核酸分离与纯化

沉淀（质
粒DNA溶于上清液中） 取上清液
无水乙醇沉淀质粒DNA 70％乙醇洗涤
质粒DNA
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二、质粒DNA的回收 提取纯化的质粒DNA
凝胶电泳 回收
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第四节 RNA的分离与纯化
rRNA 80~85% tRNA 15~20% 总RNA mRNA 1~5%
待测DNA标记 四组独立反应体系 针对某一种碱基进行切割
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三、 DNA测序自动化 DNA自动测序仪，凝胶电泳、数据收集、
序列分析均自动化。 原理：四组反应体系均含有dNTP和
ddNTP及一种荧光标记的引物，并且四组反应 体系的引物用不同颜色的荧光染料标记。
oligo (dT)-纤维素液相结合离心法
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第五节 DNA测序
❖ 主要方法: 双脱氧末端终止法 Maxam-Gilbert化学降解法 DNA自动化测序
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一、双脱氧末端终止法
原理： 模板：单链DNA（待测序的DNA） 酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 引物：5｀端标记的寡核苷酸链 底物：dNTP(AGCT)
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聚丙烯酰胺凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳
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二、DNA片段的回收
(一) 原则与要求
1.提高DNA片段的回收率
2.除去回收DNA样品中的污染
(二) 回收方法：
1.DEAE纤维素膜插片电泳法 琼脂糖凝胶
2.电泳洗脱法
3.压碎与浸泡法
聚丙烯酰胺凝胶
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第三节 质粒DNA的提取与纯化
一、提取与纯化
基本过程：
细菌培养
细菌裂解
提取质粒
1.提取方法： 碱裂解法 煮沸裂解法
SDS裂解法 2.纯化方法：
氯化铯-溴化乙锭等密度梯度超速离心法（CsCI-EB法） 聚乙二醇沉淀法
14Байду номын сангаас
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裂解细胞 pH12.0~12.6 细胞蛋白质、染色体变性
释放质粒DNA
调pH中性
质粒DNA恢复天然结构 高浓度盐
小量分装保存
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第二节 基因组DNA的分离与纯化
一、分离与纯化的方法
1.酚抽提法:
EDTA 裂解缓冲液 SDS 裂解细胞
蛋白酶K
RNA酶
pH8.0的Tris饱和酚抽提 醋酸铵、无
水乙醇沉淀
70％乙醇洗涤 DNA
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2.DNA样品的进一步纯化 方法: 透析、层析、电泳、选择性沉淀
mRNA 一、RNA制备的条件与环境
RNase 注意：1.细胞外RNase的污染
2. 抑制细胞内RNase
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措施：1.洁净的实验室 2.戴手套与口罩 3.一次性的实验材料和新包装的试剂 4.玻璃器皿用DEPC处理 5.冰浴条件下进行操作
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二、总RNA的分离与纯化
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第一节核酸分离与纯化的基本过程
一、材料与方法 1.材料：血液、尿液、唾液、组织、培养细胞
2.方法： 保证核酸一级结构的完整性
原则 排除其他分子的污染，保证样品的纯度
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二、技术路线 1.核酸的释放 破碎细胞，释放核酸 方法：机械法 破坏线性DNA 非机械法 2.核酸的分离与纯化 大分子污染物 污染物 非需要的核酸分子 对后续实验有影响的溶液和试剂
① DNA的保存 pH 影响DNA稳定性 pH7.0~8.0 EDTA 减少二价金属离子 氯仿 防止细菌污染 温度 低温 -70℃ 保存数年 4 ℃保存
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② RNA的保存 a 0.3mol／L的醋酸钠或双蒸水，-70℃～-80 ℃。若加入RNA酶抑制剂可延长保存时间。 b 将RNA沉淀溶于70％乙醇溶液或去离子的 甲酰胺溶液中，-20 ℃可长期保存。
ddNTP(AGCT)
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反应体系：四组独立的反应体系 每组均含有dNTP(AGCT) ddNTP(一种)
操作： 1.获得标记片段组 2.电泳 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 3.显影 4.读序
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二、Maxam-Gilbert化学降解法
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②纯度鉴定 a 紫外分光光度法： 测A260／A280的比值判断是否有蛋白质污染 （为什么） A260／A280比值为1.8，纯DNA A260／A280比值为2.0, 纯RNA b 荧光光度法：用溴化乙锭为染料示踪核 酸电泳结果判断纯度
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③完整性鉴定：用溴化乙锭为染料示踪核酸 电泳结果判断完整性。 2）核酸的保存
❖ 核酸是分子生物学实验的主要研究对象， 许多分子生物学实验的第一步都要进行 核酸的提取，如PCR、基因测序及分子 克隆等.
❖ 提取核酸的种类:真核细胞基因组DNA、 质粒DNA、总RNA及mRNA
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❖ 提取的核酸样品的完整性和纯度直接 关系到最后实验的结果
❖ 鉴定技术 : 分光光度技术:样品定量、纯度鉴定 凝胶电泳技术:样品定量、纯度鉴定 分子量测定 、分离核酸片段
（异）硫氰酸胍-酚氯仿一步法
硫氰酸胍+β-巯基乙醇 裂解细胞 pH4.0
酚／氯仿抽提裂解溶液
异丙醇沉淀
75％乙醇洗涤
RNA
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三、mRNA的分离与纯化
细胞内mRNA特点：含量少 种类多 分子大小不一
mRNA结构特点：多聚腺苷酸尾（polyA） 方法：oligo(dT)-纤维素柱层析法
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3.核酸的浓缩、沉淀与洗涤 浓缩: 沉淀：有机溶剂沉淀法 原理： 洗涤：用70％～75％乙醇去除沉淀中的盐
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4、鉴定与保存 1.）核酸的鉴定 浓度、纯度、完整性 ①浓度鉴定 a 紫外分光光度法 260nm 在标准条件下，1个吸光度单位相当于 50g/ml的双链DNA 38g/ml的单链DNA或RNA 33g/ml的单链寡聚核苷酸 b 荧光光度法 荧光染料：溴化乙锭 发出橙红色荧光