核酸的分离提取及定量.
核酸的提取与鉴定实验报告
核酸的提取与鉴定实验报告一、实验目的1、掌握从生物样本中提取核酸（DNA 或 RNA）的基本原理和方法。
2、学习使用各种试剂和仪器进行核酸提取的操作步骤。
3、了解核酸鉴定的常用方法及其原理。
4、培养实验操作技能和科学研究的严谨态度。
二、实验原理核酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），是生物体遗传信息的携带者。
核酸提取的基本原理是利用细胞裂解液将细胞破碎，使核酸释放出来，然后通过一系列的物理和化学方法将核酸与其他细胞成分分离，最后得到纯度较高的核酸样品。
DNA 提取常用的方法有酚氯仿抽提法、盐析法等。
酚氯仿抽提法是利用酚和氯仿的混合液去除蛋白质，然后通过乙醇沉淀得到 DNA。
盐析法是利用高浓度的盐使蛋白质变性沉淀，从而分离出 DNA。
RNA 提取常用的方法有异硫氰酸胍法、Trizol 法等。
Trizol 法是基于异硫氰酸胍和酚的作用，能够有效地裂解细胞并抑制 RNA 酶的活性，从而提取出完整的 RNA。
核酸鉴定的方法主要有紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法等。
紫外分光光度法通过测定核酸在 260nm 和 280nm 处的吸光度值（A260 和 A280）来评估核酸的纯度和浓度。
A260/A280 的比值在 18 20 之间表示 DNA 纯度较高，在 19 21 之间表示 RNA 纯度较高。
琼脂糖凝胶电泳法则是根据核酸分子在电场中的迁移率不同来分离和鉴定核酸，DNA 分子在琼脂糖凝胶中迁移距离与分子量大小成反比，RNA 通常会呈现出 28S、18S 和 5S 三条带。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的动物组织（如肝脏、肌肉等）或培养的细胞。
大肠杆菌菌液。
2、实验试剂细胞裂解液（含蛋白酶 K）。
酚氯仿混合液（酚：氯仿＝ 1:1）。
无水乙醇、75%乙醇。
3M 醋酸钠（pH 52）。
Trizol 试剂。
异丙醇。
RNA 酶抑制剂。
琼脂糖。
50×TAE 电泳缓冲液。
核酸染料（如 EB 或 GelRed）。
第十一章 核酸提取与鉴定
Trizol一步法提取总RNA：
附：Trizol法步骤
1）实验前取冰，4℃离心机预冷，DEPC处理水（高压灭菌 处理）配制的75%乙醇4℃预冷； 2）1ml Trizol匀浆好的样品； 3）加入0.2ml氯仿，颠倒混匀（15秒）——“慢”，氯仿使蛋
白变性
4）室温，静置3分钟； 5）离心机4℃、14000转/分，离心15分钟；静置1分钟（分
（2）体液标本
浆膜腔积液、脑脊液、尿液、关节积液等； 按水样标本方式离心，取沉淀用于核酸提取。
（二）提取用具预处理
1. DNA提取用具的处理
要求无菌；试剂、器材高压干燥等进行无DNase处理。
2. RNA提取用具的处理
要求无菌，防止二次污染。 RNA易被RNase水解，RNase无处不在且耐高温， 提取条件要求严格。
条件用-20℃、1小时，目的为了更好分层）
9）离心机4℃、14000转/分，离心10分钟 10）弃上液（移液器调至1ml，分两步快速轻轻吸弃上清：第1步，
沿液面吸弃约0.9ml上清；第2步，沿液面吸弃其余上清;注意吸头不要接 触到沉淀斑区）
11)沿试管内壁轻轻加入1ml 4℃预冷的75%乙醇,注意切勿 冲击到沉淀斑区 12）离心机4℃、10000转/分，离心5分钟 13）弃上液（用枪把里面的乙醇吸去，留极少许即可，以防干燥过 程中把RNA烤干），60℃恒温箱干燥5分钟（注意：打开管盖；或用
• 所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA 提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药 匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。
• 严格来说，所有溶液均应用0.1％DEPC于37℃ 处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高 压灭菌15分钟，去除残余DEPC。
核酸提取原理及方法
核酸提取原理及方法核酸提取是分子生物学实验中的重要步骤，它是从细胞或组织中分离出核酸并净化的过程。
核酸提取的成功与否直接影响到后续的实验结果，因此掌握核酸提取的原理和方法对于科研工作者来说至关重要。
一、核酸提取原理。
核酸提取的原理主要包括细胞破碎、核酸溶解和净化三个步骤。
首先，细胞膜和细胞壁需要被破坏，以释放细胞内的核酸。
其次，核酸需要被有效地溶解，使其能够被提取出来。
最后，通过净化步骤去除蛋白质、多糖和其他杂质，从而得到纯净的核酸样品。
二、核酸提取方法。
1. 酚氯仿法。
酚氯仿法是最常用的核酸提取方法之一。
其原理是利用酚和氯仿两种有机溶剂与水相不相溶的特性，将细胞裂解液中的蛋白质等杂质分离出去，从而得到纯净的核酸。
