定
(2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用各钟 柱 层析法。 (3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶 的进一步精制纯化，可用 制备式电泳 或 HPLC。
本章 目录
酶的提取：
酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶 原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。 一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非 极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易 溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行 提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有 机溶剂提取。
在酶的提取过程中，为了提高提取率并防止酶变性 失活，须注意以下几点：
1．温度： 通常抽提温度应控制在0-10oC（0-4 oC）。对某些耐温的酶，如胃蛋 白酶等，可适当提高抽提温度，在37 oC下保温抽提，效果较好。因 为提高温度、可提高酶的扩散速度，增加酶的溶解度，有利于酶的提 取。 2.试剂 接着要注意的就是避免使用一些会造成酶变性的试剂，比如说重金属 盐，有机试剂。严格意义上来说，要提取活性酶，任何可能使蛋白质 沉淀的试剂和方法都要避免使用。最好就是直接在液体环境下进行， 比较理想的方法就是色谱柱层析。然后，实际上为了防止蛋白质在提 取过程中被释放的内源性蛋白酶（木瓜蛋白酶，枯草蛋白酶等等）降 解蛋白质，还需要在提取环境中加入适当的蛋白酶抑制剂。
胃蛋白酶的提取实验报告
一、实验目的1. 了解胃蛋白酶的化学性质和生理功能。
2. 掌握从胃黏膜中提取胃蛋白酶的方法。
3. 学习实验操作技巧，提高实验技能。
二、实验原理胃蛋白酶是一种消化酶，主要存在于胃液中，能将蛋白质分解成肽和氨基酸。
本实验通过从新鲜猪胃黏膜中提取胃蛋白酶，探讨其提取方法及活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜猪胃黏膜、生理盐水、蒸馏水、氢氧化钠、硫酸铵、乙酸、酚酞指示剂、标准蛋白质溶液、考马斯亮蓝G-250染料、酶标仪、离心机、冰箱、烧杯、玻璃棒、移液管、滴定管、电子天平等。
2. 实验试剂：胃蛋白酶提取液、胃蛋白酶活性测定液、胃蛋白酶标准曲线、缓冲液等。
四、实验步骤1. 胃蛋白酶提取液的制备（1）将新鲜猪胃黏膜洗净，去除脂肪和杂质。
（2）将胃黏膜剪成小块，放入烧杯中，加入适量的生理盐水，用玻璃棒搅拌。
（3）将搅拌后的胃黏膜液过滤，收集滤液。
（4）向滤液中加入氢氧化钠溶液，调节pH至7.0。
（5）将溶液在室温下静置30分钟。
（6）加入硫酸铵溶液，使蛋白质盐析，沉淀蛋白质。
（7）将沉淀物用蒸馏水洗涤，直至无色。
（8）将洗涤后的沉淀物溶于适量的乙酸溶液中，制成胃蛋白酶提取液。
2. 胃蛋白酶活性测定（1）配制标准蛋白质溶液，用考马斯亮蓝G-250染料进行比色，绘制标准曲线。
（2）取一定量的胃蛋白酶提取液，加入适量的缓冲液，使pH值调至7.0。
（3）取标准蛋白质溶液和胃蛋白酶提取液，分别加入适量的胃蛋白酶活性测定液。
（4）将混合液置于37℃水浴中保温15分钟。
（5）取出混合液，加入适量的酚酞指示剂，用NaOH溶液滴定至终点。
（6）根据滴定结果，计算胃蛋白酶活性。
五、实验结果与分析1. 胃蛋白酶提取液的制备通过实验，成功从新鲜猪胃黏膜中提取出胃蛋白酶，提取液呈淡黄色。
2. 胃蛋白酶活性测定根据实验结果，绘制出胃蛋白酶标准曲线。
在实验条件下，胃蛋白酶活性为（XX±XX）U/mg。
六、实验结论1. 本实验成功从新鲜猪胃黏膜中提取出胃蛋白酶，提取方法简单可行。
蛋白质、蛋白酶以及短肽类的分离提纯技术及应用
蛋白质、蛋白酶以及短肽类的分离提纯技术
及应用
蛋白质、蛋白酶以及短肽类是值得研究的有机物，它们在生物体
中发挥重要的生理作用。
分离提纯蛋白质、蛋白酶以及短肽类的技术
被用于蛋白质分子的结构定义和代谢调控研究，其应用非常广泛。
目前，提取蛋白质、蛋白酶以及短肽类主要采用物质膜分离技术
和凝胶渗透分离技术。
物质膜分离技术是将原料经过预处理过程，液
流穿过物质膜，将原料折叠成传统高分子化合物，然后，多溶媒可以
不受限制地将非溶解物也分离出来。
物质膜分离技术的优点是膜的材
料和机械结构可以得到有效的把握，可以在较短的时间内完成提取。
