核酸的分离纯化和鉴定.
实验十三 动物组织核酸的分离、鉴定和含量测定
二苯胺显色法原理
DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间 的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶 核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成 ω-羟基-γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物 质，在595nm波长处有最大吸收。DNA在 40~400μg范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。 在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。
DNA标准曲线的制作和样品测定
管 试 剂 0 对照 DNA标准溶液,ml 0.0 蒸馏水，ml 二苯胺试剂,ml OD595 2.0 4.0 1 0.4 1.6 4.0 2 0.8 1.2 4.0 3 1.2 0.8 4.0 4 1.6 0.4 4.0 5 2.0 0 4.0 号 样品1 2.0 0 4.0 样品2 2.0 0 4.0
动物组织核酸的分离纯化及鉴定
1. 猪肝DNA和RNA的分离 2. 核糖和脱氧核糖的显色实验
3. 核酸的定量和纯度测定
核酸是一类生物高分子化合物，存在于一切生物体内， 是组成细胞的重要成分。它以与蛋白质结合的形式—— 核蛋白存在于细胞中，是生命的基本物质之一，具有储 存、复制生物体遗传信息的功能，也是蛋白质合成不可 缺少的物质，因此它对于生物体的生长、遗传、变异等 现象起着重要的决定作用。核酸分为两大类——核糖核 酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA) 。 核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖 或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核 苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖， 一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷 酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴 定。
DNA和RNA的结构
组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 β-D2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为β-D-核糖。
分子生物学常用技术下
蛋白质杂交：WB
.
1.样品处理：RIPA裂解，超声，离心，总蛋白浓度 2.SDS-PAGE: 分离胶浓度 3.转膜：- 滤纸-胶- NC膜-滤纸 +， 条件 4.丽春红染色：丽春红 5.封闭：5％脱脂奶粉-TBST，RT 1h 摇床 6.Ab1：1:50~1:3000(封闭液)，RT 1h /4℃过夜 7. 洗膜：TBST，RT 1h， 换液，摇床 8.Ab2：1:3000 (封闭液) ， RT 40min，摇床 9. 洗膜：同前 10.ECL显色：RT5min，暗室，X-光片
.
四、检测方法
试剂配制：？
1. 电泳技术 核酸：完整性、分离、纯化
50XTAE
琼脂糖凝胶电泳：agarose, 水平, 1XTAE
EB(2ng), Gelred, Goldview, 紫外灯
.NA相对分子质量DL2000; 2. PCR产物; 3. PCR空白对照。
缺点：表达的蛋白质产物不能进行翻译后修饰、 高表达时容易发生折叠错误、 E coli本身内毒素和毒性蛋白可能混杂在终产物中。
成功例子：β-干扰素
.
组成
表达载体
启动子：lac、trp、tac、PL启动子 目的基因编码序列 终止子：
受体细胞
非融合蛋白：pBV220
表达方式
分泌表达: 含有信号肽序列，OmpA等
.
三、外源基因转移技术和表达体系
1.外源基因转入技术 细菌：热激法，电转化
热激法转化
a. 加入连接产物/质粒，冰浴 b. 42℃ 90sec，冰浴 c. 培养：LB培养液 d. 涂板
试剂配制：？ LB培养液 LB-Amp平板 LB-Kan平板
.
真核细胞 生物学方法：农杆菌介导的基因转导 花粉管通道法介导的基因转化 体外包装转染法 共转化 生殖细胞浸泡法介导的基因转化 化学方法：PEG介导的基因转化 磷酸钙沉淀法
核酸的分离与纯化
核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多 糖、脂肪等生物大分子分开。 在分离核酸时，应遵循两个原则：一是保 证核酸一级结构的完整性；二是尽量排除 其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。
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核酸分离与纯化的过程一般都包括了材料 的选择、核酸的释放、核酸与其它生物大 分子的分离、核酸的纯化与鉴定、核酸的 浓缩、保存等几个主要步骤。 每一步骤又可由多种不同的方法单独或联 合实现。
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5. 质粒DNA的纯化
（1）聚乙二醇沉淀法 质粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子 RNA，并用RNase消化小分子RNA；然 后在高盐条件下，用PEG选择性地沉淀大 的质粒DNA；沉淀的质粒DNA进一步用 酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。
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（2）柱层析法 柱层析法纯化质粒DNA的关键是其填充的树脂。 树脂可分为两类：一类是利用疏水的相互作用来 纯化质粒DNA样品；一类则通过离子交换与吸附 的相互作用进行纯化。 以硅基质作为填充材料的柱层析，其作用原理是 在多盐条件下，依靠DNA与硅基质的可逆性结合 来进行纯化。通过暴露的磷酸盐残基，DNA吸附 到硅基质上，以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖 类等生物大分子，然后加入TE或水溶液使DNA 分子重新水合，并通过离心洗脱出来。
