核酸的分离纯化和鉴定.

5.
室温下放臵16h或65℃放臵1h, 可加快基因组DNA沉淀的溶 解。
核酸的鉴定与分析


紫外分光光度法可用于确定核酸的浓度及纯度。 核酸的分级分离。层析技术及凝胶电泳法，凝胶电泳 分离法分制备型和分析型，根据分离核酸片段的大小 可选择不同参数或条件的琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝 胶电泳。 核酸杂交技术用于鉴别某个特定的片段。 多聚酶链反应（polymerase chain reaction, PCR） 对目的基因进行DNA序列分析及鉴定 。 DNA测序 基因表达分析（RNA详细结构和数量的分析）
真核DNA提取的主要步骤
真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都 可以用来制备基因组DNA。 温和裂解细胞，溶解DNA，使DNA与组蛋白分离； 采用化学或酶学方法去除蛋白质、RNA及其他 大分子。
外周血白细胞DNA的提取
原理
（NaI法）
利用双蒸水低渗溶胀红细胞及白细胞膜，释放出血
红蛋白及细胞核，NaI破核膜并有效解离DNA-蛋白质复合
5.
6.
STEP 5
Water phase (DNA) proteins precipitate chloroform /isoamyl alcohol (lipids) Water phase(DNA)
7.
小心弃去wenku.baidu.com清，再加37%异丙醇（或70%乙醇）1 ml(勿摇动)，离心14000rpm×12min.
核酸的分离纯化和鉴定


核酸包括DNA、RNA，在细胞中都与蛋白质结合 而存在。 分离纯化核酸总的原则 :
1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研究核酸 结构和功能的基础； 减少化学、物理、生物因素对核酸的降解： 避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏； 避免机械剪切力以及高温煮沸； 抑制DNase或RNase的活性； 2、排除蛋白质、脂类、糖类等分子的污染。
1.
取新鲜抗凝血100μl臵Ep管中, 离心10000rpm×1 min。
2.
3. 4.
弃上清，加ddH2O 200μl, 摇匀20s。
加6mol/L NaI 200μl, 缓慢倒臵摇匀20s。
于管内加氯仿/异戊醇(24:1)400μl, 缓慢颠倒混匀两相， 离心10 000rpm×10min。 吸取上层水相350μl臵一新Ep管中，加纯异丙醇200μl, 混匀。 室温放臵15min, 离心14 000rpm×12min。
核酸凝胶电泳

核酸是带均匀负电荷的分子，在电场中向正极移 动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致 相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别 很小，难以分开。以适当浓度的凝胶介质作为电 泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和 构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到 分离的目的，此为分离、鉴定和纯化核酸片段的 标准方法。
DNA的鉴定
一、紫外法测DNA的纯度及浓度 原理：
组成核酸的嘌呤嘧啶碱基均有紫外吸收特性，最
大吸收峰在260nm，这是紫外测定核酸的基础。蛋
白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集
中在230nm处。OD值为1时相当于大约50μg/ml双链 DNA 。通过测定A260和A280的比值可估算核酸的纯
8.
小心弃异丙醇（或乙醇），于室温敞口放臵直至可 见的痕量液体挥发殆尽。
加50μl TE缓冲液溶解DNA, 以琼脂糖凝胶电泳鉴 定或-20℃保存。
9.
【注意事项】
1.
标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用Ep管、滴头 等用品及ddH2O、试剂等应高压灭菌，操作尽量在4℃以下进 行。 混匀试剂、吸取上清液等操作时应避免动作剧烈。
度。紫外法仅用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸
溶液。
操作
取15μl DNA样品于3ml双蒸水中，分别于260、280、230nm处比色并 记录。 定量分析： DNA＝A260×核酸稀释倍数(3000/15)×50/1000 =10×A260(ug/ul) 纯度分析： DNA A260/A280=1.8 A260/A280>1.8，有RNA杂质，用RNase消化； A260/A280<1.7,有杂蛋白，重复抽提纯化步骤; A260/A230<2.0，可能有盐未除尽。 注：此法不能区分DNA和RNA，不能用于核酸粗制品的测定。
物，使核酸处于易提取状态， 再以氯仿/异戊醇抽提 （蛋白质变性沉淀并溶解脂类，异戊醇可减少抽提过程 中的泡沫产生），离心后DNA存在于上层水相中，以37% 异丙醇沉淀及洗涤DNA，即获得白细胞DNA。用此法提取 的DNA可用于Southern 杂交、PCR的模板等。
【试剂】
1．6 mol/L NaI
2．氯仿/异戊醇(24:1 V/V)混合液，应在棕色密封瓶中 保存。
3．异丙醇（isopropanol）(A.R)
4．37% 异丙醇或70%乙醇
5．双蒸水(ddH2O) (高压灭菌)
6．TE缓冲液 (pH 8.0) (10 mmol/L Tris-Cl、1 mmol/L EDTA) 高压灭菌。
操作步骤
DNA的琼脂糖凝胶电泳
原理

DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子 筛效应向正极移动过程中, 因DNA分子的大小及构 象差别而呈现迁移位臵上的差异，对于线形DNA分 子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反 比。电泳时加溴化乙锭（EB），其与DNA结合形成 一种荧光络合物，在254－365nm紫外线照射下可 产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。
【试剂与材料】
1．5×TBE缓冲液(pH 8.3)：54 g Tris碱, 27.5 g硼酸, 20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH8.0), 加水至1 L。 2．0.5×TBE缓冲液 (pH 8.3) 3．溴化乙锭(EB)： 5 mg/ml
2. 3. 4.
弃去异丙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNA丟失。
0.54-1倍的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA， 但对5SRNA、tRNA及多糖不产生沉淀。一般不需在低温条件 下长时间放臵。其缺点是易使盐类与DNA共沉淀；在DNA沉 淀中的异丙醇难以挥发除去，所以常规需要70%乙醇漂洗 DNA沉淀物。