蛋白质和酶的分离与纯化培训讲学
蛋白质和酶的分离与纯化
蛋白质和酶的分离纯化及鉴定蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。
从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。
要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。
蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。
要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。
目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。
一、质分离纯化的一般原则1. 原料的选择原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。
蛋白分布：体液、组织、细胞定位2. 破碎方法：(1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。
如：捣碎法、研磨、匀桨法(2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。
如：反复冻融、渗透压、超声破碎(3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法.如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween）(4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法4. 先粗后细，分级分离粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。
如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。
精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。
5. 避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等）二、常用的蛋白质的分离纯化技术可以根据各种蛋白质的结构、理化性质不同设计分离方法。
（一）根据蛋白质的溶解度不同进行分离1. 蛋白质盐析蛋白质属于生物大分子之一，分子量从1万至100万之巨，其分子的直径可达1-100nm，为胶粒范围之内。
蛋白质的表面电荷和水化膜是其主要的稳定性因素。
蛋白质与酶的分离与纯化
蛋白质与酶的分离与纯化摘要本文主要介绍蛋白质与酶的分离与纯化方法，包括一些常用的技术和步骤。
首先介绍蛋白质和酶的定义和特性，然后探讨蛋白质与酶分离和纯化的重要性。
接着分析了三种常用的分离与纯化方法，包括盐析、层析和电泳。
最后总结了每种方法的特点和适用范围，并对未来的研究方向进行了展望。
1. 引言蛋白质和酶是生物体内最重要的分子之一，参与了生命体的许多重要生物学过程。
为了研究和了解蛋白质和酶的功能和结构，分离和纯化方法至关重要。
2. 蛋白质与酶的定义和特性蛋白质是由氨基酸残基组成的大分子化合物，具有多种功能，如催化反应、传递信号和提供结构支持等。
酶是一类特殊的蛋白质，能够催化生物体内的化学反应。
3. 蛋白质与酶分离和纯化的重要性蛋白质与酶的分离和纯化是研究其功能、结构和性质的基础。
只有纯化后的蛋白质和酶才能够进行进一步的研究和分析。
4. 盐析方法盐析是利用蛋白质和酶与盐的相互作用进行分离的方法。
通过控制溶液中的盐浓度，可以使蛋白质和酶从溶液中沉淀出来。
5. 层析方法层析是利用分离剂在固定的层析材料上进行分离的方法。
根据蛋白质和酶的性质和大小，可以选择不同类型的层析材料进行分离。
6. 电泳方法电泳是利用蛋白质和酶在电场中的迁移率差异进行分离的方法。
根据蛋白质和酶的电荷、大小和形状等特性，可以选择不同类型的电泳方法进行分离与纯化。
7. 方法比较与应用盐析、层析和电泳方法各有其优势和适用范围。
根据具体的实验目的和条件，可以选择合适的方法进行蛋白质与酶的分离与纯化。
8. 未来展望随着科学技术的不断发展，蛋白质与酶的分离与纯化方法也在不断改进和创新。
未来的研究方向包括开发更高效、更精确的方法和技术，以及应用新的纯化剂和材料等。
结论蛋白质与酶的分离与纯化是研究其结构和功能的基础，对于深入理解生物体内重要的生物学过程具有重要意义。
盐析、层析和电泳等方法可以有效地分离和纯化蛋白质与酶，并根据实验的需要选择合适的方法。
蛋白质分离技术全ppt课件
蛋白质 的分离与纯化
一、 引言
二、 蛋白质（酶）分 离纯化的前处理三、蛋白质（酶来自分离 与纯化四、层析技术
五、电泳技术
六、离心技术
1
一、 引言
• 蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。蛋白质是生物 功能的执行者，担负着生物催化、物质 运输、运动、防御、调控及记忆、识别 等多种生理功能。
化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷， 破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉 淀。
26
Salting-in
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
27
水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
水化膜 碱
酸
等点电时的蛋白质 （亲水胶体）
脱水
带负电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
• 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八 十多年的历史，其突出的优点是：
• ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 • ②操作简单、安全。 • ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
25
⑴ 盐析的基本原理
• 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水 化膜和电荷。
• 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 • 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水
• 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛 酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将 细胞壁分解。
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
蛋白质分离与纯化
细胞器碎片
溶酶体
粒线体
过氧化物酶体
三、提取
1 提取的基本概念与影响因素 提取（抽提或萃取）：组织细胞破碎过程中， 大量的胞内酶及细胞内含物被释放出来，必须 立即将其置于一定溶剂中，让制备物充分溶解， 并尽可能保持原来的天然状态，避免因长久放 置造成制备物的分解破坏。 主要影响因素：a 欲提取的物质在所用的溶剂中 的溶解度；b 该物质向溶剂扩散的难易 溶解度大小：a 溶剂（相似相溶）；b 温度；c 等电点