在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以
减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保
持分相的稳定性。
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为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生 自由基，如果直接用于DNA分离，会使磷酸二 酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过 高温重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl饱和酚， 并调节至中性。使用饱和酚可以减少酚吸收更 多的DNA，降低DNA的损失率。
核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述
核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述一、核酸的分离纯化技术1.超声破碎法超声破碎法是一种通过超声波的振动作用破碎细胞膜，释放细胞内的核酸分子的方法。
该方法操作简便，效果较好。
2.酚-氯仿提取法酚-氯仿提取法是一种经典的核酸提取方法，通过酚和氯仿相间重复萃取的方法，将细胞或组织中的核酸分子提取到有机相中，然后用酒精沉淀。
3.离心沉淀法离心沉淀法是利用不同物质在不同离心力下沉降速度的不同，将核酸从其他组分中分离出来的方法。
可通过高速离心使核酸沉淀到底部，将上清液中的其他杂质倒掉，最后用缓冲液重悬核酸。
4.配对离心法配对离心法是利用核酸的碱基配对性质，在特定的条件下使目标DNA 与特异性探针配对，然后通过离心将核酸-探针复合物从其他杂质中分离出来。
这种方法常用于核酸的富集和寡核苷酸修饰位点的分析。
二、核酸的鉴定技术1. 紫外-可见分光光度法（UV-Vis）紫外-可见分光光度法是通过核酸分子在紫外光或可见光波长范围内的吸收特性来确定其存在和浓度的方法。
根据核酸中含有的吸收波长为260 nm处的碱基特征吸光峰，可以判断核酸的纯度和浓度。
2.电泳分析法电泳分析法是通过核酸分子在电场中的迁移速率和特定条件下的尺寸分离效应来分析核酸的方法。
主要包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方法。
核酸经电泳后可以观察到DNA或RNA在凝胶中的特征性带状图案，确定其分子大小、纯度和带电性。
3.PCR（聚合酶链式反应）PCR是一种常用的核酸鉴定技术，通过特定引物和聚合酶的作用，在体外进行核酸的扩增以达到检测目的。
PCR可用于快速检测目标DNA的存在与否，以及定性和定量分析。
4.基因测序技术基因测序技术是指利用测序反应将核酸序列信息转化为比特（通常指二进制），然后通过计算机软件分析的方法对核酸序列进行鉴定。
常用的基因测序技术有dideoxy测序和串联反应测序。
三、应用核酸的分离纯化及鉴定技术广泛应用于生物医学研究、遗传学、分子生物学、基因工程和疾病诊断等领域。
核酸的提取与鉴定实验报告
核酸的提取与鉴定实验报告
实验报告：核酸的提取与鉴定
I. 实验目的：
通过实验学习核酸提取和鉴定的步骤，掌握核酸提取实验技能，初步了解PCR技术及其在分子生物学中的应用。
II. 实验原理：
DNA分子在水性条件下具有极强的极性，由此，在化学性质上只要是极性且亲水性的溶剂都能迅速膨胀和破裂DNA分子的双链
结构，并溶解其中的碱基、核苷酸、脱氧糖等。
利用这一原理，
我们可以用溶液来提取含有核酸的样品，然后通过紫外吸光度计
检测该提取物中核酸的含量。
此外，PCR技术是一种被广泛运用
于DNA扩增的技术，其主要原理是通过DNA聚合酶扩增DNA
的特定片段。
III. 实验步骤及结果：
1. 核酸提取：将实验样品加入细胞破解液并混匀，离心后取上
清液，加入等体积的异丙醇，轻轻振荡混合并离心15分钟，然后
弃上清液，加入70%无水乙醇并离心，倒掉液体后用氧气吹干。
最终的核酸提取物的溶解液浑浊且无法肉眼辨认样品。
2. 核酸鉴定：将已经提取的样品分别用紫外吸光度计测量其光密度，结果表明与对照的D.W相比，样品中的核酸具有极高的光密度值，证明核酸提取步骤成功，核酸鉴定实验成功。
IV. 结论：
通过本次实验，我们成功地提取了样品中的核酸，并对提取后的核酸进行了鉴定，证明提取物中含有大量的核酸，表明核酸提取和鉴定实验成功，也为分子生物学的研究提供了基础。
生物大分子的纯化和分析方法
生物大分子的纯化和分析方法生物大分子是生命体系中最基本的组成部分，其中包括蛋白质、核酸、多糖等。
纯化和分析这些生物大分子是生物学研究的重要内容之一。
本文将介绍常用的生物大分子纯化和分析方法。
一、蛋白质的纯化方法1.盐析法盐析法是最常用的蛋白质分离方法之一。
通过加入盐类来改变水的离子强度以影响蛋白质的溶解度，从而将蛋白质与其他分子分离出来。
这种方法适用于分子量较大的蛋白质，对于小分子蛋白质效果不佳。
2.层析法层析法依据化学性质和大小形状的差异来分离蛋白质。
常用的层析法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析和逆相层析等。
3.电泳法电泳法是将蛋白质在电场中移动分离的方法，常用的电泳方式有SDS-PAGE和2D-PAGE。
二、核酸的纯化方法1.硅胶凝胶柱层析法硅胶凝胶柱层析法通过核酸与硅胶上化学键接触而吸附在柱胶上，不同大小的核酸在这些化学键上停留的时间不同，从而实现核酸的分离。
2.等电点电泳法等电点电泳法根据核酸的等电点，将核酸在特定电位下移动，分离出不同等电点的核酸，适用于分离等电点差异较大的核酸。
3.差示电泳法差示电泳法利用核酸在电场下移动速度的不同，将不同大小、结构和电性的核酸分离。
三、多糖的纯化方法1.醇沉法醇沉法是将多糖溶液中的酒精浓度逐渐提高，使得多糖从水溶解态转为沉淀态的方法。
2.凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法利用多糖分子的差异性，在凝胶中筛选分子大小相似的多糖物质。
3.亲和层析法亲和层析法是一种采用选择性结合的谷蛋白或其他多糖结合剂来分离多糖的方法。
结论生物大分子的纯化和分析方法多种多样，常用的方法有盐析法、层析法、电泳法、醇沉法、差示电泳法等。
选择合适的方法能够有效地纯化和分离目标大分子，为生物学研究提供了重要的帮助。
核酸的分离与纯化.