凝胶渗透分离，也称凝胶渗透膜分离，利用蛋白质的分子量大小，分离出低分子物质，一般离子交换容量特别高，可以被广泛应用。
凝
胶渗透分离只需使用较低的分离压力，时间较短，实用且效率较高。
对于蛋白质、蛋白酶以及短肽类而言，这两种分离提纯技术都可
以有效地将其从原料中分离出来，以获得高纯度、定性和定量的产品。
蛋白质、蛋白酶以及短肽类的分离提纯技术的应用是广泛的，包
括食品检测、材料分析、药物发现和生物识别等。
此外，这些技术对
转基因食品的检测、膳食膳食营养测定以及转基因细胞研究等也有重
要的意义。
总之，蛋白质、蛋白酶以及短肽类的分离提纯技术及其应用具有
重要的意义，可用于获取高纯度、定性和定量的有机物产品，并在各
个领域得到广泛的应用。
制药工艺学试题试卷答案真题
制药工艺学试卷一、A型题 (每题1分，共20分)1.萃取操作时要注意控制水提取液的浓度,使其相对浓度在( )之间,浓度过大容易导致萃取不完全,过小则溶剂消耗太大,影响操作。
A.1~2B.1.1~1.2C.1.2~1.3D.1.3~1.42.外源蛋白表达时,在较高温度下表达包涵体的菌种,()下有利于表达可溶性蛋白。
A.适宜温度B.较高温度C.其它选项都不是D.较低温度3.胰岛素由( )个氨基酸残基组成,分为A,B两个肽链。
A.49B.50C.51D.524.阿糖胞苷的给药方式为()。
A.注射给药B.口服给药C.舌下含服D.喷雾吸入5.复方新诺明的成分甲氧苄啶与磺胺甲噁唑的配比( )。
A.1:3B.1:7C.1:1D.1:56.下列选项中,哪一个是工业生产中常用的溶剂,能与水以任意比例互溶,并且可以通过调节自身的浓度,选择性浸提药材中的某些有效成分?( )A.丙酮B.乙醇C.二氯甲烷D.氯仿7.( )是指彼此相同数值重复测量的相近度。
A.准确度C.特意度D.敏感度8.辅酶Q10粗制品可以用( )梯度洗脱除杂质。
A.乙醇-乙醚B.石油醚-乙醚C.氯仿-乙醇D.醋酸-乙酯9.以羊脑为原料提取卵磷脂的过程中,分别用( )倍体积的丙酮浸渍3次。
A.2.5,3,1.5B.3.5,2.5,1.5C.3,2.5,1.5D.3,2,110.下列属于酸性氨基酸的是( )。
A.赖氨酸B.苏氨酸C.谷氨酸D.精氨酸11.下列哪种催化剂适合用于氧化反应?( )A.铂B.钯C.二氧化锰D.镍12.可用于治疗脑及神经疾病的是( )。
A.5-羟色氨酸B.苏氨酸C.谷氨酸D.精氨酸13.胰酶在水溶液pH值大于6.0是不稳定的,通过加()可增加其稳定性。
A.镁离子B.铁离子C.钙离子D.锌离子14.研究、筛选适宜的中间体并确定高效、优质的工艺路线,采用合理的工艺原理,实现规模化生产过程最优化的一门学科是( )。
A.制药工程设计B.制药原理与设备D.制药工艺学15.制药工业对环境的污染主要来自( )生产。
胃蛋白酶生产工艺
胃蛋白酶生产工艺胃蛋白酶是一种重要的消化酶，能够在胃部分解蛋白质，帮助人体消化吸收。
胃蛋白酶的生产工艺主要包括菌种培养、发酵、提取和纯化等步骤。
以下是一个简要的胃蛋白酶生产工艺的介绍。
首先，选择合适的菌种进行培养。
常用的菌种是产胃蛋白酶的细菌，如枯草杆菌属的嗜热枯草杆菌（Bacillus thermoproteolyticus），也可以使用其他蛋白酶产生菌株。
菌种的选取要考虑其产量、生长速度和酶活性等因素。
然后，进行菌种的发酵过程。
将菌种接种到培养基中，控制好发酵条件，使菌株充分生长和繁殖。
发酵过程中要注意控制温度、pH值、氧气和营养物质等条件，以促进胃蛋白酶的产生。
接着，进行胃蛋白酶的提取。
发酵液经过离心分离，得到含有胃蛋白酶的上清液。
胃蛋白酶的提取过程中可能需要进行蛋白酶的激活或去除杂质等步骤，以提高酶的纯度和活性。
最后，进行胃蛋白酶的纯化和精制。
采用适当的分离技术，如层析、电泳等方法，将胃蛋白酶从提取液中分离出来，并去除其他成分和杂质。
纯化过程中要控制好条件，确保胃蛋白酶的纯度和活性。
在胃蛋白酶生产工艺中，需要重点考虑的因素有以下几点：1.菌种的选取和培养条件：选择产胃蛋白酶能力强、生长快速的菌株，并控制好培养基成分和发酵条件，以提高胃蛋白酶的产量和活性。
2.发酵条件的控制：控制好温度、pH值、氧气和营养物质等条件，以促进菌株的生长和胃蛋白酶的产生。
3.提取和纯化工艺的选择：根据实际情况选择合适的提取和纯化方法，以最大限度地提高胃蛋白酶的纯度和活性。
4.产品的质量控制：对生产的胃蛋白酶进行质量检测和控制，确保产品的活性和纯度达到要求。
综上所述，胃蛋白酶的生产工艺包括菌种培养、发酵、提取和纯化等过程。
通过合理选择菌种和优化发酵条件，以及采用适当的分离和纯化技术，可以获得高纯度、高活性的胃蛋白酶产品。
酶的分离纯化(上)
sephacyl S-系列，是适合N,N’-甲叉双丙稀酰胺 交联成的烯丙基葡聚糖，可用于水溶性系统，也适 用于有机溶剂或高浓度氢链解离试剂存在的系统。
② 聚丙烯酰胺凝胶
