胰蛋白酶的分离纯化PPT课件
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亲和层析法纯化胰蛋白酶培训课件
1鸡卵粘蛋白的基本性质
1.1鸡卵粘蛋白的组成
分子量: 28000Da
分子组成:
四个分子量相近的亚基组成糖蛋白
糖基部分:
D-甘露糖, D-半乳糖, 葡萄糖胺, 唾液酸
亲和层析法纯化胰蛋白酶
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1.2化学稳定性
耐热: 在80℃条件下,理化性质不发生改变
耐有机溶剂: 在50%的丙酮溶液中,能保持良好的溶解度
消光系数法测亲和定层析鸡法纯卵化胰粘蛋白蛋酶 白含量
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生物活性测定 胰蛋白酶比活性测定 鸡卵粘蛋白抑制活性测定
亲和介质合成技术 载体-Sepharose 4B的前处理 载体 -Sepharose 4B的活化 活化载体-Sepharose 4B的偶联
亲和层析法பைடு நூலகம்化胰蛋白酶
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第二部分 实验方法
实验一 鸡卵粘蛋白的分离纯化
2.2离心： 转移50毫升离心杯中,于3000rpm 离心15min。
2.3过滤： 倾出上清液，滤纸过滤，滤去上浮脂类物质和不溶物
2.4调pH值： 用1mol/L HCl 将溶亲液和层精析法确纯化调胰蛋至白酶pH3.5。量取体积。10
2.5丙酮沉淀：缓缓加入三倍体积预冷的丙酮，搅匀，用 塑料薄膜封严，放置冰箱内静止4小时。
耐沉淀剂: 在10%的TCA的溶液中不发生沉淀.
1.3等电点性质
等电点: pI在3.9-4.5之间
溶液中的状态: 在pH3.0的溶液中稳定, 在pH8.0的溶液中
容易分解
鸡卵粘蛋白在10%的TCA不同pH值的溶液中的溶解状态
见表1。
亲和层析法纯化胰蛋白酶
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表1，鸡卵粘蛋白在10%TCA溶液中的溶解度
亲和层析法纯化胰蛋白酶
酶的分离与纯化PPT课件
2）非机械法：酶法、化学法、物理法 • 化学渗透法（chemical permeation）：改变细胞壁或细胞膜的通
透性；TritonX-100：结合、溶解磷脂，破坏膜脂双层；EDTA：对G-菌 外膜有破坏作用；有机溶剂：分解细胞壁中的脂类；变性剂：脲、盐 酸胍与水中氢键作用。优点：选择性，易于固液分离。缺点：通用性 差，效率低，毒性
(NH4)2SO4饱和度表
• 温度是影响蛋白质溶解度的重要因素。在无盐或稀盐溶液 中，温度低，蛋白质溶解度也低；在高盐溶液中，蛋白质 的溶解度随温度的升高反而减小。许多蛋白质在高离子强 度溶液中，25℃时的溶解度比0℃时明显减小。这主要是 因为蛋白质分子在水化时要吸热，失水时则放热，温度升 高有利于蛋白质失水沉淀。一般盐析时不要降低温度，除 非这种酶对温度比较敏感。
蛋白质的盐析
盐析应用最广泛的是硫酸铵
• 优点 1）溶解度大 25℃时硫酸铵的溶解度可达4.1mol/L(541g/L)以上。大 约每升水可溶解767g之多。在这一高溶解度范围内，许多蛋白质和酶 都可以被盐析沉淀出来。 2）温度系数小 硫酸铵的溶解度受温度影响不大。例如 0℃时，硫酸 铵的溶解度仍可达到3.9mol/L(515g/L)。大约每升水可溶解676g。对 于需要在低温条件下进行酶的纯化来说，应用硫酸铵是有利的。 3）硫酸铵不易引起蛋白质变性，对于很多种酶还有保护作用，且价格 低廉，容易获得。 • 缺点 铵离子干扰双缩脲反应，为蛋白质的定性分析造成一定困难。
（五）沉淀分离
1、盐析法 盐溶(salting in) 在低浓度盐溶液中，酶的溶解度增加。 盐析(salting out) 盐浓度升高到一定程度，蛋白质和酶浓 度随盐浓度的升高而不同程度下降并沉淀析出。 （1）盐析法的机制 （2）盐析用中性盐的选择 常用的中性盐：MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4和NaH2PO4 （3）(NH4)2SO4饱和度表示法 （4）影响盐析的因素 1）蛋白质浓度 2）pH和温度的影响
1-亲和分离纯化胰酶课件
6-2、测定酶活力试剂与配制
6-2-1、试剂
（1）、Nα-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺盐酸盐 (BAPNA)
（2）、三乙醇胺
（3）、氯 化 钙
（4）、硫 （5）、盐 酸 酸
6-2-2、 试剂的配制
(1）、底物（B）的配制 [ mg/ml ] ： （2）、缓冲溶液（S）[TEA-2]： （3）、0.5 mol/L H2SO4溶液的配制： （4）、样品溶液的配制： 直接按照测定步骤，分别吸取自动部分收集器收集的各管样 品原液。
（1）、表1：酶活力的测定方法与结果表
试剂 / 管 号 缓 冲 液（ml）
0
1
2
3
4
5
6
2.0 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8
样 品 溶 液 (ml)
1.4 1.2 1
A 405 nm
0.8 0.6 0.4 0.2 0 -0.2 0 2 4 6 8 管 号
胰蛋白酶分离效果图 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 -0.2 0 2 4 6 8