这种方法操作简单，适用于提取大量样品。
2. 硅胶柱法。
硅胶柱法利用硅胶膜对核酸的亲和力进行提取和分离。
通过将样品加入硅胶柱后，核酸能够与硅胶膜结合，而其他杂质则被洗脱掉。
这种方法提取的核酸纯度高，适用于对纯度要求较高的实验。
3. 磁珠法。
磁珠法是近年来发展起来的一种核酸提取新方法。
通过在磁珠表面修饰亲核酸的功能基团，使得核酸能够与磁珠结合。
利用磁场的作用，可以将核酸与磁珠分离出来，从而实现核酸的提取和纯化。
这种方法操作简便，且适用于高通量提取。
三、注意事项。
在进行核酸提取时，需要注意以下几点：1. 样品的质量和保存对提取结果有重要影响，因此在提取前需要确保样品的完整性和纯度；2. 根据不同的实验目的和样品特点选择合适的提取方法，以确保提取效果；3. 在操作过程中要注意无菌操作，避免外源性核酸的污染；4. 核酸提取后，应根据实验需求储存或立即进行下一步实验。
总结，核酸提取是分子生物学实验中的重要步骤，掌握核酸提取的原理和方法对于科研工作者来说至关重要。
不同的提取方法有着各自的特点和适用范围，选择合适的提取方法能够提高实验效率和结果的准确性。
在实验操作中要严格按照操作规程进行，确保提取的核酸样品质量和纯度。
核酸2
2. 碱水解：
RNA可被碱水解为核苷酸。
DNA对碱具有一定抗性。
RNA的磷酸酯键对碱敏感 室温，0.3-1mol/L KOH，18-24h，可将RNA完
全水解，得到2’-ysis of RNA under alkaline conditions.
3. 酶水解：
定义：
高温、酸、碱及某些变性剂（如尿素等）能破
坏核酸中的氢键，使有规律的双螺旋结构变成单
链的、无规律的线团，此作用称DNA的变性。
•变性不涉及共价键的断裂。 •变性后，核酸紫外吸收值增加，粘度、比旋下降，生物
活性部分或全部丧失。
Stages in the reversible denaturation and renaturation of DNA.
• 核酸酶（nuclease）（特异性地水解核酸）
根据作用方式
核酸内切酶 核酸外切酶
核糖核酸酶 如：牛胰核糖核酸酶（ RNaseⅠ）
根据底物 核糖核酸酶T1
脱氧核糖核酸酶 如：牛胰脱氧核糖核酸酶（DNaseⅠ）
牛脾脱氧核糖核酸酶（DNase Ⅱ） 限制性核酸内切酶
An example of nuclease specificity: The specificity of RNA hydrolysis by bovine pancreatic Rnase （RNaseⅠ）.
（670nm比色）
（2）二苯胺法定性、定量鉴定DNA: 加热 D-2-脱氧核糖 + 酸 + 二苯胺 冰醋酸，少量浓硫酸
蓝色物质
（595nm比色）
（3）核酸的溴化乙锭（EB）染色： EB是一种荧光染料，可插入核酸相邻碱基对之间。在紫
外灯下，结合EB的核酸呈橙红色荧光。
核酸的纯化主要方法
分离纯化核酸时的注意事项：防止物理因素的降解：1.尽量简化操作步骤，缩短提取时间，以减少变性机会。
2.防止热变性，避免高温。
一般0-4℃。
3.防止机械剪切作用动作轻缓；搅拌温和；加山梨醇等增加渗透压。
防止化学因素的降解：1.避免强酸强碱作用，抽提液pH要保持在4-10之间。
2.保持提取液一定的离子强度，以调节核酸的溶解度和保持二级结构的稳定性。
防止核酸酶的降解防止DNA酶的降解：通常加入酶的抑制剂、蛋白质的变性剂和去垢剂来实现。
1.加入金属离子螯合剂抑制DNA酶2.去垢剂及某些RNase抑制剂，对DNA酶也有一定抑制作用。
防止RNA酶的降解：RNase很难抑制，且无处不在，汗液、唾液中均有。
很耐热，80℃处理15分钟不能灭活。
操作注意事项：1.带一次性手套、口罩；2.器皿试剂高压灭菌或用DEPC（乙二基焦炭酸）处理。
但含有Tris的试剂不宜用，因DEPC可与胺类迅速发生化学反应。
3.尽早除去蛋白质（含RNase）,并加抑制剂。
常用的抑制RNase活性的方法有：1.核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin,人胎盘中分离的一种蛋白）优点：效果好，不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。
使用注意事项：（1）置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DDT）的50%甘油中，-20℃储存。
（2）最大活性的发挥要求有巯基试剂。
（3）冻融数次后应弃之不用。
（4）在变性裂解哺乳动物细胞提取RNA的初始步骤中不宜使用，在其后RNA纯化步骤中应用。
用酚抽提可除去蛋白质抑制剂，故纯化过程中应补加。
2．糖核苷复合物（vanadyl-ribinucleaside complex）由氧钒（IV）离子和4种核糖中的任意一种形成的复合物，是一种过渡态类似物，它能与多种RNase结合并几乎能百分百地抑制RNA酶的活性。
