核酸分离纯化技术

多数生物体的RNA分子是单链线状。而且， 不同类型的RNA还有不同的结构特点。如 真核生物mRNA多数有PolyA尾巴。至于 病毒、类病毒所含的DNA和RNA分子则形 式多样，有双链线状、双链环状、单链线 状、单链环状等。无论DNA还是RNA，在 体内都形成一定的高级结构。
分布：
真核生物的DNA主要存在于细胞核中，只有 约5%在线粒体、叶绿体等细胞器中。RNA 则75%左右存在于细胞质中，约15%在细 胞器中，约10%在核中。原核生物DNA集中 在核质区，RNA分散在细胞质里。细胞质各 种RNA中，以rRNA的数量最多（约占5%）， tRNA其次（15-20%），mRNA最少（15%）。
该法简单易行，但效率不高，需反复几次才能达到预
期的效果。
②压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎。
常用的有高压冲击、突然降压及渗透压变化等方法。
如红血球在纯水中会发生破壁溶血现象。
③超声波法：超声波是破碎细胞或细胞器的一种有效手 段，且一次处理的量较大。该方法的主要缺陷是超声 空穴局部过热引起的生物大分子的变性，所以超声振 荡处理的时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处 理，尽量减小热效应引起的酶的失活。
第二节 酚－氯仿抽提法分离基因组DNA
酚／氯仿抽提DNA的原理


去除蛋白质最经典的方法是酚／氯仿抽提 法，也是最常用的方法。 酚氯仿抽提法的原理是：利用核酸与蛋白 质对苯酚的变性作用具有的不同反应性分 离核酸与蛋白质。在细胞破碎步骤后的样 品混合液中用苯酚抽提和高速离心后，样 品中的蛋白质成分被变性，或者变成不溶 性物质，而核酸则溶解在水相中。。
ＰＨ４－１０，避免酸碱对核酸的磷酸二脂键的破 坏
3, 5-磷酸二酯键
３.减少物理因素对核酸的降解
温度：
最适温度 ４℃
防止机械剪切力的作用：
基因组DNA：分子细长，容易受到机械剪切 力的作用而断裂，所以机械剪切作用是分离 DNA时的主要危险。
操作时动作必须轻缓，搅拌时要 温和， 避免让DNA溶液通过狭窄的 孔道 。在提取缓冲液中加入蔗糖或山 梨糖醇等增加溶液的渗透压。 提取分子量较小，结构又很紧 密的DNA，如小的细菌质粒 超螺旋DNA等时，机械剪切 力的威胁较小，操作时可不 必过于谨慎



酚／氯仿／异戊醇混合液配制 氯仿为挥发性有机溶剂，可使蛋白质变性，加 入氯仿可以: 1.减少酚的用量； 2.使蛋白质变性更为彻底； 3.同时可抑制核酸酶的活性。 异戊醇可消除抽提时有机相和水相之间产生的 气泡，有利于分层。 通常按酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1比例将 三种试剂混合，要求用时临时配制。
油菜叶片总RNA的非变性电泳（ A ）和甲醛变性电泳（ B ）结果
二．分离纯化核酸时的注意事项 要得到具有生物活性的核酸大分子， 在分离时必须避免核酸变性，并尽可能保 持分子的完整性，避免降解。因此，要注 意下列事项：
１.尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以 减少变性降解的机会。

２.减少化学因素对核酸的降解
３.化学破碎法
通过各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎的方
法，称为化学破碎法。常用的化学试剂有甲苯、丙
酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton，Tween等表
面活性剂。 ４.酶促破碎法 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细 胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的目的。
（二）核蛋白的解聚和蛋白质的去除
1．酚抽提法
酚和氯仿是蛋白质变性剂，当它们与含核酸和蛋白质的水 溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质充分接触氯仿和苯酚而变性， 与核酸分开。离心后分为两相，一般上层为含有核酸的水相，下 层为有机相，相界处则是变性凝聚的蛋白质层。
用有机溶剂处理核酸溶液时，既要使水溶液与有机溶剂充分 接触，又要注意防止剪切力对DNA的破坏。
（五）核酸制剂的保存
分离提取到的核酸制品在保存过程中要防止变性和降 解。因此，溶解核酸的溶液必须含有螯合剂以抑制 DNA酶，溶液的pH为7~8，防止酸碱变性，同时该 溶液要有一定的盐浓度，因为在纯水中核酸双链（或双 链区）的两条链上磷酸根负离子互相排斥，使双链分开 而变性，Na+等正离子可中和磷酸根的电负性，保持双 链结构。现在较普遍是将DNA溶于TE溶液（10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0），
外源性RNA酶：RNA制备过程中用到的玻璃和塑料制 品、研究人员本身尤其是研究人员的手，以及分离过程中 用到的试剂和溶液。 内源性RNA酶：组织本身所固有的，在某些组织中（如胰 腺），或者在其特定的生理状态（如快速发育期间）下的 含量很高。而且一当细胞破碎后即释放出来。
三．核酸的分离提取 大致步骤：
１.收集细胞
２.破碎裂解细胞（或细胞器） ３.解聚核蛋白并去除蛋白质
４.沉淀核酸并去除其他杂质（纯化）。
（一）破碎细胞
1．机械破碎法
通过机械运动所产生的剪切力的作用使细 胞破碎的方 法，称为机械破碎法。
2．物理破碎法
通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用使组 织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。物理破碎法多用 于微生物细胞的破碎。 常用的物理破碎方法有： ①温度差破碎法：利用温度的突然变化，细胞由于热胀 冷缩的作用而破碎。