管 号
吸光度[280nm]
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 10 -0.2
蛋白质洗脱峰
胰蛋白酶活力峰
亲和层析
分离纯化胰蛋白酶
一
实验原理
我们都知道酶和它的底物或竞争性抑制剂，特异性抗原和抗体， 激素及其受体等具有专一性很强的亲和能力。亲和层析是利用生物分 子间所特有的专一亲和力而设计的一种层析技术。 亲和层析就是在一种载体上，用化学偶联的方法，接上特定的配 基作为固相支持物，然后装柱，并在适当的条件下当样品通过柱子时， 其中与配基具有特异性亲和力的组分被吸附在柱上，然后通过改变洗 脱条件，使得该组分被洗脱分离开来。 亲和层析是具有快速、高效等特点，对于那些分离流程长、难度 大、浓度低、杂质多、采用常规方法难以进行分离的生物分子来说， 亲和层析显示出其独特的优越性。 通过亲和层析，被分离物质的纯度有时一次即可高达数百倍，活 性回收率纯度也非常之高。亲和层析先决条件是，不同的分离对象需 要选择接有专一性配基的固相化亲和载体，有关载体的活化、接臂、 偶联，详见相关一书。
酶的分离纯化 (2)优秀课件
酶的分离纯化 (2)优秀课件
1
Contents of chapter 4
Go 第一节 酶的提取与分离纯化技术路线 Go 第二节 细胞破碎 Go 第三节 酶的提取 Go 第四节 酶的分离方法 Go 第五节 酶的浓缩、干燥与结晶 Go 第六节 纯化方案的设计与评价
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第一节 酶的提取、分离纯化技术路线
革兰氏阳性芽孢菌 ++ + ++ +
酵母
++++
革兰氏阳性球菌 + - + +
菌丝
- ++ - ++
孢子
----
8
有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的 透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。为了防止酶 的变形失活，操作过程应在低温的条件下进行。
表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使 细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。表面活性剂有 离子型和非离子型之分，离子型表面活性剂对细胞破碎效果 较好，但是会破坏酶的空间结构，从而影响酶的催化活性。 所以在酶的提取方面，一般采用非离子型的表面活性剂。
2、Ph
在等电点的条件下，酶分子的溶解度最小。不同的酶分子有 其各自不同的等电点。为了提高酶的溶解度，提取时应该避 开酶的等电点，以提高酶的溶解度。但是溶解的PH不宜过 高或过低，以免引起酶的变形失活。
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3、提取液体积
增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。一般总 用量为原料体积的3-5倍。 在酶的提取过程中，含酶原料的颗粒体积越小则扩 散面积越大，有利于提高扩散速度；适当的搅拌 可以使提取液中酶分子迅速离开原料颗粒表面， 从而增大两相界面的浓度差，有利于提高扩散速 度；适当延长提取时间，可以使更多的酶溶解出 来。
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Contents of chapter 4
Go 第一节 酶的提取与分离纯化技术路线 Go 第二节 细胞破碎 Go 第三节 酶的提取 Go 第四节 酶的分离方法 Go 第五节 酶的浓缩、干燥与结晶 Go 第六节 纯化方案的设计与评价
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第一节 酶的提取、分离纯化技术路线
革兰氏阳性芽孢菌 ++ + ++ +
酵母
++++
革兰氏阳性球菌 + - + +
菌丝
- ++ - ++
孢子
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有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的 透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。为了防止酶 的变形失活，操作过程应在低温的条件下进行。
表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使 细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。表面活性剂有 离子型和非离子型之分，离子型表面活性剂对细胞破碎效果 较好，但是会破坏酶的空间结构，从而影响酶的催化活性。 所以在酶的提取方面，一般采用非离子型的表面活性剂。
2、Ph
在等电点的条件下，酶分子的溶解度最小。不同的酶分子有 其各自不同的等电点。为了提高酶的溶解度，提取时应该避 开酶的等电点，以提高酶的溶解度。但是溶解的PH不宜过 高或过低，以免引起酶的变形失活。
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3、提取液体积