缺点：强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译。
可用0.1%羟基喹啉的苯酚（用0.01mol/L E(pH>7.8)平衡）多次抽提除去。
核酸提取的原则和流程
核酸提取的原则和流程嘿，朋友！今天咱们来聊聊核酸提取这个超有趣又超级重要的事儿。
一、核酸提取的原则1. 保证核酸的完整性这就像是保护一件精美的艺术品一样。
你想啊，如果核酸断成了一节一节的，那它就像一幅被撕得七零八落的画，可就没法好好发挥作用了。
我们得小心翼翼地处理样本，避免那些物理因素，像过度的震荡、剪切力，就好比你不能拿着那幅画胡乱摇晃，不然画就毁了。
还有化学因素，不合适的酸碱度就像给这幅画泼上了腐蚀性的液体，会把核酸给弄坏的。
温度也很关键呢，太热或者太冷都可能让核酸像脆弱的花朵在恶劣天气里一样受到伤害。
2. 纯度要高这纯度啊，就像是你做饭时用的原料得特别干净一样。
如果核酸提取出来混着好多杂质，就像你煮的粥里混着沙子，那怎么能行呢？杂质会干扰后续对核酸的各种研究和检测。
比如说那些蛋白质杂质，就像不速之客，它们可能会和核酸“抢地盘”，影响核酸在实验中的表现。
还有其他的小分子杂质，就像捣乱的小虫子，在我们想要精准研究核酸的时候，它们在旁边搅和得一团糟。
3. 得率要高想象一下你在果园里摘果子，你肯定希望把树上的果子尽可能多地摘下来呀。
核酸提取的得率高，就意味着我们能从样本里拿到更多可用的核酸。
要是得率低，就像你去果园忙活了半天，只摘到寥寥几个果子，那多不划算啊。
这得率和我们最初选择的样本量、提取的方法以及操作的精细程度都有关系呢。
二、核酸提取的流程1. 样本采集这是核酸提取的第一步，就像盖房子打地基一样重要。
不同的样本来源可有不同的采集方法哦。
如果是采集血液样本，护士就像专业的探险家一样，用针管精准地抽取适量的血液。
那动作必须熟练又小心，要是抽多了，病人可能会不舒服，抽少了又可能不够用。
要是采集的是组织样本，医生就像是技艺精湛的工匠，用特殊的工具精准地切取需要的组织部分。
这时候啊，旁边的助手就会在旁边提醒，“这个部位取的量要合适哦，不然会影响核酸的量呢。
”采集的样本要尽快处理，就像刚摘下来的新鲜水果得赶紧吃或者做成罐头保存一样，不然核酸可能会开始降解啦。
核酸的性质与研究方法
核酸的理化性质
核酸的分离纯化、 测定及研究方法
ห้องสมุดไป่ตู้酸的理化性质
核酸的性质是由其结构决定的。核酸的结构 特点是分子大,有一些可解离的基团,具有共轭 双键等.这些特点决定了核酸及其组分核苷酸性 质的基础.下面介绍几种重要的性质:
一、物理性质
1、性状：RNA及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色 的粉末或结晶；DNA则为疏松的石棉一样的纤维状固体。
核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此， 核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸 性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNA的pI约 为4～5，RNA的pI约为2.0～2.5，在pH7～8电泳时 泳向正极。
四、UV吸收 ：核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱，因而具有紫 外吸收的的性质，在260nm处核酸紫外吸收最强。核酸的紫外 吸收是核酸定量测定的基础。
指经加热变性的DNA在适当条件下，二条互补链全部 或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种 逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过 程称之为退火(annealing)。这一术语也用以描述杂交核 酸分子的形成(见后)。
DNA的复性不仅受温度影响，还受DNA自身特性等其它因 素的影响：
杂交可以发生于DNA与DNA之间，也可以发生于RNA 与RNA之间和DNA与RNA之间。
实验七 核酸的定量
成分测定
取200mg提取的核酸，加入3mol/L硫酸10ml，在沸 水浴中加热10min制成分解液并进行组分的鉴定。
1、嘌呤碱 取水解液1ml加入过量浓氨水，然后加 入约1ml 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的 银化合物沉淀。
2、核糖 取一支试管加入水解液1ml、三氯化铁浓 盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。放沸水浴中 10min。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。
二、器材与试剂
1、试剂的配制 钼酸铵-过氯酸沉淀剂[0.25%钼酸按-2.5%过