如：Bio-Gel P-系列，是聚丙烯酰胺与交联剂 N,N’-甲叉双丙稀酰胺共聚得到的交联凝胶。 P-后的数字乘以1000，表示凝胶用于分离 的最高分子量。
二、酶源选材：
1、目的酶含量要丰富 2、取材要方便 3、成本经济低廉 三、建立适当的纯化方法和活力检测方法
即要考虑：高灵敏性、准确性、所用仪器试 剂，又要注意纯化方法经济实效，多种方法 配合使用。
Section 2 酶的提取
提取的目的：将尽量多的酶和尽量少的杂质 从原料引入溶液。
一、预处理和细胞破碎： 材料要新鲜或冰冻 1、动物材料要去结缔组织和脂肪组织。 2、植物种子要先脱脂。 3、微生物则应将菌体和发酵液分离。
分辨率Rs=两峰带间距离/峰带宽，当Rs=1.2时， 基本达到要求。
*分辨率Rs与层析柱的大小及柱长有关，一般的 是Rs∝L½ ， L为柱长。但柱太长时，流速又 应为f=p·r²/L,p为压强，r为柱半径。
柱太小时，可能产生壁效应，发生拖尾现象
柱太大时，可能产生稀释效应以及峰形不均匀
所以柱长与内径应有适当的比例，常用的为 1/20~1/40
细胞破碎
1、机械破碎：
高速组织捣碎 （中等） 植物种子
手工匀浆、研磨（温和） 动物组织
球磨
（剧烈） 微生物
2、理化方法：
超声波破碎 125w 5min 细菌
化学溶胀
红血球
酶解
细菌
蛋白质酶提取纯化方法
淀粉酶是蛋白质，可以根据其特点选择适当的蛋白质提取纯化方法！选择材料及预处理以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。
一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。
在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。
蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。
微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。
对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。
植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。
对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。
另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
蛋白质的分离纯化一，蛋白质（包括酶）的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
液相色谱法分离胃蛋白酶原
高压凝胶过滤色谱法 中压阴离子交换色谱法 胃蛋白酶原
Ù
前言
正常人胃粘膜中的胃蛋白酶原有多种 包括
∗ ∗ ∀其中
滤 色谱柱
≅
Байду номын сангаас
Λ ∗
分子量范围
分离胃蛋白酶原粗制品 ∀配制不同离子强 度的流动相进行试验 结果发现离子强度过高或过 低都会影响分离结果 本文选择流动相为
Ù Ù ∀整个色 Ù 左右 ∀流速的试验范围为 ∗ Ù Ù
洗脱主要通过盐浓度的程序变化来控制流动相的强 度 ∀设 计 不 同 盐 浓 度 的 梯 度 程 序 缓 冲 液
Ù 乙 酸 乙 酸 钠 Ù
和峰顶点进行分析 峰 各点的最大吸收值都是 为纯组分 峰 在同样 点的最大吸收值有些 偏移 估计为
¬ 和 的混合组分 见图
缓冲液
∀经多次试验 发现当最后流动
高压凝胶过滤色谱 根据胃蛋白酶原分子量的差异 选用凝胶过
Ξ
本工作是江苏省自然科学基金项目 本文收稿日期 修回日期
胃癌相关性研究的一部分
色 用二极管阵列检测器对图 的色谱峰进行纯 度分析 ∀峰 的最大吸收值为 杂蛋白 峰 经活性测定为 峰 为活性组分 ∀取半峰高处左右各 点
谱
卷 梯度程序的设计 在离子交换色谱中 梯度
型高效液相色谱仪 自动进样器
图
左
Φιγ
胃蛋白酶原粗制品在凝胶过滤柱上的色谱图
Λ Χηρο ατογ ρα οφ χρυδε ε σινογ εν ον γ ελ φιλ τρατιον χολ υ ν
二极管阵列检测器
中压液相色谱仪 型自动收集器 ∀
胃蛋白酶酶解提取鸡骨胶原蛋白工艺的研究
胃蛋白酶酶解提取鸡骨胶原蛋白工艺的研究王晨1，吴晖1，李晓凤1，刘冬梅1，赖富饶1，仇宏伟2（1.华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640）（2.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266109） 摘要：以干鸡骨粉为原料，研究了骨胶原的酶法提取工艺。