使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉 红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如 醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验， 因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 (2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时 应戴手套。
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2.3 核酸的沉淀
沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点：
DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
（3）聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
(1） 金属离子螯合剂：
DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因 此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。 如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉； (2） 阴离于型表面活性剂：
如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还 能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷 的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电 吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非 极性的范德华力。
分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合 的蛋白质分开，同时避免核酸降解。
2.2.1 加入浓盐溶液（如NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力， 使氢键破坏，核蛋白解聚；
2.2.2 加入SDS
SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还 具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
核酸的分离与纯化
2.DAPI （4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚）染色反应 DAPI 为一种荧光染料，可以穿透扰乱的细胞膜与细胞核中的双链 DNA结合而发挥标记的作用，粘附在DNA双螺旋的小沟区，可以产生 比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要 高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞 标记的效率高(几乎为100 %) ，且对活细胞无毒副作用。DAPI染色常 用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。 DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。 DAPI-DNA复合物的激发和发射波长分别为360nm和460nm
1.核酸的变性
核酸在某些物理或化学因素的作用下，其空
间结构发生改变，从而引起理化性质的改变及生 物活性的降低或丧失。
使氢键断裂，破
坏碱基堆集力，从
而引起核酸二级结 构的破坏。
2.核酸的降解 核酸的降解是指多核苷酸链的磷酸二酯键的断裂 （1）RNA的降解 在稀碱溶液中能降解生成单核苷酸的混合物， 在高温浓碱下可降解生成核苷和磷酸。在低温酸性条件下稳定，在 高温酸性条件下降解成碱基或者嘌呤碱基和嘧啶单核苷酸的混合物。 RNA在Rnase和磷酸二酯酶等的作用下，降解成3 ‘或5 ’-单核 苷酸。 （2）DNA的降解 在稀碱溶液中较稳定，但在较高浓度的碱溶液中 高温处理会降解产生单核苷酸，且嘌呤和嘧啶碱基常有破坏。在低 温的酸性条件下也比较稳定，但在高温时降解生成嘌呤碱基和嘧啶 核苷酸。 DNA在Dnase、磷酸二酯酶等的作用下。降解成3 ‘或5 ’-脱氧 核糖核苷酸。
