核酸的分离提取及定量.

核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
分离纯化核酸的原则
1. 应保证核酸一级结构的完整性
完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求
① 减少化学因素对核酸的降解：
a. 温度不要过高；
b. 控制pH值范围(pH值5-9);
c. 保持一定离子强度;
② 减少物理因素对核酸的降解：
避免机械剪切力破坏核酸结构
可用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远 远比95％乙醇昂贵）但是加95％的乙醇使总体积增大，而 DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤 其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次 沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要 使用无水乙醇。
核酸分离纯化中各试剂的作用
RNA分离纯化实验步骤
加入3 mL 0.05 mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液, 250 g/L SDS 0.5 mL，匀浆 再加入等体积 80% 酚（约4mL），匀浆 移入三角烧瓶中，65℃水浴中继续振摇5-8min， 取出流水冷却 5000 r/min 离心10 -15min 上层为稍浑浊含有RNA的水相， 中层为变性蛋白质，下层为酚 液，管底残渣含有DNA。
③ DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体。 ④ DNA和RNA都是极性化合物，因此他们一般都微溶于水， 而不溶于乙醇，乙醚，氯仿等有机溶剂。
核酸的性质
2. 核酸的存在方式：
DNA和RNA在细胞中通常以与蛋白质结合的状态存在。他 们与蛋白质结合形成的复合物分别称为DNP（脱氧核糖核蛋白） 和RNP（核糖核蛋白）。
2. RNA分离纯化：
① 0.5 mol/L醋酸-醋酸钠溶液 使混合物中DNA沉淀 2 mol/L 醋酸醋酸钠溶液 提供一定盐离子促进RNA沉淀
② SDS：阴离于型表面活性剂
使蛋白质变性，有破胞和抑制核酸酶的作用； ③ 苯酚抽提法：
苯酚是极强烈的蛋白质变性剂，它几乎使所有遇到的蛋 白质都变性。能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑 制作用。
DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用 金属二价离子螯合剂EDTA，可抑制DNA酶活性。
③ 氯仿异戊醇抽提：
氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相分层； 异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡。
核酸分离纯化中各试剂的作用
④ 乙醇沉淀法：
DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时， 乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。用 无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。 乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理 想的沉淀剂。
核酸纯化原理
DNA分离纯化原理：
脱氧核糖核蛋白（DNP）在0.14 mol/L NaCl中溶解度很
低，而核糖核蛋白（RNP）却较易溶解，因此用上述浓度的 NaCl洗涤组织匀浆，可得到DNP，再用氯仿-异戊醇除蛋白即 可得到DNA。
RNA分离纯化原理：
组织匀浆在酚与十二烷基硫酸钠(SDS)存在下，RNA与蛋
动物组织中核酸的提取
实验目的及意义
能够说出组织DNA分离提纯的原理及方
法并能够抽提制备DNA 能够说出组织RNA分离提纯的原理及方 法并能够抽提制备RNA。
前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。 无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需 要对核酸进行分离和纯化。
分离纯化核酸的原则
③防止核酸的生物降解：
a.细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键， 破坏核酸一级结构。 b.进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马 上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。
c.所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶 抑制剂。
分离纯化核酸的原则
2. 排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 3. 无其他核酸分子的污染（如抽提DNA分子时应 去除RNA分子）。
核酸的性质
1. DNA、RNA的理化性质特点：
① 核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团 （氨基），因而核酸具有两性性质，是两性电解质。
② 由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性 （氨基）是一个弱碱，所以核酸通常表现为酸性，等电 点比较低。如DNA的等电点为pI 4-4.5，RNA的等电点为 pI 2-2.5。
收集上层水液于量筒中，测水液的体积，加入1/10 体积的2 mol/L 醋酸 钠溶液，混匀。再加2.倍体积预冷的无水乙醇，混匀，冷处放置至絮 状沉淀充分形成（絮状沉淀即为RNA）
核酸分离纯化中各试剂的作用
1. DNA分离纯化
பைடு நூலகம்
① DNP在2 mol/L NaCl中易溶解
DNP在0.14 mol/L NaCl中不溶 RNP在0.14 mol/L NaCl中易溶解 ② EDTA：DNA酶抑制剂
④ 乙醇沉淀法：原理同DNA沉淀。
注意事项
尽量保持低温下操作，作时注意避免破坏核酸结构
一般来讲，核酸沉淀应在低温下长时间下进行。但是低温长
时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。因 此一般使用0℃冰水，10-15min， DNA样品足可达到实验要
求。
使用酚时应注意
酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，
白质分离。酚使蛋白质变性凝固，RNA则溶解在水相中，用乙 醇使RNA从水相中沉淀而达到分离。
DNA分离纯化实验步骤
剪碎组织 放入匀浆器加入0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA液7 mL
匀浆，离心 5000 r/min ，5 min
弃上清。沉淀中加入0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA液6 mL混匀。 5000 r/min 离心5 min 沉淀中加入3 mL 0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA, 转入匀浆器匀浆， 在搅拌下缓缓滴入250 g/L SDS 0.4 mL 匀浆，使沉淀悬浮均匀 再加入2 mol/L NaCl 4 mL（此时由于大分子脱氧核糖核蛋白的溶 出，溶液粘度骤然升高，再匀浆，使之均匀） 加氯仿-异丙醇 5 mL，剧烈振摇10min。混合物离心 3000 r/min离心10 min 上层水液，下层氯仿，交界面为变性蛋白。 收集上层水液边摇变加入等体积95% 乙醇，即可见有长纤维状DNA析出
表明其中含有酚的氧化产物。变色的酚不能用于核酸抽提实
验，氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套。