（四）核酸的浓缩



如果核酸溶液中DNA含量低，体积较大，不易 进行乙醇沉淀时，可采用固体聚乙二醇吸水浓缩 法或正丁醇抽提浓缩法进行浓缩。 固体聚乙二醇吸水浓缩法：将待浓缩的DNA溶 液装入透析袋中，在透析袋外加适量的固体聚乙 二醇，使DNA脱水达到浓缩效果。 正丁醇抽提浓缩法：利用部分水分子可分配于有 机溶液中，使溶液的体积减少，有机溶剂则不吸 取溶液中的DNA和其盐类分子。
基因诊断技术
基因诊断 (gene diagnosis) 是利用分子生物学及 分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析基因的存 在、鉴定疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突 变，以诊断各种感染性疾病和遗传性疾病，进行肿 瘤分子水平的研究。 主要技术及过程 分离、扩增待测的DNA片断 基因探针的制备和标记 区分或鉴定DNA的异常
-20℃保存。而RNA则通常溶于DEPC水中。
（六）核酸制剂纯度的初步鉴定
纯净的核酸制品在260 nm波长处有吸收高峰，230 nm为吸收低谷。
核酸 的紫 外吸 收曲 线
纯度： A260/A280 ：双链DNA为1.8，而RNA为2.0。 含量：



50×A260样本×稀释倍数／1000＝双链 DNAug/ul 40×A260样本×稀释倍数／1000＝单链 DNA／RNA ug/ul 33×A260样本×稀释倍数／1000＝单链 寡聚核苷酸ug/ulDNA
第一节 核酸的分离与纯化

意义：实验的第一步工作，实验结果的基本保障 原则： 保证一级结构的完整性 排除其它大分子的污染 要求：

1.不能存在对核酸结构功能有影响的物质
2.降低蛋白、多糖、脂类分子污染
一、首先了解核酸的存在状态及分布：
形状：真核生物染色 体DNA是双链线状， 其细胞器DNA以及原 核生物DNA，质粒 DNA等都是双链环状。
４.防止核酸的生物降解
核酸酶直接破坏核酸一级结构，必须抑制其活 性 对于DNA酶： 大多数DNA酶作用时需要二价金属离子，如 Ca2+, Mg2+等。因此只要加入EDTA（乙二胺 四乙酸），螯合剂就可以基本上抑制DNA酶的 活力。
对于RNA酶： 其具有高稳定性，抗酸抗碱，具很广的pH作用范围， 抗高温严寒（0~65℃均具有活性）。而该酶作用时不需 要二价金属离子，故用螯合剂无法抑制其活力。 无所不在的RNA酶：
有机溶剂处理以去除蛋白质的次数视蛋白质的含量和制剂纯 度要求而定，一般要处理到中间变性蛋白质层消失为止。
2．表面活性剂法
破细胞时所用的SDS等阴离子去污剂除了可 以溶解膜蛋白和脂肪外，还可解聚核蛋白。 3．蛋白酶水解法 用蛋白酶水解去除蛋白质的方法比较温和， 可避免剪 切力的破坏。
（三）核酸的沉淀
沉淀核酸时的温度、所需时间以及沉淀后 离心的速度和时间，取决于核酸分子的大小， 浓度以及有无助沉淀物存在。核酸分子越小、 浓度越稀，沉淀时所需温度越低，时间也越长， 离心时要求速度高、时间长。
（三）核酸的洗涤
离心沉淀得到的核酸一般还要用70% 的乙醇洗涤Leabharlann Baidu去除盐分及一些小分子的杂 质，真空抽干或室温晾干后溶于适当的溶 液中。
主要所需的试剂及消耗品:
• TES溶液 • 蔗糖-TES溶液 • 溶菌酶(50mg/ml) • EDTA溶液(0.25mmol/ml) • SDS溶液(10g/l) • 饱和酚:氯仿:异戊醇(PH8.0) • NaAc（3mol/l） • 无水乙醇，70%的乙醇