原核生物
真核生物
70S
80S
30S 50S 40S 60S
RNA的分子结构
mRNA
第六章核酸的分离与纯化
三、鉴定、保存与应用
（一）核酸的鉴定
1．浓度鉴定核酸浓度的定量鉴定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。
（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，最大吸收波长在250nm～270nm之间。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收波长不变。由核苷酸组成核酸后，其最大吸收波长为260nm，该物理特性为测定溶液中核酸的浓度奠定了基础。在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度大约相当于50µg/ml的双链DNA，38µg/ml的单链DNA或单链RNA，33µg/ml的单链寡聚核苷酸。如果要精确定量已知序列的单链寡核苷酸分子的浓度，就必须结合其实际分子量与摩尔吸光系数，根据朗伯-比尔定律进行计算。若DNA样品中含有盐，则会使A260的读数偏高，尚需测定A310以扣除背景，并以A260与A310的差值作为定量计算的依据。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25µg/ml的核酸溶液。
2．纯度鉴定紫外分光光度法还是荧光光度法，均可用于核酸的纯度鉴定。
核酸的分离和纯化
琼脂糖凝胶电泳操作注意细节
1） 根据片段大小配制不同浓度的胶（改变分辨率），片段越小， 需要胶浓度越大。 2） 胶要现制先用 3） 选择合适的Marker 4） 配胶的缓冲液与电泳缓冲液要是同一种，且浓度一致（1倍） 5） 点样时要加入loading buffer，并注意，不要将样点到点样 孔之外（飘样），也不要将胶戳漏（漏样） 6） 根据片段大小及电泳检测目的，选择合适的电压及电泳时间 7）EB染色。
检测原理：
溴化乙锭（EB）可插入双链DNA分子中， 在紫外光照射下，发射荧光。
EB: 先染与后染
核酸凝胶电泳技术
溴化乙锭染料的化学结构及 其 对 DNA 分 子 的 插 入 作 用 。 由于插入了溴化乙锭分子， 在紫外光照射下，琼脂糖凝 胶 电 泳 中 DNA 的 条 带 便 呈 现 出荧光，易于鉴定。
琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的 能力
凝胶类型及浓度 （bp）
分离DNA的大小范围
0.3%琼脂糖
50 000~1 000
0.7%琼脂糖
20 000~1 000
1.4%琼脂糖
6 000~300
4.0%聚丙烯酰胺
1 000~100
10.0%聚~1
琼脂糖凝胶电泳的原理
rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列， 特别是28S和18S特征性条带是电泳鉴定总 RNA纯度和完整性的重要参数。
3、 琼脂糖凝胶电泳
• 3. 1 原理： • 3. 2 用途：
琼脂糖凝胶电泳的原理
DNA电泳迁移：电荷效应＋分子筛效益
（1）DNA带负电，电场中，向正极移动； （2）决定移动速度三因素：DNA大小，电荷数，构 型（超螺旋 > 线性 > 开环）； （3） 线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成 反比（分子量越大，跑得越慢）；
核酸分离鉴定_实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握核酸分离与鉴定的原理和方法。
2. 了解核酸的组成和结构。
3. 学会使用实验仪器和试剂，进行核酸的分离与鉴定。
二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，包括DNA和RNA。
DNA主要存在于细胞核中，负责遗传信息的存储和传递；RNA主要存在于细胞质中，参与蛋白质的合成和调控。
核酸的分离与鉴定是分子生物学研究的基础。
核酸分离与鉴定主要包括以下步骤：1. 核酸提取：利用细胞破碎技术，将细胞内的核酸释放出来。
2. 核酸纯化：去除杂质，得到纯净的核酸。
3. 核酸鉴定：通过物理、化学或生物学方法，鉴定核酸的种类和结构。
本实验以酵母细胞为实验材料，采用碱法提取RNA，并通过紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：酵母细胞2. 试剂：0.04mol/L NaOH溶液、酸性乙醇溶液、琼脂糖凝胶、缓冲液、核酸染料、DNA/RNA Marker等四、实验步骤1. 核酸提取（1）称取1g干酵母细胞，加入2ml 0.04mol/L NaOH溶液，研磨至匀浆状。