实验结果表明：原料需用1.0 mol/L HCl脱钙处理2 d，用正己烷脱脂后，再利用胃蛋白酶进行酶解。
最佳酶解工艺为：加酶量150 U/g、pH值1.7、37 ℃条件下处理120 min，然后在液固比6:1的情况下用水抽提5 h。
在上述条件下，骨胶原提取率可达18.4%，其蛋白质含量为54%。
关键词：骨胶原；提取；酶解中图分类号：TS201.2；文献标识码：A；文章篇号:1673-9078(2008)12-1300-04Enzymatic Extraction of Collagen from Poultry Bone by PepsinWANG Chen1, WU Hui1,LI Xiao-feng1,LIU Dong-mei1, LAI Fu-rao1,QIU Hong-wei2(1.College of Light Industry & Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)（2.College of Food Science & Engineering, Qingdao Agriculture University, Qingdao 266109, China)Abstract: Enzymatic treatment to improve the extraction of collagen from chicken bone powder was explored in this paper. The rawmaterials was decalcified by 1.0 mol/L HCl for 2 days, defatted by hexane and then hydrolyzed by pepsin under the following optimalconditions: enzyme dosage of 150 U/g, reaction time of 120 min, pH value of 1.7, and reaction temperature of 37.℃ For the extraction ofcollagen from the enzymatic hydrolyzate, the best liquid/solid ratio and extraction time were 6:1 and 5h respectively. Under these conditions, theextraction rate and protein content of the collagen from poultry bone were of 18.4% and 54%, respectively.Key words: bone collagen; extraction; enzymatic hydrolysis骨胶原是存在于人体和动物体内的一种胶原蛋白，是人体关节软骨、骺软骨和骨小梁的主要成份，占骨骼有机物的80%以上[1~2]。
胃蛋白酶原I,Ⅱ的分离纯化及初步临床应用
胃蛋白酶原I,Ⅱ的分离纯化及初步临床应用
蒋孟军;肖志坚
【期刊名称】《中国实验临床免疫学杂志》
【年(卷),期】1999(011)002
【摘要】用ＤＥＡＥ－５２阴离子交换层析，凝胶过滤高压液相层析（ＨＰＬＣ），Ｑ－２阴离子交换中压层析从人胃粘膜中提取了胃蛋白酶原Ｉ，Ⅱ，比活分别为１２．５Ｕ／ｍｇ和１９．１Ｕ／ｍｇ得率分别为３１．３５和１０．０％，提取的胃蛋白酶原Ｉ，Ⅱ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分别呈单一区带，分子量分别为２４ｋＤ和３７ｋＤ。
潜在的蛋白水解活性的最适ｐＨ都为１．８ＰＧＩ经碱性缓冲液处理后，其水解活性明显变化。
而ＰＧⅡ对碱性缓冲液不短
【总页数】4页(P32-35)
【作者】蒋孟军;肖志坚
【作者单位】江苏省原子医学研究所;江苏省原子医学研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R446.62
【相关文献】
1.胃蛋白酶原Ⅰ、Ⅱ RIA的初步临床应用 [J], 殷政芳
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苏文金;曹敏杰
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蛇鲻胃蛋白酶的分离纯化和性质研究
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显 的 抑制 作用 ，Ｐ Ｆ和 Ｐ ｐ ｔｔ 能 完 全 抑 制 胃 蛋 白酶 的 活 性 。Ｃ ２ ＭＳ ｅｓａｉ Ａ ｎ ａ 、Ｍ ｎ ２ 、Ｍｇ 、Ｂ ２ 该 酶 影 响 不 大 ， ａ 对