氯酸溶液]：取3.6ml 70%过氯酸和0.25g钼酸 铵溶于96.4ml蒸馏水中。 样品DNA 2、器材 容量瓶（50ml）、离心管、离心机、紫外分 光光度计。
三、操作步骤
取两支1.0ml小离心管，甲管加入0.5ml样品 和 0.5ml 蒸 馏 水 ； 乙 管 加 入 0.5ml 样 品 和 0.5ml钼酸铵-过氯酸沉淀剂，摇匀，在冰浴 中放置15min，以3000r/min离心10min，分 别取上清液0.75ml在量筒中定容到25ml，备 用。
干扰因素
蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能 吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在 280nm波长处，在260nm处的消光值仅为核 酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质 含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。 RNA的260nm与280nm消光值的比值在2.0以 上；DNA的260nm与280nm消光值的比值则 在1.8左右。当样品中蛋白质含量较高时比 值即下降。
2、二苯胺试剂为什么要溶于浓醋酸? 3、请分析自己的DNA样品。
三、操作 1、提取 称取干酵母粉2g于50mL三角瓶内。加
10% NaCl溶液10mL，搅拌均匀，然后于沸水浴 中提取半小时。 2.分离 将上述提取液取出，用自来水冷却，分装 在离心管内，以3500r/min离心10min，使提取 液与菌体残渣等分离。 3.沉淀RNA 将离心得到的上清液倾于50mL烧杯 内，并置于有冰块的250mL烧杯中冷却。待溶液冷 至10℃以下时，在搅拌下小心地加入等体积的酸性 乙醇，随着酸性乙醇的加入，溶液的逐步下降，溶液 中白色沉淀也逐渐增加，当 pH=2.5（RNA 等电 点）时沉淀量最多（注意严格控制pH值），继续于 冰浴中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。
核酸提取方法
核酸提取方法核酸提取是分子生物学实验中的重要步骤，它是从生物样本中提取出核酸（DNA或RNA）的过程。
核酸提取的质量和纯度对后续实验结果具有重要影响，因此选择合适的核酸提取方法至关重要。
本文将介绍几种常用的核酸提取方法，帮助您选择适合您实验需求的方法。
1.酚氯仿提取法。
酚氯仿提取法是最常用的核酸提取方法之一。
它适用于从细胞或组织样本中提取核酸。
该方法的原理是利用酚和氯仿的不同密度，将细胞或组织中的蛋白质和脂质沉淀到有机相中，从而分离出核酸。
酚氯仿提取法简单、快速，适用于大批量样本的提取。
2.硅胶柱法。
硅胶柱法是一种基于硅胶膜的离心柱层析技术，适用于从血液、组织、细胞培养物等样本中提取核酸。
该方法通过硅胶膜的亲和作用，使DNA或RNA能够在柱子中特异性地吸附，然后经过洗脱步骤将核酸从硅胶柱中纯化出来。
硅胶柱法提取的核酸纯度高，适用于需要高纯度核酸的实验。
3.磁珠法。
磁珠法是利用磁珠与核酸的亲和作用，将核酸特异性地吸附到磁珠表面，然后利用外加磁场将磁珠与其他杂质分离。
该方法操作简便，无需离心步骤，适用于高通量核酸提取。
磁珠法提取的核酸质量好，适用于高灵敏度的实验。
4.酶解法。
酶解法是利用蛋白酶和蛋白酶K等酶类将蛋白质降解，从而释放出核酸。
该方法操作简单，适用于从血液、组织等样本中提取核酸。
酶解法提取的核酸适用于一些特殊实验，如PCR、RT-PCR等。
5.离心法。
离心法是利用超速离心将细胞或组织破碎，然后通过差速离心将核酸从其他细胞成分中分离出来。
该方法操作简单，适用于从大量样本中提取核酸。
离心法提取的核酸适用于一些基础实验。
总结。
选择合适的核酸提取方法需要根据实验样本的来源、实验需求以及实验室条件等因素综合考虑。
在实际操作中，可以根据不同实验目的选择不同的核酸提取方法，以确保提取的核酸质量和纯度满足实验要求。
希望本文介绍的核酸提取方法能够为您的实验工作提供帮助。
核酸的提取与鉴定
3．核糖的鉴定 取试管2支，按表操作 将2支试管放入沸水浴内加热10min
管号
测定 对照
水解液
4滴 —
5%硫酸
— 4滴
3，5二羟甲苯试剂
6滴 6滴
4．脱氧核糖的测定 取试管2支，按表操作 将两管同时放人沸水浴l0min
管号
测定 对照
水解液
20滴 —
5%硫酸
— 20滴
二苯胺试剂
40滴 40滴
析出的核酸(DNA与RNA)均由单核苷酸组成，在单 核苷酸中含有磷酸、有机碱(嘌呤与嘧啶)或戊糖(核糖、脱 氧核糖)。核酸用硫酸水解后，即可游离出这三类物质。 用下述方法可分别鉴定出这三类物质：
1．磷酸：用钼酸铵与之作用可生成磷钼酸，磷钼酸可被氨 基奈酚磺酸还原形成蓝色钼蓝。
2．嘌呤碱：用硝酸银与之反应生成灰褐色的絮状嘌呤银化 合物。
纯冰乙酸)，加入2.75ml浓硫酸，摇匀。放在棕色瓶中保 存。此试剂需临用时配制。 5． 0.9%Nacl。 6． 20%三氯醋酸。 7． 95%乙醇。
实验步骤
(一)匀浆制备