标记酶的种类
质膜： 主要两种：Na+、K+-ATP酶、腺甘酸环化酶； 细胞核：主要是担负DNA与RNA合成的酶。如RNA甲基 转移酶、乳酸脱氢酶等；
线粒体：主要集中了参与三羧酸循环、脂肪酸氧化、呼吸
链、氧化磷酸化等与能量代谢有关的酶和酶系。 如 NADH脱氢酶、己糖激酶等；
溶酶体：各种水解酶（约60种左右）；
二、分离纯化的要求
1 纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研 究蛋白质（酶）一级结构、空间结构，一级结构与功能的 关系、工具酶和标准蛋白、分析用酶制剂，都要求均一； 工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即 可，不要求均一。 2 活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。 3 收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少 损失。而且提纯步骤越多，损失越大。 4 在制备时丢失的蛋白（酶）永远不能在后面实验中弥补。
2 物理破碎方法
2.1 温度差破碎法 将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复 几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐 浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
2.2 超声波破碎法 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞 急剧震荡破裂。多适用于微生物材料，用大肠 杆菌制备各种酶，常选用50~100mg菌体/mL浓 度，在1~10kG频率下处理10~15min。缺点是 在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温 措施。 影响因素：样品浓度、超声波频率、功率、破 碎时间 操作：冰浴、间歇进行 适用于悬浮细胞破碎。对超声波敏感和核酸 应慎用。
蛋白质的提取与分离纯化——生化实验设计讲解课件讲解学习
值得注意的是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白 质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析 以除去小分子的配基。
凝胶层析法属最常用的蛋白质分离方法。系混合
物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时， 混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。 在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶 网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子 量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速 缓慢，致使最后流出柱外。
此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁 移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，
式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常 数若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质 在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即 可在标准曲线上求得分子量。
玻璃匀浆机
b、细胞器的分离
细胞器的分离一般采用差速离心法。细 胞经过破碎后，在适当介质中进行差速 离心。
三、蛋白质粗提取
从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的， 需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质 分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条 件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是 有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质 （如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后 操作。常用有机溶剂提取除去。
二、a 细胞的破碎
⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破 坏。常用器械有： ①玻璃匀浆器（用两个磨砂面相 互摩擦，将细胞磨碎） ②高速组织捣碎机（转速可 达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于 动物内脏组织的破碎 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织 细胞破碎的方法。 Ⅰ反复冻融法 Ⅱ冷热变替法 Ⅲ超 声波法 ⑶化学及生物化学方法
蛋白质的分离和纯化精品课件
• A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果
• B、气泡阻碍蛋白质的运动 • C、气泡与蛋白质发生化学反应 • D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密
最新 PPT
34
2、样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A
• A 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱 内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
最新 PPT
40
4、在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷
酸缓冲液处理的目的是 A.防止血红蛋白被O2氧化
( D)
B.血红蛋白是一种碱性物质，需要酸中和
C.磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程
D.让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其 结构和功能
最新 PPT
41
5、下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的
最新 PPT
50cm高
32
样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到 与凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶 端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样， 同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝 胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