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胃蛋白酶提取的分离纯化
胃蛋白酶提取的分离纯化IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。
其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。
纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。
综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。
关键词：胃蛋白酶分离纯化应用．生物提取法生产胃蛋白酶1．1 工艺路线（自溶、过滤）（脱脂、去杂质）猪胃黏膜→自溶液→上清液（浓缩、干燥）→胃蛋白酶成品工艺过程（1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。
一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。
（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。
用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。
（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。
（4）浓缩、干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。
球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。
2胃蛋白酶的分离技术有机溶剂法可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。
通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。
当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。
丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。
2．2盐析法盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。
实训 结晶法提纯胃蛋白酶
实训结晶法提纯胃蛋白酶［任务描述］药用胃蛋白酶是胃液中多种蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶、组织蛋白酶、胶原蛋白酶等，为粗制的酶制剂。
临床上主要用于因食蛋白性食物过多所致的消化不良及病后恢复期消化机能减退等。
胃蛋白酶广泛存在于哺乳类动物的胃液中，药用胃蛋白酶系从猪、牛、羊等家畜的胃黏膜中提取。
药用胃蛋白酶制剂，外观为淡黄色粉末，具有肉类特殊的气味及微酸味，吸湿性强，易溶于水，水溶液呈酸性，可溶于70％乙醇和pH4的20％乙醇中。
难溶于乙醚、氯仿等有机溶剂。
干燥的胃蛋白酶稳定，100℃加热10min不破坏。
在水中，于70℃以上或pH6.2以上开始失活，pH8.0以上呈不可逆失活，在酸性溶液中较稳定，但在2mol/L 以上的盐酸中也会慢慢失活。
最适pH1.0～2.0。
结晶胃蛋白酶呈针状或板状，经电泳可分出4个组分。
其组成元素除N、C、H、O、S外，还有P、C1。
相对分子质量为34500，pI为1.0。
胃蛋白酶能水解大多数天然蛋白质底物，如鱼蛋白、黏蛋白、精蛋白等，尤其对两个相邻芳香族氨基酸构成的肽键最为敏感。
它对蛋白质水解不彻底，产物为胨、肽和氨基酸的混合物。
胃蛋白酶是具有生物活性的大分子物质，其活性很容易受到有机溶剂的破坏，所以本次实训任务采用结晶法提纯胃蛋白酶，可以大大提高胃蛋白酶的活性。
［任务实施］一、准备工作1.建立工作小组，制定工作计划，确定具体任务，任务分工到个人，并记录到工作表。
2.收集结晶法提纯胃蛋白酶工作中必须信息，掌握相关知识及操作要点，与指导教师共同确定出一种最佳的工作方案。
3.完成任务单中实际操作前的各项准备工作。
（1）材料准备猪胃黏膜。
（2）试剂6mol/L盐酸、盐酸试液（取1mol/L，盐酸溶液65mL，加水至1000mL）、6mol/L硫酸、纯化水、氯仿、5%三氯醋酸、1%血红蛋白试液、硫酸镁、无水乙醇、L-酪氨酸标准品。
（3）仪器烧杯、玻璃棒、试管、水浴锅、旋转蒸发仪、真空干燥箱、可见分光光度计、研钵、移液管等。
分离纯化的原理及方法
1、分离纯化的原理及方法：1、根据分子大小和形状不同（凝胶过滤法。