（2）加入4ml 0.04mol/L NaOH溶液，混匀，转移至离心管中。
（3）沸水浴加热30min，冷却后离心（2000r/min，15min）。
（4）取上清液，加入等体积的酸性乙醇溶液，混匀，静置2h。
（5）离心（2000r/min，15min），弃去上清液。
（6）加入70%乙醇洗涤沉淀，离心（2000r/min，15min），弃去上清液。
2. 核酸鉴定（1）紫外分光光度法：取适量RNA溶液，在260nm和280nm波长下测定吸光度值，计算RNA浓度。
（2）琼脂糖凝胶电泳：将提取的RNA与DNA/RNA Marker混合，加样至琼脂糖凝胶孔中，电泳（100V，30min）。
观察电泳结果，判断RNA的纯度和完整性。
五、实验结果与分析1. 紫外分光光度法测定结果显示，RNA浓度为0.5mg/ml。
2. 琼脂糖凝胶电泳结果显示，RNA条带清晰，无杂质带，表明RNA纯度和完整性良好。
核酸提取的基本步骤和原理
核酸提取的基本步骤和原理
核酸提取是从生物样本中分离和纯化核酸的过程，常用于分子生物学研究和诊断。
它的基本步骤和原理如下：
1. 样本收集：从植物、动物或微生物等样本中收集细胞，如血液、组织、细胞培养物等。
2. 细胞破碎：使用适当的缓冲溶液将细胞膜破碎，释放细胞核和细胞质中的核酸。
破碎方法可以是机械碾磨、超声波处理或酶切等。
3. 蛋白质去除：加入蛋白酶或蛋白质沉淀剂，使蛋白质凝聚成团或被酶降解，然后通过离心沉淀去除。
4. 染色体沉淀：加入沉淀剂（如高浓度盐溶液或醇），使DNA或RNA沉淀形成白色颗粒。
这一步是用于分离和富集核酸。
5. 洗涤：重悬沉淀后的核酸在洗涤缓冲溶液中，通过离心去除杂质如盐、蛋白质等。
6. 纯化：经过洗涤后，核酸溶液通过旋转膜或硅胶填充柱等纯化方法，去除残留的污染物和杂质。
7. 进一步处理：获得纯化的核酸后，可以根据实验需要进行浓缩、检测含量和质量、保存等处理。
核酸提取的原理主要基于核酸和其他细胞成分之间的物理性质和化学性质的差异。
通过破碎细胞膜释放核酸，然后利用核酸的特性和其他成分的物理性质差异，如溶解度、电荷、亲疏水性等，进行分离和纯化。
其中，核酸具有亲水性，可以通过加入沉淀剂来使其沉淀。
核酸分离与纯化技术的实验操作步骤
核酸分离与纯化技术的实验操作步骤引言：核酸分离与纯化技术是现代生命科学研究中不可或缺的重要手段。
在分子生物学研究中，分离和纯化核酸的高效率和高质量是保证实验结果准确性的关键。
本文将介绍一种常用的核酸分离与纯化技术，并详细叙述其实验操作步骤。
材料与设备准备：首先，我们需要准备以下实验材料与设备：1. 厌氧蒸馏水：用于制备实验过程中所需的缓冲液和试剂；2. 离心管：用于收集和离心样品；3. 磁力搅拌器：用于在适当温度下进行试剂反应；4. 超低温冰箱：用于保存实验动物组织和细胞样品；5. 离心机：用于离心样品以分离细胞碎片和细胞核；6. 高速离心机：用于离心样品以分离核酸；7. 离心管架：用于固定离心管，防止其在离心过程中翻倒。
实验操作步骤：一、细胞收获与裂解1. 从培养皿中收集待处理的细胞，并用无菌生理盐水洗涤一次，去除培养基残留。
2. 加入适量的细胞裂解缓冲液（含有蛋白酶抑制剂）裂解细胞，在低温条件下搅拌1-2小时。
二、细胞碎片与细胞核的分离1. 将裂解后的细胞样品离心10分钟，离心速度2000g，室温，将上清液（上清液中包含细胞碎片和核糖核蛋白等）转移到新的离心管中。
2. 将上清液进行二次离心，离心速度10000g， 10分钟，4℃。
3. 丢弃上清液中的细胞碎片，在室温下用冷蒸馏水悬浮沉淀。
三、核酸的纯化1. 向沉淀中加入适量的核酸提取试剂，充分悬浮沉淀，并在室温下搅拌5-10分钟。
2. 通过离心的方式将沉淀分离，离心速度10000g，10分钟，室温。
3. 取出上清液（富含核酸）放入离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后放置于室温下搅拌10分钟。
4. 通过离心分离异丙醇上清液和沉淀，离心速度10000g，10分钟，室温。
5. 倒掉上清液，用70%无菌酒精洗涤沉淀。
将酒精去除后，用离心机低速离心，离心速度2000g，5分钟，即可获得纯化的核酸。
结论：通过上述实验操作步骤，我们可以成功地进行核酸的分离与纯化。
核酸分离纯化的主要步骤
核酸分离纯化的主要步骤1. 什么是核酸分离纯化？嘿，大家好！今天我们来聊聊核酸分离纯化这回事。
说白了，它就是从细胞里提取出DNA或RNA的过程。