• B.采用透析法使蛋白质与其他小分子化合 物分离开来
• C.离心沉降法通过控制离心速率使分子大 小、密度不同的蛋白质分离
• D.蛋白质在电场中可以向与其自身所带电 荷相同的电极方向移动
最新 PPT
18
三、血红蛋白的提取和分离
1.样品处理 2.粗分离 3.纯化 4.纯度鉴定
最新 PPT
19
1.样品处理
叙述中，正确的是 ( D )
A.用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去 除细胞表面杂蛋白
蛋白质与酶工程 酶的提取分离和纯化
(1)离心 (2)透析 (3)凝胶过滤 (4)超过滤 2、基于电荷 (1) 离子交换色谱 (2) 电泳 (3) 等电聚焦
3、基于溶解度 改变pH、离子强度、介电常数等实现的
沉淀分离： (1) 盐析法 (2) 复合沉淀法 (3) 有机溶剂沉淀法 (4) 等电点沉淀法 (5) 选择性变性沉淀法
环、脂肪酸氧化、脂肪酸合成酶以及蛋白质合成、DNA聚 合酶、RNA聚合酶等
④高尔基体：多糖、核蛋白粘液生成酶 ⑤溶酶体：各种水解酶等 ⑥叶绿体：参与光合作用形成ATP、NADPH有关的酶
类、与暗反应有关的酶系
线粒体主要酶的分布（约有120种酶）
部
位
酶的名称
单胺氧化酶、犬尿氨酸羟化酶、NADH-细胞色素C还原酶、
1-2 提取纯化之目的 1)酶催化功能的应用 2)酶学研究
酶的结构、功能、催化机制、催化动力学 酶的生物合成及其调控规律等
1-3 纯化的必要性 1)生物细胞中同时存在多种多样的酶 2)多酶可能作用于同一个底物 3)酶在生物细胞中的分布并不是均一的
二、酶的提取（extraction)
2-1 了解所分离酶在细胞中的分布 1、细胞外酶：由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用
蛋白质与酶工程 酶的提取分离和
纯化
酶的提取、分离和纯化
一、概述 二、酶的提取 三、酶的分离纯化 四、酶的结晶 五、浓缩与干燥 六、酶纯化步骤的设计及评价
一、概述
1-1 酶提取与分离纯化的定义 将酶从细胞或其酶的技术 过程
*酶的纯化程度根据需要而定 *纯化方法多种多样，为获得较好的效 果往往是2种或2种以上联合应用
外
膜 脂类代谢有关的酶（酰基辅酶A合成酶、脂肪酸激酶等）
特征酶：单胺氧化酶
蛋白质的分离与纯课件
纯化目的: 研究其结构、组成、性质和功能等。 纯化方法的依据：蛋白质的基本性质
1）溶解性：盐析等。 2）分子大小和形状：凝胶过滤（分子筛过滤）， 透析，超离心，超滤等。 3）电荷（酸碱性质）：电泳，离子交换层析，等 电聚焦等。 4）吸附性质：吸附层析，疏水互作层析。 5）特异结合亲和性：亲和层析。
• 有的方法利用了蛋白质几个方面的性质。 • 一般要连续采用多种方法才能达到纯化的目的。
Selection of protein source 蛋白质原料的 选择
• 选含“目的”蛋白多的原料。 • 选来源广、容易得到的原料。 • 用重组DNA技术（recombinant DNA technique）
（二）有机溶剂沉淀蛋白质：
• 凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，
如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀 蛋白质。
• 沉淀原理是：① 脱水作用；② 使水的
介电常数降低，蛋白质溶解度降低。
• 为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，
有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)，而且
需要在低温条件下进行。
（三）层析：
反过来可根据某物质的Ve或Ve/V0推测出其分子 量。
1）制作标准曲线 2）待测样品过柱或 与标准物质混合过柱。
测定其Ve和V0值。 查标准曲线。
Ion exchange chromatography 离子交换层析（2）
• 基本原理： 根据物质的电离性质进行交换，然后用 适当的洗脱液进行洗脱。由于各种被分离的物质离 子的净电荷量不同，与载体上与可解离基团的结合 力大小不同，所以被先后洗脱下来。
SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰凝胶电泳（1）
• SDS-PAGE ：利用SDS处理蛋白质后，在变性条件下进 行的聚丙烯酰凝胶电泳。即“变性”电泳。
蛋白质和酶的分离与纯化
蛋白质和酶的分离纯化及鉴定蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。
从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。
要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。
蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。
要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。
目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。
一、质分离纯化的一般原则1. 原料的选择原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。
蛋白分布：体液、组织、细胞定位2. 破碎方法：(1)机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。
如：捣碎法、研磨、匀桨法(2)物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。
如：反复冻融、渗透压、超声破碎(3)化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法.如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween）(4)酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等3.目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法4.先粗后细，分级分离粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。
如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。
精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。
5.避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等）二、常用的蛋白质的分离纯化技术可以根据各种蛋白质的结构、理化性质不同设计分离方法。
（一）根据蛋白质的溶解度不同进行分离1.蛋白质盐析蛋白质属于生物大分子之一，分子量从1万至100万之巨，其分子的直径可达1-100nm，为胶粒范围之内。
蛋白质的表面电荷和水化膜是其主要的稳定性因素。
蛋白质分离纯化技术ppt课件
.