透析和超滤法、密度和梯度离心法）2、根据分子的带电性质分离（离子交换法、电泳法）3、根据分子极性大小及溶解不同进行分离（等电沉淀法、盐析法）4、根据配体特异性进行分离（亲和层析法）5、根据物质的吸附性进行分离（吸附层析法）2、盐析用盐及条件选择：1、硫酸铵、氯化钠、硫酸钠2、盐析条件控制：ph值常被控制在被沉淀物等电点附近、温度一般控制在室温，特殊酶类在4摄氏度下、盐浓度常根据被分离物选择饱和度不同的盐。
盐析法的优点：对设备要求低安全应用范围广、不会发生变性3、在萃取中常用（分配系数表示平衡的两个共存相溶质浓度的关系。
对互不混溶的两液相系统分配系数常为k=c1|c24、胃蛋白酶和胃膜素的制备：性质：淡黄色粉末、肉类特殊气味，易溶于水吸湿性强、呈酸性、难溶于有机溶剂。
用途：临床上用于消化不良、食欲不振的治疗（自溶、过滤）（脱脂、去杂质）（浓缩、干燥）猪胃黏膜-h2o、hcl---自溶液--三氯甲烷或乙醚------上清液---------成品45·c--48·c 24-28h 40·c工艺过程：a 自溶、过滤：在夹锅内预先加水100l及盐酸，加热至50·c，在搅拌加入200kg 猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀、保持45-48·c，消化3-4h用纱布过滤除去未消化的组织蛋白，收集滤液b 脱脂、去杂质：将滤液降温至30·c以下，静置24-28h使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液c 浓缩、干燥：取脱脂酶液，在40·c以下浓缩至原体积1/4左右，真空干燥，球磨，即得胃蛋白酶。
D-甘露醇：性质：白色针状结晶、无臭、略有甜味、不潮解、易溶于水、溶于热乙醇不溶于有机溶剂。
生化药物：是运用生理学的理论、方法。
直接从生物体分离或用微生物合成或用现代生物技术制备的一类用于预防治疗、诊断疾病的药物。
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胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展
摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。
其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。
纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。
综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。
关键词：胃蛋白酶分离纯化应用
．生物提取法生产胃蛋白酶
1．1 工艺路线
（自溶、过滤）（脱脂、去杂质）
猪胃黏膜→自溶液→上清液
（浓缩、干燥）
→胃蛋白酶成品
工艺过程
（1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。
一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。
（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。
用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。
（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。
（4）浓缩、干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。
球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。
2胃蛋白酶的分离技术
有机溶剂法
可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。
通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。
当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。
丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。
2．2盐析法
盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。
美国专利（2，701,228）改进后，用锌盐沉淀胃酶。
当母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在—时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀，沉淀物为胃酶的锌盐，然后用金属螯合剂除去锌盐，得15000—16000倍活力的酶，收集率为%%。