称取新鲜猪肝(或大白鼠肝脏)5克，加入等量冰冷的 0.9%NaCl溶液（可先放少量，待研磨成匀浆后加入剩余 部分），及时剪碎。放人研钵中加入少量石英砂，研磨成 匀浆。研磨过程中，要随时将研钵置于冰中冷却。（匀浆 制备一定要在低温条件下制作，操作要迅速，以避免核酸 分解。）
（四）DNA与RNA成分的鉴定
1．磷酸的鉴定 取试管2支，按表操作
管号
测定 对照
水解液
5%硫酸
钼酸铵试剂
氨基奈酚磺 酸
10滴
—
5滴
20滴
—
10滴
5滴
20滴
2．嘌呤碱的鉴定:取试管2艾，按表操作
核酸分离鉴定_实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握核酸分离与鉴定的原理和方法。
2. 了解核酸的组成和结构。
3. 学会使用实验仪器和试剂，进行核酸的分离与鉴定。
二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，包括DNA和RNA。
DNA主要存在于细胞核中，负责遗传信息的存储和传递；RNA主要存在于细胞质中，参与蛋白质的合成和调控。
核酸的分离与鉴定是分子生物学研究的基础。
核酸分离与鉴定主要包括以下步骤：1. 核酸提取：利用细胞破碎技术，将细胞内的核酸释放出来。
2. 核酸纯化：去除杂质，得到纯净的核酸。
3. 核酸鉴定：通过物理、化学或生物学方法，鉴定核酸的种类和结构。
本实验以酵母细胞为实验材料，采用碱法提取RNA，并通过紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：酵母细胞2. 试剂：0.04mol/L NaOH溶液、酸性乙醇溶液、琼脂糖凝胶、缓冲液、核酸染料、DNA/RNA Marker等四、实验步骤1. 核酸提取（1）称取1g干酵母细胞，加入2ml 0.04mol/L NaOH溶液，研磨至匀浆状。
（2）加入4ml 0.04mol/L NaOH溶液，混匀，转移至离心管中。
（3）沸水浴加热30min，冷却后离心（2000r/min，15min）。
（4）取上清液，加入等体积的酸性乙醇溶液，混匀，静置2h。
（5）离心（2000r/min，15min），弃去上清液。
（6）加入70%乙醇洗涤沉淀，离心（2000r/min，15min），弃去上清液。
2. 核酸鉴定（1）紫外分光光度法：取适量RNA溶液，在260nm和280nm波长下测定吸光度值，计算RNA浓度。
（2）琼脂糖凝胶电泳：将提取的RNA与DNA/RNA Marker混合，加样至琼脂糖凝胶孔中，电泳（100V，30min）。
观察电泳结果，判断RNA的纯度和完整性。
五、实验结果与分析1. 紫外分光光度法测定结果显示，RNA浓度为0.5mg/ml。
2. 琼脂糖凝胶电泳结果显示，RNA条带清晰，无杂质带，表明RNA纯度和完整性良好。
核酸提取原理及方法
核酸提取原理及方法核酸提取是指从细胞、组织或病毒中分离纯化出来的DNA或RNA分子。
核酸提取的过程包括以下几个步骤。
1. 细胞破碎：首先需要将目标细胞破碎，破碎细胞的方法可以选择机械破碎、化学破碎或酶解等。
机械破碎可以通过高速离心、超声波处理等方法实现，化学破碎则可以使用表面活性剂或蛋白酶K等物质，酶解则是利用特定酶降解细胞壁。
2. 蛋白质消化：细胞内的蛋白质需要消化在提取核酸的过程中，可以使用蛋白酶、高盐离心等方法使蛋白质失活和沉淀。
高盐离心可通过加入高盐溶液，使蛋白质和核酸形成络合物，然后离心，使蛋白质沉淀，核酸在上清液中。
3. 去除杂质：在提取的过程中，会存在一些杂质如RNA、酶和多肽，这些物质会影响纯化核酸的质量和浓度。
可以通过酶切、RNA去除试剂等方法去除这些杂质。
酶切是利用特定的核酸酶对RNA进行消化，RNA去除试剂则是通过特定试剂与RNA结合形成沉淀，然后进行离心分离。
4. 纯化：纯化的目的是除去核酸提取过程中的其他杂质，获得纯净的核酸分子。
常用的纯化方法有酚/氯仿法、琼脂糖凝胶电泳法、硅胶纯化法和离心柱纯化法等。
酚/氯仿法是利用酚和氯仿疏水性差异的原理，将核酸分子转移到酚相中，然后进行重溶解和沉淀分离。
琼脂糖凝胶电泳法则是利用琼脂糖凝胶孔径大小的差异，通过电场的作用将核酸分子从琼脂糖凝胶中分离出来。
硅胶纯化法是利用硅胶对DNA和RNA分子的亲和性，将核酸与硅胶结合，然后通过洗脱和浓缩得到纯化的核酸。
离心柱纯化法则是利用柱体内特定的亲和基质，选择性地结合核酸分子，然后洗脱和收集纯化的核酸。
5. 检测：最后核酸提取的纯度和浓度可以通过吸光度测量或荧光染料法进行检测。
吸光度测量通过核酸溶液吸收紫外光的特性来计算核酸的浓度和纯度。
荧光染料法则是利用特定荧光染料与核酸结合形成荧光复合物，通过荧光信号的强度来计算核酸的浓度和纯度。
综上所述，核酸提取的方法和原理主要包括细胞破碎、蛋白质消化、去除杂质、纯化和检测等步骤。
动物组织和细胞中核酸的提取和测定_
实验九动物组织和细胞中核酸的提取和测定第一部分动物组织和细胞中DNA和RNA的提取【实验目的】学习从组织和细胞中提取DNA和RNA的方法【实验原理】1.从动物组织和细胞中提取DNADNA存在于细胞核中。