10
紫外分光光度法测定蛋白质含量的 实验原理
1.蛋白质分子中，酪氨酸和色氨酸残基含有共轭双键， 使蛋白质具有吸收近紫外光的性质。吸收高峰在280nm 处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。
2.蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。 利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓 度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
.
24
考马斯亮兰G-250
实验原理：考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白 质结合，使染料的最大吸收峰的位置(max),由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为， 染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸和赖
氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
.
6
测定分两步：
① 用沸浓硫酸消化，并以硫酸铜为催化剂，使碳、氢分 别以二氧化碳及水蒸汽形态逸去，而氮转为铵盐。此 过程需时较长，可达数小时。
② 加碱，并将氨自碱液中蒸至标准酸液中，测定中和氨 所消耗的酸量，计算出样品中含氮量，再乘以6．25 （经验平均值），则得蛋白质含量。
.
7
反应：以甘氨酸为例
测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶 剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度 值A280。蛋白质浓度可控制在0.1～ 1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准 石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此 可立即计算出蛋白质的大致浓度。
（二）Folin－酚试剂法（Lowry法）
实验原理:蛋白质中的肽键在碱性条件下与Cu2+反 应，生产紫红色蛋白质-Cu2+复合物，这一复合物 中的氨基酸残基（主要是酪氨酸、色氨酸、半胱 氨酸）还原Folin—酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸 盐，产生钼兰和钨兰复合物的深兰色（745750nm），颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蛋白质和酶的分离与纯化蛋白质和酶的分离纯化及鉴定蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。
从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。
要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。
蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。
要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。
目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。
一、质分离纯化的一般原则1. 原料的选择原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。
蛋白分布：体液、组织、细胞定位2. 破碎方法：(1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。
如：捣碎法、研磨、匀桨法(2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。
如：反复冻融、渗透压、超声破碎(3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法.如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween） (4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法4. 先粗后细，分级分离粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。
如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。