增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。一般总 用量为原料体积的3-5倍。 在酶的提取过程中，含酶原料的颗粒体积越小则扩 散面积越大，有利于提高扩散速度；适当的搅拌 可以使提取液中酶分子迅速离开原料颗粒表面， 从而增大两相界面的浓度差，有利于提高扩散速 度；适当延长提取时间，可以使更多的酶溶解出 来。
《酶的分离纯化》PPT课件
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精品医学
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择 适当的溶剂。
一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中（水、稀 酸、稀碱、稀盐溶液等） ，非极性物质易溶于非 极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中， 碱性物质易溶于酸性溶剂中
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精品医学
提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短 扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的 扩散速度，从而增大提取效果。
捣碎法 研磨法 匀浆法
温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法
有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween
自溶法 外加酶制剂法
精品医学
机械法（注意预冷）：
捣碎法： 10000rpm
研磨法： 匀浆法：研杆和管壁
间只有几百微米
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
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精品医学
物理法：
反复冻融法：时间长，需加蛋 白酶抑制剂（PMSF、EDTA 等）
超声波处理法：处理时间尽量 短，避免局部过热使得酶失活
渗透压法： 冷热交替法：
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JY92-II D超声波 细胞粉碎机
高压细胞破碎机
精品医学
动物
细菌
植物
∣研磨 ∣超声波
∣纤维素酶
∣匀浆 ∣溶菌酶
∣
↓捣碎机 ↓化学溶剂 (甲苯) ↓
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精品医学
细胞破碎方法及其原理
机械破碎
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
物理破碎 化学破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
酶促破碎
胰蛋白酶的分离纯化PPT课件
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5
胰蛋白酶分离纯化路线
胰蛋白酶纯化
采用离子交换层析 原理：蛋白质在其等电点以下时带正电荷，可以被阳离子交换树脂所 吸附；而蛋白质在等电点以上，带负电荷，可以被阴离子交换树脂所 吸附。 因为胰蛋白酶等电点为10.1且在酸性条件下稳定，所以功能基团考虑 使用阳离子 此外，遵循大分子物质分离一般采用弱性，因此使用弱酸性阳离子， 骨架材料选择凝胶，因为其孔度大，亲水性好。 离子交换剂的离子形式考虑用盐型。
• 牛胰蛋白酶原有229个氨基酸组成，含6对二硫键，其氨基酸排列顺序和晶体结构
已被阐明。在肠激酶活自身催化下，酶原的N末端赖氨酸与异亮氨酸残基之间的肽 键被水解，释放出来缬-天-天-天-天-赖6肽，生成有活性的胰蛋白酶。牛的胰蛋 白酶氨基酸残基223个，分子量23800。
• 猪胰蛋白酶的化学结构与牛胰蛋白酶十分相似，在氨基酸残基排列顺序中，只有
41个氨基酸残基不同，但分子构型有很大区别。沉降系数S20W为2.77S pI=10.8， 热稳定性较牛胰蛋白酶稳定，Ca2+对酶的保护作用不及牛羊的明显，无螯合Ca2+ 的中心部位。有6对二硫键，断裂1~2个键，均不至于破坏酶分子的完整结构而保 护了酶的活性。酶的活力分别相当于牛的72%及羊的61%。
• 羊胰蛋白酶与牛、猪的相似，但其活力略高于牛和猪的。
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胰蛋白酶的功效
为蛋白质水解酶，能选择地水解蛋白质中由赖 氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，能消化溶解变 性蛋质，对未变性的蛋白质无作用，因此，能使脓、 痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速 创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作 用。
临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创 伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿 等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒 蛇咬伤。还常用于动物细胞培养前对组织的处理。
