酶的提取与分离纯化

■ 盐溶液提取（盐溶 Salting-in ）：
NaCl
溶
解
KCl
度
Ionic strength
+=+=-
NaCl
+-
- +-+
+
-
-
+
-
++
-
+
+-
-+
-
+
+
+
-
+
-
-+ +
+-
+
-
- -+- +
+
-
分子在其等电点时，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入 盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。
自溶法 外加酶制剂法
本章 目录
1.珠磨法（Bead mill）
原理：
进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化 铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、 珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内 含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆 液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套 冷却的方式带走。
使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、 丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被 抽提出来。
气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干； 真空干燥多用于细菌。
三、破碎率的测定与破碎技术的研究方向
1. 破碎率的测定
1)直接测定法
采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。 如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；
物理破碎 化学破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
酶促破碎
通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎
捣碎法 研磨法 匀浆法
温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法
有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween
将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利用500MPa 以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破 碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起 的。
此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及 活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。
2. 渗透压法（Osmotic pressure）
空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的 冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪 切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。
一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的 效果较差， 该法在实验室小规模细胞破碎中常用。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。
对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如 多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞 留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一 步提取。
缺点： 通用性差；
时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒 。
5.其他方法
1. X-press法
（2）EDTA螯合剂
处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结 构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持， 一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落， 使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补， 从而导致内层膜通透性的增强。
（3）有机溶剂
在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及 高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。
易造成堵塞的团状或丝状真菌， 较小的革兰氏阳性菌， 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）
不宜采用高压匀浆法。
3.超声破碎法（Ultrasonication）
在15-25 kHz的频率下操作。其原理可能与空化现象（cavitation phenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。
2)目采用的革产兰物氏染测色定法法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，
而受损害的细胞呈亮红色。 将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的 产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得
3)导的标电准率数测值比定较法，计算其破碎率。
细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相， 使导电率上升。
❖ 原则：酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质， 选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性 溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中， 酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性 溶剂中。
❖ 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、 稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含 有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。
2.破碎技术的研究方向
❖在发1酵)培多养种过破程碎中方，法培养相基结、合生长期、操作参数（如pH、温 度 构、与通组2气成)与量有、一上搅定游拌的过转影程速响相、。结稀细释胞合率的等破）碎等与因上素游都培对 养细过胞程壁有膜关的。结 ❖此外3，)用与化基下学因法游工、工酶程程法的、相方机法结械对法合相菌结种合进。行改造，以提高胞内物质的
实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、 Braun匀浆器； 中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德 国西门子机械公司制造）。
珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分 子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不 易分离而给后续操作带来的困难。
酶分离纯化不同阶段
酶的纯化过程，约可分为三 个阶段：
(1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质打破细胞 → 抽 出全蛋白，多使用 盐析沉淀 法；可以粗略去除蛋白质以 外的物质。
(2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用 各钟 柱层析法。
(3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化， 可用制备式电泳 或 HPLC。
对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖 结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只 剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出 胞内产物。
酶溶法的优点： 选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。
缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同 的酶），产物抑制的存在。 在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡 聚糖酶。
将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶 液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于 渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚 至破裂。
仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加 入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。
3. 反复冻结-融化法
细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎； ❖选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌； ❖在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温 度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含 物。
第三节 酶的提取
❖ 定义：酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶 剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶 液中的过程。也称为酶的抽提。
2.高压匀浆法（High-pressure homogenization）
——大规模细胞破碎的常用方法
采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成，英国APV公司 和美国 Microfluidics公司均有产品出售）。
原理：
利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲 击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时， 每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环 上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动 过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成 细胞破碎。
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、 抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透 性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。
该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。
（1）表面活性剂
可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。
如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有 很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子 层，使某些胞内物质释放出来。 其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可 使细胞破碎。
能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂， 胞内物质被释放出来。
甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。
（4）变性剂
盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲（Urea）是常用的 变性剂。 变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而 使疏水性化合物溶于水溶液。
化学渗透法优点：
本章 目录
第二节：细胞破碎
许多酶存在于细胞内。为 了提取这些胞内酶，首先
JY92-II D超声波
需要对细胞进行破碎处理。 细胞粉碎机
1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
高 压 细 胞 破 碎 机
细 胞 破 碎 珠
细胞破碎方法及其原理
机械破碎
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
4.酶溶法（Enzymatic Lysis）
（1）外加酶法
常用的溶酶
溶菌酶、 溶菌酶主要用于细菌类 β-1，wenku.baidu.com-葡聚糖酶、 β-1，6-葡聚糖酶、 蛋白酶、 甘露糖酶、 糖苷酶、 肽键内切酶、 壳多糖酶等
细胞壁溶解酶是几种酶的复合物
利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学 组成选择适当的酶，并确定相应的次序。
■ 酸溶液提取
❖ 有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定性 较好，易用酸溶液提取。
注意事项： pH值不能过低，以免使酶变性失活。
■ 碱溶液提取
提取率也是如非用常溶重解酶要预的处。理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa压 ❖在生长后力期下，匀加浆4入次某，些总破能碎抑率制接或近阻100止%细。胞而单壁独物采质用合高成压匀的抑制剂
（如青霉细素浆胞、法破环，丝同碎样氨与条酸件固等下）破液，碎分率继只离续有培紧32养%密一。相段时关间。后，新分裂的
第六章 酶的提取和分离纯化
Go 1、酶的提取与分离纯化技术路线 Go 2、细胞破碎 Go 3、酶的提取 Go 4、酶的分离方法 Go 5、酶的组合分离纯化策略 Go 6、酶的浓缩、干燥与结晶
第一节 酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 酶提取
动物、植物或微生物细胞 发酵液
酶分离纯化
酶浓缩 酶贮存
离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
酸溶液提取 pH2～6的水溶液
用于提取在稀酸溶液中溶解度大， 且稳定性较好的酶
碱溶液提取 pH8～12的水溶液
用于提取在稀碱溶液中溶解度大且 稳定性较好的酶
有机溶剂提取 可与水混溶的有机溶剂 用于提取那些与脂质结合牢固或含 有较多非极性基团的酶
本章 目录
大多数蛋白类 酶都溶于水， 而且在低浓度 的盐存在的条 件下，酶的溶 解度随盐浓度 的升高而增加， 这称为盐溶现 象。
❖ 提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、缩短扩 散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散 速度，从而增大提取效果。
❖ 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取 过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。
酶的主要提取方法
提取方法
使用的溶剂或溶液
提取对象
盐溶液提取 0.02～0.5mol/L的盐溶液 用于提取在低浓度盐溶液中溶解度 较大的酶
（2）自溶法（Autolysis）
诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的 活力，以达到细胞自溶的目的。
影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激 活剂和细胞代谢途径等。
缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的 变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。
4.化学渗透法（Chemical permeation）
将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多 次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键 结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变 化，引起细胞膨胀而破裂。
适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融 过程中可能引起某些蛋白质变性。
4.干燥法
气流干燥 真空干燥 喷雾干燥 冷冻干燥