精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。
5. 避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等）二、常用的蛋白质的分离纯化技术可以根据各种蛋白质的结构、理化性质不同设计分离方法。
（一）根据蛋白质的溶解度不同进行分离1. 蛋白质盐析蛋白质属于生物大分子之一，分子量从1万至100万之巨，其分子的直径可达1-100nm，为胶粒范围之内。
蛋白质的表面电荷和水化膜是其主要的稳定性因素。
大多数蛋白质都溶于水，在低盐条件下，蛋白的溶解度随着盐浓度的升高而增加，这称为蛋白质的盐溶现象，而盐浓度达到一定以后，蛋白质水化膜被破坏，电荷被中和，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的升高而降低，并且析出，这就是盐析现象。
由于各种蛋白质分子的颗粒大小和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。
调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。
常用的中性盐：硫酸铵、醋酸钠、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
其中最常用的是硫酸铵，它的优点是温度系数小，溶解度高（25℃时的饱和度为4.1mol/L，即767g/L；0℃时的饱和度为3.9mol/L，即676g/L）；在这一溶解度范围内，许多蛋白都可以盐析出来；另外，硫酸铵不容易引起蛋白质变性；不同浓度硫酸铵pH在4.5-5.5之间，可以结合等电点进行分离纯化，沉淀效果更好。
影响盐析的因素：①温度：②pH：③蛋白质浓度：盐析的缺点是蛋白质沉淀后要除盐，否则会影响后续的电泳或离子交换等相关实验。
2. 等电点沉淀法蛋白质在等电点时，也就是静电荷为零时，蛋白质颗粒之间的静电排斥力减小，蛋白的溶解度下降，容易发生沉淀，因此，可以调节溶液的pH，使其达到目的蛋白的等电点，使之沉淀而分离。
但是，此方法很少单独应用，一般与盐析法或后述的有机溶剂沉淀法联合应用效果更好。
3. 有机溶剂沉淀法有机溶剂可使溶液的介电常数降低，蛋白之间的静电引力增大，互相吸引而易于集聚；也可使水化膜破坏，蛋白的溶解度降低。
优点：易于进一步的分离，不用脱盐缺点：易引起蛋白的变性，所以沉淀后要尽快的分离常用的有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。
（二）根据蛋白质分子大小进行分离1. 透析与超滤透析就是利用透析膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤是利用压力和离心力，促使大小不等的分子通过滤过膜，两者都是根据化合物的分子量进行分离的一种方法，可选择不同孔径的滤膜截留不同分子量的蛋白质。
2.凝胶过滤法是以各种多孔凝胶为固定相，对不同分子量的组分进行分离的一种层析方法。
也叫凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。
常用的凝胶材料:①葡聚糖凝胶（Sephadex)：是由葡聚糖交联而成，具有良好的化学稳定性，耐高温（>120℃）, 型号多，可用于各种物质的分离和纯化。
②琼脂糖凝胶（Sepharose)：是一种天然多孔凝胶，孔径大，适用于大分子量分子的分离。
③聚丙烯酰胺凝胶：是人工合成的凝胶，交联度不同，孔径不同，可用于各种蛋白的分离。
缺点是强酸会使凝胶的酰胺键破坏。
（三）根据蛋白质带电性质进行分离1. 电泳法各种蛋白质在同一pH条件下，因为分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而彼此分离。
2. 离子交换层析法是利用离子交换剂上可解离基团对各种离子的的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。
离子交换剂：是含有可解离的阳离子或阴离子基团不溶性高分子化合物，这些基团能与溶液中的其它阳离子或阴离子进行可逆的交换。
按活性基团性质不同：阳离子交换剂阴离子交换剂按母体物质种类不同：离子交换树脂：小分子量蛋白质分离离子交换凝胶：各种分子量蛋白质分离离子交换纤维素：各种分子量蛋白质分离①阳离子交换阳离子交换剂中含有酸性基团，能解离出氢离子，与样品溶液中的阳离子进行交换。
强酸型阳离子交换剂：磺酸（R-SO3-H）H+H+H+基架活性基团弱酸型阳离子交换剂：磷酸（R-HPO 3-H ） 羧酸（R-COO-H ） 酚羟基（R-O-H ）② 阴离子交换 阴离子交换剂中含有的碱性基团，能释放出阴离子，与样品溶液中的阴离子进行交换。