就像是把美味的汤从锅里倒到碗里，确保里面没有杂质。
咱们的细胞里有很多东西，像是蛋白质、脂类和水分，真是五花八门。
但我们只想要那个最重要的核酸，嘿，这可是一项技术活哦！2. 核酸分离纯化的主要步骤2.1 细胞裂解第一步，就是把细胞搞破。
这听起来有点狠，但其实这是必须的，像个忍者一样，咱们得悄悄潜入细胞的世界。
我们用一种叫做裂解缓冲液的东西，里面有各种化学物质，可以把细胞膜弄得稀巴烂。
想象一下，把一个坚硬的蛋壳敲开，里面的蛋黄蛋白就可以流出来啦！这时候，细胞里的东西就会全部跑出来，嘿嘿，包括咱们要找的核酸。
2.2 细胞碎片去除接下来，咱们要把那些不需要的“杂物”清理掉。
细胞里面可不是清汤挂面，咱们得把破碎的细胞膜和其它大块的东西滤掉。
这个过程可以用离心来搞定，像旋转木马一样，把重的东西甩到边上，让核酸跟着跑到上面。
然后小心翼翼地把上面的液体吸出来，这可得细心，别把宝贝也给弄丢了！2.3 核酸沉淀好啦，经过一番折腾，咱们终于把核酸从那些杂七杂八的东西里解救出来了。
可是，这时候核酸还没完美地展现出来，咱们还需要进一步把它沉淀下来。
这里就要用到乙醇或异丙醇，咱们把它们加入到提取液中，就像给核酸穿上一件漂亮的外衣。
等一会儿，核酸就会像小颗粒一样沉到瓶底，真是美得不要不要的！3. 清洗和重悬核酸3.1 清洗核酸在沉淀出核酸后，我们还得给它洗个澡，别让它沾上那些脏东西。
再加点冷的乙醇，把沉淀的核酸轻轻洗一遍，像给小狗洗澡一样，既要温柔又要彻底。
洗完后，再把它离心一遍，剩下的就会是干净的核酸，闪闪发光，简直美丽动人！3.2 重悬核酸最后一步，就是把干净的核酸放到一个适合它的环境中，让它重新“生活”起来。
咱们用合适的缓冲液把它溶解开，确保它能够活跃地工作。
就像小鸟飞回温暖的家，核酸终于回到了它该待的地方。
核酸提取与纯化
核酸提取与纯化引言核酸提取与纯化是生物学研究中常用的操作步骤之一。
核酸提取是指从生物样本中分离出DNA或RNA分子，纯化则是指将提取得到的核酸分子除去杂质，获得纯净的核酸样品。
本文将介绍核酸提取与纯化的基本原理、常用方法以及注意事项。
核酸提取原理核酸提取的基本原理是利用生物样本中DNA和RNA分子与其他组分（如蛋白质、细胞壁等）之间的化学或物理性质的差异，将核酸分子从样本中分离出来。
常见的提取方法有有机溶剂法、盐析法和离心法等。
有机溶剂法有机溶剂法是一种常用的核酸提取方法。
其原理是利用有机溶剂（如酚-氯仿混合液）与生物样本中的其他组分之间的亲和性差异，将核酸分子从样本中提取出来。
这种方法操作简单，适用于提取DNA和RNA。
具体操作步骤如下：1.准备生物样本，如细胞培养物或组织样本。
2.加入细胞裂解缓冲液，破坏细胞膜、核膜等结构，释放核酸分子。
3.加入酚-氯仿混合液，与细胞裂解液混合，形成两相体系。
4.离心分离两相，核酸分子会在有机相中分配到有机相中，而其他杂质会在水相中。
5.取出有机相，加入异丙醇或乙醇等沉淀剂，沉淀核酸分子。
6.离心沉淀，弃去上清液。
7.用乙醇洗涤沉淀，去除残留的盐和有机溶剂。
8.干燥沉淀，加入适量的去离子水溶解核酸。
盐析法盐析法是利用核酸分子与盐溶液中的离子交互作用的原理进行分离。
该方法适用于高含量的核酸样本（如DNA或RNA）。
其操作步骤如下：1.准备生物样本，如细胞裂解液。
2.加入适量的盐溶液，使盐浓度达到一定程度。
3.离心分离沉淀，核酸分子会与高浓度盐溶液结合形成沉淀，而其他杂质会在上清液中。
4.取出沉淀，用盐溶液洗涤核酸，去除杂质。
5.干燥沉淀，加入适量的去离子水溶解核酸。
离心法离心法是一种快速分离核酸的方法。
其原理是利用离心力将核酸分子从样本中沉淀下来。
离心法适用于小样本量和快速提取的情况。
具体步骤如下：1.准备生物样本，如细胞裂解液。
2.加入高盐缓冲液，增加核酸与其他组分之间的亲和性差异。
核酸分离鉴定实验报告
核酸分离鉴定实验报告核酸分离鉴定实验报告引言：核酸分离鉴定是一项重要的实验技术，广泛应用于生物学、医学和法医学等领域。
通过分离和鉴定核酸，我们可以了解生物体的基因组结构、基因表达以及遗传变异等信息，为研究生物学问题提供了有力的工具。
本实验旨在通过核酸分离鉴定的方法，对样本中的DNA进行提取、纯化和鉴定。
材料与方法：1. 实验所需材料：- 细胞样本：选择合适的生物样本，如人体组织、血液、植物叶片等。
- 细胞破碎缓冲液：含有细胞破碎酶和蛋白酶抑制剂的缓冲液。
- DNA提取缓冲液：含有离子、洗涤剂和蛋白酶的缓冲液。
- 乙酰酸：用于沉淀DNA。
- 乙醇：用于洗涤DNA。
- 离心管、离心机、恒温水浴等实验仪器。
2. 实验步骤：1）取适量的细胞样本，加入细胞破碎缓冲液，使细胞破碎释放DNA。
2）加入DNA提取缓冲液，与细胞破碎缓冲液中的DNA结合形成DNA-缓冲液复合物。