《酶的分离和纯化》PPT课件
缓冲液 （e）硫铵溶液密度较高（1.24），故需较大离心力
此步可除去75%以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩
医学PPT
6
透析与浓缩
1）透析袋处理：
透析袋 0.5M EDTA煮半小时 蒸馏水煮半小时 反复八次 带橡皮手套用镊子拿取
2）透析除盐：200倍于被透析物；4小时换一次透 析液；监测电导值
a）关键：配体；配体与支持物的连接方法；吸附、洗脱条件 b）支持物的选择：非特异性吸附作用低；液体流动性好；较宽
的pH、离子强度；丰富的化学基团；有效的多孔性 常用琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球 c）配体的选择：有亲和力但不易过大 d）配体与支持物的连接：载体结合法；物理吸附法；交联法； 包埋法（先活化支持物上的功能基团再将配体连上去） e） 吸附剂的衍生物：支持物+空间臂 f） 层析条件的选择：蛋白质+配体 → 蛋白质-配体复合物 起初配体浓度恒定，随蛋白浓度增加平衡右移（逐渐保留特性）， 故亲和力较低也能成功的亲和。 g）洗脱：更高亲和力的物质置换；剧烈改变环境条件
医学PPT
10
纸层
医学PPT
11
薄层
医学PPT
12
3）离子交换层析（ion exchange chromatography） ： 交换剂上带电荷，可根据样品的电荷予以分离
a）阳离子交换层析 b）阴离子交换层析
c）离子交换剂的类型：离子交换树脂、离子交换纤 维素、离子交换凝胶
d）实验室常用的离子交换剂：阴离子交换剂DEAECellulose 、DEAE-Sephadex；阳离子交换剂 CMCellulose、CM- Sephadex
a）凝胶预处理：凝胶→浸入洗脱液→轻轻搅拌
↓
加热90-100℃（水浴加热）
此步可除去75%以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩
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透析与浓缩
1）透析袋处理：
透析袋 0.5M EDTA煮半小时 蒸馏水煮半小时 反复八次 带橡皮手套用镊子拿取
2）透析除盐：200倍于被透析物；4小时换一次透 析液；监测电导值
a）关键：配体；配体与支持物的连接方法；吸附、洗脱条件 b）支持物的选择：非特异性吸附作用低；液体流动性好；较宽
的pH、离子强度；丰富的化学基团；有效的多孔性 常用琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球 c）配体的选择：有亲和力但不易过大 d）配体与支持物的连接：载体结合法；物理吸附法；交联法； 包埋法（先活化支持物上的功能基团再将配体连上去） e） 吸附剂的衍生物：支持物+空间臂 f） 层析条件的选择：蛋白质+配体 → 蛋白质-配体复合物 起初配体浓度恒定，随蛋白浓度增加平衡右移（逐渐保留特性）， 故亲和力较低也能成功的亲和。 g）洗脱：更高亲和力的物质置换；剧烈改变环境条件
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3）离子交换层析（ion exchange chromatography） ： 交换剂上带电荷，可根据样品的电荷予以分离
a）阳离子交换层析 b）阴离子交换层析
c）离子交换剂的类型：离子交换树脂、离子交换纤 维素、离子交换凝胶
d）实验室常用的离子交换剂：阴离子交换剂DEAECellulose 、DEAE-Sephadex；阳离子交换剂 CMCellulose、CM- Sephadex
a）凝胶预处理：凝胶→浸入洗脱液→轻轻搅拌
↓
加热90-100℃（水浴加热）
胰凝乳蛋白酶的制备(生物分离纯化技术课件)
胰凝乳蛋白酶的制备
生产实训
2、胰凝乳蛋白酶分离：取提取液10mL，加固体(NH4)2SO41.14g达 0.2饱和度，放置10min，离心(3000r/min)10min。弃去沉淀，保留上清 液。在上清液中加入固体(NH4)2SO41.323g达0.5饱和度，放置10min离心 (3000r/min)10min。弃去上清液，保留沉淀。将沉淀溶解于3倍体积的水 中，装入透析袋中，用pH为7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液透析，直至 1%BaCl2检查无白色BaSO4沉淀产生，然后离心(3000r/min)5min。弃去 沉淀(变性的酶蛋白)，保留上清液。在上清液中加(NH4)2SO4(0.39g/mL) 达0.6饱和度，放置10min，离心(3000r/min)10min。弃去上清液，保留 沉淀（即为胰凝乳蛋白酶）。
胰凝乳蛋白酶的制备 实训试剂与设备 二、实验器材 高速组织捣碎机，解剖刀，镊子，剪刀，烧杯（50mL、100mL），离 心机，离心管，漏斗，纱布，棉线，吸管（10mL、5mL、2mL、1mL、 0.5mL），玻璃棒，滴管，透析袋，台秤，分析天平，离心机。
胰二、生产操作
胰凝乳蛋白酶的制备
实训目标 1.掌握盐析法分离酶的基本原理和操作； 2.掌握结晶的基本方法和操作； 3.学习胰凝乳蛋白酶制备的方法。
胰凝乳蛋白酶的制备