实例： 原核生物（大肠杆菌）基因组DNA的分离纯化 过程 1. 吸取已培养好的大肠杆菌液体5.0ml于中号 试管中,4000转/min离心15min，弃去上清， 加入一定体积的TES液，洗菌体1~2次，如上 述方法收集菌体，将培养细菌的一些营养物的 清洗干净。 2. 弃去TES液后，管底菌体大约200ul±，加 入五倍体积的预冷蔗糖-TES液约1ml，在冰浴 中充分混匀，加入溶菌酶（50mg/ml）至终 浓度1mg/ml，（计算方法， 50×x=1×1,x=0.02ml）充分混匀后，在 0℃处理15min 该步骤作用为破坏细胞壁，为了防止酶的变 性，需低温处理，同时加EDTA抑制DNA酶。



3. 加入EDTA（0.25mol/l）至终浓度为0.1mol/l (计算为0.25×X=0.1（1+X）约取0.25mol/lEDTA 600~700ul轻轻混匀后，0℃处理10min。充分抑制 DNA酶的活性，再加入SDS或（蛋白酶K）溶液至终浓度 为10g/l，混匀，于37℃裂解30min，94℃裂解1min。 该步骤为裂解细胞膜：裂解胞膜可以用蛋白酶K，由 于蛋白酶K价格较高，所以常用SDS（胞膜双脂层。SDS 为十二烷基磺酸钠，为一种表面活性剂，能破坏双脂层） 常配制的SDS为100g/l，加入时据体系中的总体积进行 计算（100x=10×1.8,x=180ul→200ul±） 4.在37℃裂解后，呈现为高粘稠性半透明溶液，将试管内 的裂解液分装在两个1.5mlEP管中，约0.7ml±。取其 中一管进行下一步试验，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇 （25：24：1）抽提（由黄色变为乳白色），于12000 转/min离心10min，将上层水相抽一入另一个EP管中， 重复上述抽提一次，吸取上层水相于另一个EP管中，加入 等体积的氯仿：异戊醇=24：1，抽提一次，操作同前
沉淀核酸时，一般还要加入一定浓度的盐溶液，如 NaAc或NaCl。这是因为在pH为8左右的溶液中，核 酸分子是带有负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl， 使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间 的同性电荷斥力，易于互相聚合而形成核酸的盐沉淀。 加入的盐溶液浓度太低：只有部分核酸形成钠盐而 聚合，这样就造成核酸的沉淀不完全。 加入的盐溶液浓度太高时：核酸沉淀中有较高浓度 的盐的存在，会影响到下游操作，例如DNA的限制性 酶切反应。此时必须要进行洗涤或重沉淀。

苯酚抽提通常采用苯酚、氯仿和异戊醇的 混合溶液。这种混合溶液比单纯的苯酚更 有效地使蛋白质变性，并且有助于稳定 RNA，随后氯仿、异戊醇抽提，将残留苯 酚从水相中（含核酸）除去。最后用乙醇 沉淀DNA，同时也可去除残留的氯仿
试剂配制要求及作用


酚的重蒸馏和平衡 酚易氧化，其氧化产物对DNA有破坏作用，使用 前需要将酚进行重蒸馏。苯酚65℃熔化后，用空 气冷凝管进行重蒸馏，183℃收集纯净酚。 由于酚是中强酸使用前要进行酚的平衡，在纯净 酚中加入等体积的1mol/lTris-HCl缓冲液 (pH8.0)并加入固体Tris，激烈震荡使酚的pH值 平衡到8.0。酚中常加入抗氧化作用的8-羟基喹 咛，8-羟基喹咛使酚呈现黄色，可作为指示颜色。 将酚保存于棕色瓶中，表面覆盖一层 0.1mol/lTris-HCl(pH8.0)防止氧化。
沉淀的目的：改变核酸溶解缓冲液；调整核酸浓度；去 除部分杂质及某些盐离子。 实验室常用的核酸沉淀剂为乙醇和异丙醇。

异丙醇：所用的体积小（一般为2/3体积），一般不需 要在低温下长时间的放置。但异丙醇不易挥发除去。 乙醇：很易挥发除去，但所需的体积大（一般为2倍体 积），且需要在低温下长时间放置（如沉淀RNA时一 般要-20℃至少放置2小时）。

基因诊断的特点: 高度的特异性 高度的灵敏性 实现早期快速诊断 被检测基因不一定活化，可检测表达差异基因。 基本技术： （一）核酸分子杂交 （二）聚合酶链反应（PCR） （三）单链构象多态性检测 （四）限制酶酶谱分析 （五）DNA序列测定 （六）DNA芯片技术