提取DNA的方法首先需要温和裂解细胞及溶解DNA的技术，接着需采用化学和酶学方法，除去杂蛋白、RNA及其他的大分子。
本实验在EDTA（螯合二价阳离子以抑制Dnase）存在的情况下，用蛋白酶K消化真核细胞和组织，用去垢剂（如SDS，十二烷基磺酸钠）溶解细胞膜并使蛋白质变性。
核酸通过有机溶剂抽提得以纯化，污染的RNA通过RNase消化清除。
这个方法可产生十微克至数百微克的DNA，适用于标准琼脂糖凝胶上的Southern分析，可用作PCR反应的模板，以及用于构建基因组DNA文库。
2.从动物组织和细胞中提取RNARNA存在于细胞质及核中，是一种极易降解的核酸分子。
为了快速从细胞中分离完整的RNA，许多方法都用到了高浓度的强变性剂硫氰酸胍使细胞破裂。
高浓度的硫氰酸胍还使细胞内的各种RNA 酶失活，使释放出的RNA不被降解。
细胞裂解后存在于裂解溶液内的有RNA，核DNA，蛋白质和细胞残片，通过酚，氯仿等有机溶剂处理，离心，使RNA最终与其它细胞组分分离开来。
【实验材料】1.实验器材研钵和研棒，匀浆机，橡胶刮棒，低温冷冻离心机，恒温水浴，宽口移液管，锤子，塑料袋，涡旋。
2.实验试剂(1)裂解缓冲液：10mmol/L Tris-Cl(PH8.0)，0.1mol/L EDTA(PH8.0)，0.5%(m/V)SDS，20µg/mg无Dnase 的胰RNase，裂解缓冲液的前三种成分可预先混合并于室温保存。
RNase在用前适量加入。
(2)溶液D(变性液)：4mol/L硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠.2H20，0.5%(m/V)月桂基肌酸钠，0.1mol/L β-巯基乙醇，将250g硫氰酸胍、0.75mol/L(PH7.0)柠檬酸钠17.6ml和26.4ml10%(m/V)月桂基肌酸钠溶于293ml水中.加入搅拌子于磁力搅拌器上65℃混匀,直至完全溶解。
核酸提取的方法
核酸提取的方法
核酸提取是指从生物样品中分离纯化核酸的过程，常用的核酸提取方法主要有以下几种：
1.酚-氯仿法（Phenol-Chloroform Extraction）：将生物样品与
酚-氯仿混合，通过离心分离出有机相和水相，有机相中含有
核酸，可以经过乙醇沉淀得到纯化的核酸。
2.硅胶柱法（Silica Column Extraction）：将生物样品经过裂解，混合硅胶柱柱料，利用硅胶吸附核酸，经过洗脱步骤得到纯化的核酸。
3.离心柱法（Spin Column Extraction）：使用离心柱将生物样
品吸附于柱载体上，利用离心力和洗涤缓冲液来分离和纯化核酸。
4.磁珠法（Magnetic Bead Extraction）：利用磁珠表面特定基
团与核酸进行非特异性吸附结合，通过磁性分离方法来分离和纯化核酸。
这些方法在细胞、血液、组织等生物样品的核酸提取中被广泛应用，根据实验需求和样品类型可以选择合适的方法。
核酸的物理化学性质和第15章核酸的研究方法辅导版
为了水解嘧啶糖苷键，需要较高的温度。用甲 酸（98%～100%）密封加热至175℃2h，无论RNA 或DNA都可以完全水解，产生嘌呤碱和嘧啶碱，缺 点是尿嘧啶的回收率较低。改用三氟乙酸在155℃加 热60min（对DNA）或80min（对RNA），嘧啶碱的 回收率显著提高。
DNA分子的热变性曲线
异质的
DNA变性温
度范围宽，
均质的DNA 变性温度范
bacterial DNA
Viral DNA
围窄。
影响DNA分子Tm的因素
（1）G－C含量：G－C之间有3个氢键，所以G －C含量越高Tm越高。通过测定Tm值，可以推
算出DNA中G－C的含量，其经验公式为:
xGC (Tm 69.3) 2.44
RNA只有局部的双螺旋，所以其Tm较低，变
性温度范围较宽。不管是DNA还是RNA，加入甲
酰胺可降低其Tm值。双链RNA的变性曲线几乎与 双链DNA相同。
1.一种浮萍的18SrRNA
2.酵母的杀伤RNA（双 链）加甲酰胺
3.同2，但无甲酰胺
DNA的复性
变性DNA在适当条件下，可以使两条分开的
单 链重 新 缔合 成 双链 DNA， 这 个 过程 称 为复 性 （renaturation）。将热变性的单链DNA骤然冷却， DNA不 能 复性 ， 只有 缓 慢降 温 才能 使 热变 性 的 DNA复性，这个过程又称为退火（annealing）。
核酸的碱水解
RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。
核酸的提取及含量测定
沉淀(RNA),先用1mL0.
一、核酸提取 14mol/LNaCl的pH为4，使两者分开。
匀浆、超声震荡、酶解等，因动物组织含有核酸酶，在一定温度下，该酶可被Ca2+,Mg2+等激活，为避免核酸酶对核酸的水解，与核 酸提取液中加入适量螯合剂（如EDTA，柠檬酸等），除去这些离子，整个过程在低温下进行。
核蛋白 RNP DNP
0.14mol/LNaCl 1.0mol/LNaCl