实训原理 蛋白质分子表面带有一定的电荷，因同种电荷相互排斥，使蛋白质分 子彼此分离；同时，蛋白质分子表面分布着各种亲水基团，这些基团与水 分子相互作用形成水化膜，增加蛋白质水溶液的稳定性。如果在蛋白质溶 液中加入大量中性盐，蛋白质分子表面的电荷被大量中和，水化膜被破坏， 于是蛋白质分子相互聚集而沉淀析出，这种现象称为盐析。由于不同的蛋 白质分子表面所带的电荷多少不同，分布情况也不一样，因此不同的蛋白 质盐析所需的盐浓度也各异。盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混 合液中的各个成分分步析出，达到粗分离蛋白质的目的。
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胰蛋白酶分离纯化路线
离子交换层析法纯化胰蛋白酶
恒流泵
离子交换柱
部分收集器
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离子交换流程简图
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胰蛋白酶分离纯化路线
工艺流Байду номын сангаас：粗提液的获取
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胰蛋白酶分离纯化路线
工艺流程：纯化
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• 牛胰蛋白酶原有229个氨基酸组成，含6对二硫键，其氨基酸排列顺序和晶体结构
已被阐明。在肠激酶活自身催化下，酶原的N末端赖氨酸与异亮氨酸残基之间的肽 键被水解，释放出来缬-天-天-天-天-赖6肽，生成有活性的胰蛋白酶。牛的胰蛋 白酶氨基酸残基223个，分子量23800。
• 猪胰蛋白酶的化学结构与牛胰蛋白酶十分相似，在氨基酸残基排列顺序中，只有
• 羊胰蛋白酶与牛、猪的相似，但其活力略高于牛和猪的。
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胰蛋白酶的功效
为蛋白质水解酶，能选择地水解蛋白质中由赖 氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，能消化溶解变 性蛋质，对未变性的蛋白质无作用，因此，能使脓、 痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速 创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作 用。
41个氨基酸残基不同，但分子构型有很大区别。沉降系数S20W为2.77S pI=10.8， 热稳定性较牛胰蛋白酶稳定，Ca2+对酶的保护作用不及牛羊的明显，无螯合Ca2+ 的中心部位。有6对二硫键，断裂1~2个键，均不至于破坏酶分子的完整结构而保 护了酶的活性。酶的活力分别相当于牛的72%及羊的61%。
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胰蛋白酶分离纯化路线
胰蛋白酶纯化
采用离子交换层析 原理：蛋白质在其等电点以下时带正电荷，可以被阳离子交换树脂所 吸附；而蛋白质在等电点以上，带负电荷，可以被阴离子交换树脂所 吸附。 因为胰蛋白酶等电点为10.1且在酸性条件下稳定，所以功能基团考虑 使用阳离子 此外，遵循大分子物质分离一般采用弱性，因此使用弱酸性阳离子， 骨架材料选择凝胶，因为其孔度大，亲水性好。 离子交换剂的离子形式考虑用盐型。
临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创 伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿 等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒 蛇咬伤。还常用于动物细胞培养前对组织的处理。
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胰蛋白酶分离纯化路线
胰蛋白酶粗提液的获取
1.将胰脏绞碎成胰浆，在5~10℃存放24h以上，使胰酶自身活化。 2.3500r/min 下离心20min，取上清液用二层纱布过滤，然后根据等 电点沉淀的原理用稀硫酸将提取液的pH值调至酸性（pH3.0左右）， 使大量的酸性蛋白沉淀出来。 3.采用透析袋透析，然后用硫酸铵盐析法将胰蛋白酶从粗提液中沉 淀出来，使其得到浓缩，并除去部分杂质（透析袋透析原理：由于 膜两侧的溶质浓度不同，在浓度差的作用下，高分子溶液中的小分 子溶质透向透析液一侧，同时透析液中的缓冲液渗入蛋白溶液一侧， 经过透析液反复换液后，即可达到脱盐和置换缓冲液的目的。）
胰蛋白酶的分离纯化
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主要内容
• 胰蛋白酶的结构、理化性质
• 胰蛋白酶功效
• 分离纯化路线
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胰蛋白酶结构及理化性质
• 胰蛋白酶是从牛、猪、羊的胰脏提取，纯化获得的结晶，再制成的冻干制剂。易
溶于水，不溶于三氯甲烷、乙醇、乙醚等有机溶剂。在pH1.8时，短时间煮沸几乎 不失活；在碱溶液中加热则变性沉淀，Ca2+有保护和激活作用，胰蛋白酶的等电 点为pH10.1。