3）通过离心将DNA-缓冲液复合物沉淀到离心管底部。
4）去除上清液，加入乙酸使DNA沉淀。
5）离心沉淀，去除上清液。
6）加入乙醇洗涤DNA，去除杂质。
7）离心洗涤液，去除乙醇。
8）将离心管倒置晾干，使DNA干燥。
9）加入适量的无菌水溶解DNA。
结果与讨论：经过上述步骤，我们成功地从细胞样本中提取和纯化了DNA。
通过电泳分析，我们可以观察到DNA带状图谱，判断DNA的纯度和完整性。
在电泳图中，我们可以看到DNA分子呈现出明显的带状条带，条带的大小和形态可以反映DNA的大小和形态多样性。
同时，我们可以通过比对DNA的条带与已知DNA标准的条带，来确定DNA的分子量。
在实验过程中，我们需要注意以下几点：1. 细胞破碎缓冲液中的细胞破碎酶和蛋白酶抑制剂的浓度和作用时间要控制好，以充分破坏细胞膜并保护DNA的完整性。
2. DNA提取缓冲液中的离子浓度和pH值要适宜，以促进DNA与缓冲液的结合和沉淀。
3. 乙酸的加入量要适量，过多会导致DNA溶解，过少则不能有效沉淀DNA。
核酸分离纯化及鉴定
[键入文字]教学秘书 教研室主任 教学院长 制表日期2015-2016学年第二学期2013级临床医学八年制《基因工程实验技术》教学日历 教室安排:8号楼三楼 分子生物学实验室 （27学时） 116人第一实验室: 喻红/杜芬 (39); 第二实验室: 张百芳/汪敏(39); 第三实验室: 苗丽霞/范成鹏(38)2016年 课 程 内 容学时 4月17日 周日 1. 概述基因工程基本流程及在医学中的应用（目的基因的获取；质粒载体在基因工程中的应用；重组体的连接(重点：质粒PCR 定点突变及TA 克隆)、转化；筛选转化子的方法；原核表达体系及真核表达体系，外源基因的表达和产物分离纯化；亚克隆；基因工程与医学实践的结合; PAGE 电泳和层析技术的介绍）；2. 提供细菌A 液提取的质粒DNA 经PCR 定点诱变后的产物纯化溶液；提供T 载体Kit ，进行连接反应；3. 制备含Amp 的LB 固体培养平皿；4. 提供感受态DH5a ，将重组连接后的DNA 溶液转化、Amp 平板铺菌，培养过夜（<18h,下午开始做）（周一课间来观察转化结果：Amp 筛选平板上的单菌落，或-4度密封保存平板至下周六）5. 提供小量液体培养过夜的细菌B 液；转新锥形瓶，液体培养3-4h 后加IPTG 1mM 诱导表达（5h ），收集诱导后的菌体沉淀（诱前0.5ml 两管，诱后1ml 两管和3-4ml 的若干管，用于目标蛋白的纯化）6. 重组质粒DNA 的质粒提取及限制性内切酶双酶切图谱的鉴定（周日下午做，过夜，周一转存-20度冰箱）；9 4月23日 周六 1. 原核表达体系中GST 融合蛋白的诱导表达及鉴定：先进行SDS-PAGE 的灌制凝胶；再将诱导前后的菌体蛋白，进行SDS-PAGE 检测外源蛋白的诱导表达水平；2. Western Blotting 鉴定特异蛋白的表达水平（SDS-PAGE （第一块胶）、转膜、封闭、I 抗（抗GST-Ab ）孵育过夜）；3. 外源GST 融合蛋白的分离纯化（介绍层析技术；上午开始做）：诱导后的细菌沉淀采用溶菌酶法裂解细菌（>1h ），Glu-Agarose beads 亲和层析法分离纯化GST 融合蛋白（提供50 ul beads ，Ep 管离心洗涤法，每班共10组），4. SDS-PAGE 鉴定GST 融合蛋白纯化（下午跑第二块胶，考马斯亮蓝染色>0.5h ，漂洗脱色过夜）9 4月24日 周日 1.酶切目的DNA 片段的非变性PAGE 鉴定 2.Western blotting （续）：洗膜、II 抗孵育1~2 h ，漂洗、DAB 显色。
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DNA的鉴定
一、紫外法测DNA的纯度及浓度 原理：
组成核酸的嘌呤嘧啶碱基均有紫外吸收特性，最
大吸收峰在260nm，这是紫外测定核酸的基础。蛋
白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集
中在230nm处。OD值为1时相当于大约50μg/ml双链 DNA 。通过测定A260和A280的比值可估算核酸的纯
真核DNA提取的主要步骤
真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都 可以用来制备基因组DNA。 温和裂解细胞，溶解DNA，使DNA与组蛋白分离； 采用化学或酶学方法去除蛋白质、RNA及其他 大分子。
外周血白细胞DNA的提取
原理
（NaI法）
利用双蒸水低渗溶胀红细胞及白细胞膜，释放出血
红蛋白及细胞核，NaI破核膜并有效解离DNA-蛋白质复合
5.