溶解度大
溶解度小
溶解度小
溶解度大
（仅为水中1%） (比在水中大2倍)
• 此外，两种核蛋白溶解度与pH值有关
RNP：pH2.0-2.5时最低
DNP：pH4.2时溶解度最低
故调节溶液pH也可促使两者分离，将 0.14mol/LNaCl的pH为4，使两者分开。
2+
㈠新鲜测肝糖组法织用为冰生避理盐免水洗去核表面酸的血酶液，加对0. 核酸的水解，与核酸提取液中加入
适量螯合剂（如EDTA，柠檬酸等），除去这些离 14mol/LNaCl的pH为4，使两者分开。
14mol/LNaCl溶解提取核糖核蛋白。
子，整个过程在低温下进行。 上清液,倒入另一离心管中,记录体积
新鲜肝组织用冰生理盐水洗去表面的血液，加0.
㈠ 测糖法
5×匀浆总体积/4 × 1/肝重(g)
⒉ 提取核糖核蛋白(RNP)
在生物体内核酸多以核蛋白的形式存在于组织中， 根据核糖核蛋白(RNP)和脱氧核糖核蛋白(DNP)在 不同浓度电解质溶液中溶解度明显差别进行分离。 故用0.14mol/LNaCl溶解提取核糖核蛋白。
核酸的提取及含量测定
• 核酸是具有重要生物化学功能的生物大分子， 根据其分子所含糖的种类不同，核酸分为两 大类，含核糖的称为核糖核酸(RNA)，含脱 氧核糖核酸的称为脱氧核糖核酸(DNA)， DNA是遗传信息的携带者，与生物的生长、 繁殖、遗传和变异有密切关系，RNA参与蛋 白质的生物过程，由于核酸具有如此重要的 生物学功能，对核酸的结果与功能的研究已 成为当前生物科学的重要课题之一。
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核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
分离纯化核酸的原则
1. 应保证核酸一级结构的完整性
完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求
① 减少化学因素对核酸的降解：
a. 温度不要过高；
b. 控制pH值范围(pH值5-9);
c. 保持一定离子强度;
② 减少物理因素对核酸的降解：
避免机械剪切力破坏核酸结构
可用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远 远比95％乙醇昂贵）但是加95％的乙醇使总体积增大，而 DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤 其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次 沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要 使用无水乙醇。
核酸分离纯化中各试剂的作用
RNA分离纯化实验步骤
加入3 mL 0.05 mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液, 250 g/L SDS 0.5 mL，匀浆 再加入等体积 80% 酚（约4mL），匀浆 移入三角烧瓶中，65℃水浴中继续振摇5-8min， 取出流水冷却 5000 r/min 离心10 -15min 上层为稍浑浊含有RNA的水相， 中层为变性蛋白质，下层为酚 液，管底残渣含有DNA。
③ DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体。 ④ DNA和RNA都是极性化合物，因此他们一般都微溶于水， 而不溶于乙醇，乙醚，氯仿等有机溶剂。
核酸的性质
2. 核酸的存在方式：
DNA和RNA在细胞中通常以与蛋白质结合的状态存在。他 们与蛋白质结合形成的复合物分别称为DNP（脱氧核糖核蛋白） 和RNP（核糖核蛋白）。
2. RNA分离纯化：
① 0.5 mol/L醋酸-醋酸钠溶液 使混合物中DNA沉淀 2 mol/L 醋酸醋酸钠溶液 提供一定盐离子促进RNA沉淀
② SDS：阴离于型表面活性剂
使蛋白质变性，有破胞和抑制核酸酶的作用； ③ 苯酚抽提法：
苯酚是极强烈的蛋白质变性剂，它几乎使所有遇到的蛋 白质都变性。能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑 制作用。
DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用 金属二价离子螯合剂EDTA，可抑制DNA酶活性。
③ 氯仿异戊醇抽提：
氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相分层； 异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡。
核酸分离纯化中各试剂的作用
④ 乙醇沉淀法：
DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时， 乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。用 无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。 乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理 想的沉淀剂。
核酸纯化原理
DNA分离纯化原理：
脱氧核糖核蛋白（DNP）在0.14 mol/L NaCl中溶解度很
低，而核糖核蛋白（RNP）却较易溶解，因此用上述浓度的 NaCl洗涤组织匀浆，可得到DNP，再用氯仿-异戊醇除蛋白即 可得到DNA。
RNA分离纯化原理：
组织匀浆在酚与十二烷基硫酸钠(SDS)存在下，RNA与蛋
动物组织中核酸的提取
实验目的及意义
能够说出组织DNA分离提纯的原理及方
法并能够抽提制备DNA 能够说出组织RNA分离提纯的原理及方 法并能够抽提制备RNA。
前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。 无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需 要对核酸进行分离和纯化。
分离纯化核酸的原则
③防止核酸的生物降解：
a.细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键， 破坏核酸一级结构。 b.进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马 上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。
c.所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶 抑制剂。
分离纯化核酸的原则
2. 排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 3. 无其他核酸分子的污染（如抽提DNA分子时应 去除RNA分子）。
核酸的性质
1. DNA、RNA的理化性质特点：
① 核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团 （氨基），因而核酸具有两性性质，是两性电解质。
② 由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性 （氨基）是一个弱碱，所以核酸通常表现为酸性，等电 点比较低。如DNA的等电点为pI 4-4.5，RNA的等电点为 pI 2-2.5。
收集上层水液于量筒中，测水液的体积，加入1/10 体积的2 mol/L 醋酸 钠溶液，混匀。再加2.倍体积预冷的无水乙醇，混匀，冷处放置至絮 状沉淀充分形成（絮状沉淀即为RNA）
核酸分离纯化中各试剂的作用
1. DNA分离纯化
பைடு நூலகம்
① DNP在2 mol/L NaCl中易溶解
DNP在0.14 mol/L NaCl中不溶 RNP在0.14 mol/L NaCl中易溶解 ② EDTA：DNA酶抑制剂
④ 乙醇沉淀法：原理同DNA沉淀。
注意事项
尽量保持低温下操作，作时注意避免破坏核酸结构
一般来讲，核酸沉淀应在低温下长时间下进行。但是低温长
时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。因 此一般使用0℃冰水，10-15min， DNA样品足可达到实验要
求。
使用酚时应注意
酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，
白质分离。酚使蛋白质变性凝固，RNA则溶解在水相中，用乙 醇使RNA从水相中沉淀而达到分离。
DNA分离纯化实验步骤
剪碎组织 放入匀浆器加入0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA液7 mL
匀浆，离心 5000 r/min ，5 min
弃上清。沉淀中加入0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA液6 mL混匀。 5000 r/min 离心5 min 沉淀中加入3 mL 0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA, 转入匀浆器匀浆， 在搅拌下缓缓滴入250 g/L SDS 0.4 mL 匀浆，使沉淀悬浮均匀 再加入2 mol/L NaCl 4 mL（此时由于大分子脱氧核糖核蛋白的溶 出，溶液粘度骤然升高，再匀浆，使之均匀） 加氯仿-异丙醇 5 mL，剧烈振摇10min。混合物离心 3000 r/min离心10 min 上层水液，下层氯仿，交界面为变性蛋白。 收集上层水液边摇变加入等体积95% 乙醇，即可见有长纤维状DNA析出
表明其中含有酚的氧化产物。变色的酚不能用于核酸抽提实
验，氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套。