此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。
底物亲和法
底物亲和法是利用酶（胃蛋白酶）与其底物（酪蛋白）的亲和性，从胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。
使底物和酶在的乳酸缓冲液中充分结合，然后调pH至4（底物的等电点）沉淀底物和酶的结合物，随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中，添加低浓度的SDS将底物和酶分离，得到酶—SDS复合物，再进一步分离纯化。
陈躬瑞（2001）成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离，得率大约为30%。
与传统的分离方法比较，此法具有简单高效的优点，为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用，同时具有较高的特异性。
【2】
透析法
胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法。
该法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性而与小分子物质及盐分开的。
由于透析主要是扩散过程，如果袋内外的盐浓度相等，扩散就会停止，因此要经常换溶剂，一般一天换2—3次。
如在冷处透析，则溶剂也要预先冷却，避免样品变性。
透析时的盐是否除净，可用化学试剂或电导仪来检测。
【1】
3胃蛋白酶的纯化技术
凝胶过滤法
美国在20世纪60年代研究结晶为蛋白酶的生产工艺时，是将75mg的胃蛋白酶原样本溶解在8mL的蒸馏水中(pH5．0～6．0)，在14℃±1。
，pH2．0下，保持20min激活。
然后用磺乙基Spandex G-25层析，最后用羟基磷灰石进行色谱层析。
结果表明用层析法得到的胃蛋白酶为单一物质纯品。
离子交换层析法
陈躬瑞等人在纯化蕲蛇胃蛋白酶时将SDS沉淀后的上清液上样到预先用0．05mol／L乙酸缓冲液(pH5．0)平衡的DEAE—TOYOPEARL离子交换色谱柱(4．6mm X 100mm)上，用0～O．25mo1／L氯化钠梯度洗脱，流速为1ml／min。
得到的酶在5O℃30min有较高的活性，有望应用于高温食品加工中。
【2】
基于以上对胃蛋白酶的分离纯化技术的比较分析可以看出，长期以来分离提取技术一直没有取得较大的突破，用有机溶剂、盐析等技术得到的天然胃蛋白酶产品，纯度、生物活性愈将不能满足医药品和工业日益增长的需要。
随着分离科学技术的不断发展，采用新型分离技术分离胃蛋白酶已势在必行。
因此，大多数学者认为以下几种技术是胃蛋白酶分离纯化的方向。
．1有机溶剂与盐析共沉淀
有机溶剂和盐析法都是分离纯化胃蛋白酶的传统方法，有其各自的特点。
如果将有机溶剂和盐析配合使用，不仅可以降低盐的用量，而且可以不同程度的消除各自分离纯化所带来的问题，得到的胃蛋白酶纯度和活性也会有所增加。
膜分离技术
分离膜是一种特殊的、具有选择性透过功能的薄层物质，能利用分子大小实现分离，从而起到浓缩和分离纯化的作用。
由于其可在维持原生物体系环境的条件下实现分离，并可高效地浓缩、富集产物，有效地去除杂质，加之操作简单，结构紧凑、能耗低，过程简化，无一次污染，也将成为胃蛋白酶分离纯化工艺的研究方向。
等电点沉淀法与底物亲和法
胃蛋白酶具有极低的等电点(如猪胃蛋白pH1．0)，但胃蛋白酶的分离纯化技术中等电点沉淀法未见报道，如果此方法可实现，那将大大缩短分离纯化的时间。
底物亲和法是分离纯化胃蛋白酶的新亮点，但其工艺条件还不成熟，尤其是在分离底物和酶的复合物时，SDS 的添加量有待研究。
4 结论
有人预言，21世纪将是生物技术的世纪，尤其是生物制药技术的世纪。
生物制药被誉为21世纪的“朝阳产业”。
得益于生物制药技术的酶类药物也日趋成熟。
高效的胃蛋白酶分离纯化工艺、技术和设备的出现，人们必将开发出高效的胃蛋白酶提取工艺。
这对于提高功能性胃蛋白酶产品、提高生产率、降低生产成本和改善人民生活水平起着举足轻重的作用。
而胃蛋白酶单一组分的制备分离，可为胃蛋白酶的研究开发提供标准品，同时能为后期胃蛋白酶单一组分生理活性的研究提供必要的物质保障。
参考文献
[1]张继平，郭照良，唐东生等.暗纹东方纯胃蛋白酶的分离纯化及部分性质研究[J]，湖南农业大学学报，2004（30）：526-529
[2]陈躬瑞、柯李晶、赵恒裕等．底物亲和法分离纯化薪蛇胃蛋白酶[J]，中国食品学报，2001(1)：5O-55
[3]黄纯，生物化学，科学出版社，北京，，18-49。