强碱型阴离子交换剂：季胺 [R-N +(CH 3)3-OH -] 弱碱型阴离子交换剂：伯胺 (R-N +HH 2-OH -) 仲胺 (R-N +HCH 3H-OH -) 叔胺 [R-N + (CH 3)2H-OH -]（四）根据蛋白质特异性进行分离-亲和层析亲和层析是利用生物分子与配体之间具有的专一而又可逆的亲和力，是生物分子分离纯化的技术。
固定相：上述提到的凝胶或树脂结合上配体。
优点：选择性好，纯化步骤简单，一次就可达到很高的纯化倍数。
缺点：价格昂贵，处理量少，不适合大规模应用，洗脱剂要求高，无通用性。
总之，根据拟分离的蛋白质的理化性质、防止变性以及样品情况和实验条件选择最佳方法。
有时往往不止用一种方法进行分离纯化，而是选择几种适当的方法进行分离，力求达到纯化和高产的目的。
R-SO -3-H ++Na +R-SO -3-Na ++H+OH -OH -OH -基架活性基团R-N +(CH 3)3-OH -+Cl -R-N +33-+OH -实验一 -球蛋白的分离纯化一、实验目的掌握蛋白质分离纯化的基本方法和步骤。
二、原理γ-球蛋白是一组结构相似但又有差异的蛋白质，统称为免疫球蛋白（immunoglobin, Ig）。
按其结构和免疫化学性质的差异分为五类。
分别为IgG，IgA，IgM，IgD，IgE，其中IgG占70%。
血清中有70余种蛋白质，本实验的目的是要从70余种血清蛋白中分离出γ-球蛋白。
1. 粗分，采用饱和硫酸铵盐析法，如果蛋白质溶液体积大，要求达到的硫酸铵饱和度在50%以上时，可在蛋白质混合溶液中直接加入硫酸铵试剂如果蛋白质溶液体积小，要求达到的硫酸铵饱和度在50%以下时，可采用饱和硫酸铵溶液法，饱和硫酸铵溶液的加入量按下式计算：V=V0（C2-C1）/(100-C2) 或者是V=V0（C2-C1）/(1-C2)V: 应加入饱和硫酸铵溶液的体积；V0：蛋白质溶液的原始体积；C1：原溶液的硫酸铵饱和度；C2：要达到的硫酸铵饱和度。
硫酸铵盐析法可使蛋白质纯度提高5倍，而且可以除去核酸等杂质。
2. 除盐：采用透析法使硫酸铵除去。
3. 精制：采用阴离子交换层析法利用阴离子交换纤维素层析其优点是：具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，吸附量大；具有亲水性，用温和的条件可以洗脱，不易引起蛋白质的变性或酶的失活；具有多孔性，表面积大，交换容量大，回收率高，可用于分离和制备。
4. 纯度鉴定：采用醋酸纤维素薄膜电泳。
三、试剂和器材1.试剂①正常血清（人、兔、狗）②饱和硫酸铵溶液③0.0175mol/L磷酸缓冲液1.0ml（pH6.3）④ DEAE-纤维素⑤纳氏试剂：碘化汞和碘化钾的碱性溶液，与氨氮反应生成淡红棕色的化合物（410-425nm)。
⑥20%磺柳酸试剂2. 器材①层析柱及支架②白色和黑色比色板③透析袋及细线④烧杯2个、试管20支⑤吸管1个四、操作步骤1.取少许血清作为A样。
2.盐析：取2ml血清加2ml生理盐水于离心管中，混匀后缓慢滴加饱和硫酸铵溶液4ml，边加边混，室温放置10min，3000 rpm，离心10min，小心除去上清，沉淀加0.0175mol/L磷酸缓冲液1.0ml（pH6.3）复溶。
3.透析除盐：用细线扎住透析袋一端，将溶解的 -球蛋白溶液倒入透析袋内，用线扎紧透析袋另一端，放入一大烧杯中，加入蒸馏水进行透析，每隔10min用纳氏试剂在白板上检测烧杯中的NH4+，并更换蒸馏水直至检测不到NH4+为止，留取透析袋内液体2滴，作为B样。
4.DEAE-纤维素离子交换层析：①装柱：取层析柱加入蒸馏水，观察水流是否通畅，然后将层析柱垂直固定到支架上，关闭下端出口，将处理再生后的DEAE-纤维素悬液搅拌均匀后缓慢倒入层析柱，使柱床高度达到10-15cm。
②平衡：打开柱的下端出口，用3个柱床体积的0.0175mol/L磷酸缓冲液（pH6.3）平衡后关闭柱的下端出口。
③上样：将透析脱盐后的蛋白质溶液缓慢加到DEAE-纤维素柱床上，开下端出口，使样品进入柱床。
④洗脱：用0.0175mol/L磷酸缓冲液（pH6.3）洗脱蛋白，并且立即收集洗脱液，流速为10滴/min，每2min收集1管，按顺序排列。
⑤洗脱液中蛋白质的检测：取黑色比色板或干净的试管一个，按洗脱管顺序分别取1滴于其中，然后加入20%磺柳酸试剂1滴，出现白色浑浊或沉淀即为蛋白质析出，记录并估计各管的蛋白质浓度，取浓度最高的一管作为C样。
五、实验注意事项1.硫酸铵缓慢滴加，2.离心前试管要平衡，对称放入离心机内，开机和关机要缓慢加速和减速。
3.透析时两端要扎紧，不要扎段，10min左右换水一次，否则容易导致透析袋内样品稀释。
4.装柱时不能分层，不能进入气泡，转好后用上样缓冲液平衡。
5.样品进入柱床后再加洗脱缓冲液，否则会导致样品稀释。
6.洗脱时流速不要太快，否则也会导致洗脱液中的蛋白质稀释而检测不出。
实验二 -球蛋白的鉴定一、实验目的掌握蛋白质的电泳鉴定方法和步骤。
二、原理电泳是在外界电场的作用下，带电物质向所带电荷相反电极方向的移动，由于蛋白质所带电荷不同，迁移速度不同而彼此分离。