室温下放臵16h或65℃放臵1h, 可加快基因组DNA沉淀的溶 解。
核酸的鉴定与分析
紫外分光光度法可用于确定核酸的浓度及纯度。 核酸的分级分离。层析技术及凝胶电泳法，凝胶电泳 分离法分制备型和分析型，根据分离核酸片段的大小 可选择不同参数或条件的琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝 胶电泳。 核酸杂交技术用于鉴别某个特定的片段。 多聚酶链反应（polymerase chain reaction, PCR） 对目的基因进行DNA序列分析及鉴定 。 DNA测序 基因表达分析（RNA详细结构和数量的分析）
8.
小心弃异丙醇（或乙醇），于室温敞口放臵直至可 见的痕量液体挥发殆尽。
加50μl TE缓冲液溶解DNA, 以琼脂糖凝胶电泳鉴 定或-20℃保存。
9.
【注意事项】
1.
标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用Ep管、滴头 等用品及ddH2O、试剂等应高压灭菌，操作尽量在4℃以下进 行。 混匀试剂、吸取上清液等操作时应避免动作剧烈。
核酸凝胶电泳
核酸是带均匀负电荷的分子，在电场中向正极移 动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致 相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别 很小，难以分开。以适当浓度的凝胶介质作为电 泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和 构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到 分离的目的，此为分离、鉴定和纯化核酸片段的 标准方法。
5.
6.
STEP 5
Water phase (DNA) proteins precipitate chloroform /isoamyl alcohol (lipids) Water phase(DNA)
7.
小心弃去上清，再加37%异丙醇（或70%乙醇）1 ml(勿摇动)，离心14000rpm×12min.
DNA的琼脂糖凝胶电泳
原理
DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子 筛效应向正极移动过程中, 因DNA分子的大小及构 象差别而呈现迁移位臵上的差异，对于线形DNA分 子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反 比。电泳时加溴化乙锭（EB），其与DNA结合形成 一种荧光络合物，在254－365nm紫外线照射下可 产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。
核酸的分离纯化和鉴定
核酸包括DNA、RNA，在细胞中都与蛋白质结合 而存在。 分离纯化核酸总的原则 :
1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研究核酸 结构和功能的基础； 减少化学、物理、生物因素对核酸的降解： 避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏； 避免机械剪切力以及高温煮沸； 抑制DNase或RNase的活性； 2、排除蛋白质、脂类、糖类等分子的污染。
1.
取新鲜抗凝血100μl臵Ep管中, 离心10000rpm×1 min。
2.
3. 4.
弃上清，加ddH2O 200μl, 摇匀20s。
加6mol/L NaI 200μl, 缓慢倒臵摇匀20s。
于管内加氯仿/异戊醇(24:1)400μl, 缓慢颠倒混匀两相， 离心10 000rpm×10min。 吸取上层水相350μl臵一新Ep管中，加纯异丙醇200μl, 混匀。 室温放臵15min, 离心14 000rpm×12min。
度。紫外法仅用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸
溶液。
操作
取15μl DNA样品于3ml双蒸水中，分别于260、280、230nm处比色并 记录。 定量分析： DNA＝A260×核酸稀释倍数(3000/15)×50/1000 =10×A260(ug/ul) 纯度分析： DNA A260/A280=1.8 A260/A280>1.8，有RNA杂质，用RNase消化； A260/A280<1.7,有杂蛋白，重复抽提纯化步骤; A260/A230<2.0，可能有盐未除尽。 注：此法不能区分DNA和RNA，不能用于核酸粗制品的测定。
物，使核酸处于易提取状态， 再以氯仿/异戊醇抽提 （蛋白质变性沉淀并溶解脂类，异戊醇可减少抽提过程 中的泡沫产生），离心后DNA存在于上层水相中，以37% 异丙醇沉淀及洗涤DNA，即获得白细胞DNA。用此法提取 的DNA可用于Southern 杂交、PCR的模板等。
【试剂】
1．6 mol/L NaI
2．氯仿/异戊醇(24:1 V/V)混合液，应在棕色密封瓶中 保存。
3．异丙醇（isopropanol）(A.R)
4．37% 异丙醇或70%乙醇
5．双蒸水(ddH2O) (高压灭菌)
6．TE缓冲液 (pH 8.0) (10 mmol/L Tris-Cl、1 mmol/L EDTA) 高压灭菌。
操作步骤
2. 3. 4.
弃去异丙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNA丟失。
0.54-1倍的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA， 但对5SRNA、tRNA及多糖不产生沉淀。一般不需在低温条件 下长时间放臵。其缺点是易使盐类与DNA共沉淀；在DNA沉 淀中的异丙醇难以挥发除去，所以常规需要70%乙醇漂洗 DNA沉淀物。
【试剂与材料】
1．5×TBE缓冲液(pH 8.3)：54 g Tris碱, 27.5 g硼酸, 20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH8.0), 加水至1 L。 2．0.5×TBE缓冲液 (pH 8.3) 3．溴化乙锭(EB)： 5 mg/ml