核酸的分离与分析
核酸的提取与鉴定实验报告
核酸的提取与鉴定实验报告一、实验目的1、掌握从生物样本中提取核酸（DNA 或 RNA）的基本原理和方法。
2、学习使用各种试剂和仪器进行核酸提取的操作步骤。
3、了解核酸鉴定的常用方法及其原理。
4、培养实验操作技能和科学研究的严谨态度。
二、实验原理核酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），是生物体遗传信息的携带者。
核酸提取的基本原理是利用细胞裂解液将细胞破碎，使核酸释放出来，然后通过一系列的物理和化学方法将核酸与其他细胞成分分离，最后得到纯度较高的核酸样品。
DNA 提取常用的方法有酚氯仿抽提法、盐析法等。
酚氯仿抽提法是利用酚和氯仿的混合液去除蛋白质，然后通过乙醇沉淀得到 DNA。
盐析法是利用高浓度的盐使蛋白质变性沉淀，从而分离出 DNA。
RNA 提取常用的方法有异硫氰酸胍法、Trizol 法等。
Trizol 法是基于异硫氰酸胍和酚的作用，能够有效地裂解细胞并抑制 RNA 酶的活性，从而提取出完整的 RNA。
核酸鉴定的方法主要有紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法等。
紫外分光光度法通过测定核酸在 260nm 和 280nm 处的吸光度值（A260 和 A280）来评估核酸的纯度和浓度。
A260/A280 的比值在 18 20 之间表示 DNA 纯度较高，在 19 21 之间表示 RNA 纯度较高。
琼脂糖凝胶电泳法则是根据核酸分子在电场中的迁移率不同来分离和鉴定核酸，DNA 分子在琼脂糖凝胶中迁移距离与分子量大小成反比，RNA 通常会呈现出 28S、18S 和 5S 三条带。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的动物组织（如肝脏、肌肉等）或培养的细胞。
大肠杆菌菌液。
2、实验试剂细胞裂解液（含蛋白酶 K）。
酚氯仿混合液（酚：氯仿＝ 1:1）。
无水乙醇、75%乙醇。
3M 醋酸钠（pH 52）。
Trizol 试剂。
异丙醇。
RNA 酶抑制剂。
琼脂糖。
50×TAE 电泳缓冲液。
核酸染料（如 EB 或 GelRed）。
核酸的提取与鉴定实验报告
核酸的提取与鉴定实验报告核酸的提取与鉴定实验报告引言：核酸是生命的基础，它存在于细胞的核内，承载着遗传信息的传递和表达。
在现代生物学研究中，核酸的提取与鉴定是非常重要的实验步骤。
本实验旨在探究核酸提取的方法以及鉴定核酸的质量和纯度。
一、核酸提取方法核酸的提取方法有多种，本实验采用了常用的酚-氯仿法。
首先，将待提取的细胞或组织样品加入细胞裂解液中，通过离心将细胞碎片沉淀下来。
然后，使用酚和氯仿进行提取，酚层中含有核酸和脂质，氯仿层中含有蛋白质。
通过离心将酚层和氯仿层分离，进一步提取纯净的核酸。
二、核酸的鉴定1. 纯度检测核酸的纯度是指核酸溶液中核酸与其他杂质的比例。
常用的纯度检测方法有比色法和光谱法。
本实验中使用了光谱法，即通过测量核酸溶液的吸光度来评估其纯度。
纯度越高，吸光度比值（A260/A280）越接近1.8。
实验结果显示，所提取的核酸样品的纯度在可接受范围内。
2. 浓度测定核酸的浓度是指单位体积核酸溶液中核酸的含量。
浓度测定常用的方法有比色法和荧光法。
本实验中采用了比色法，即通过比较核酸溶液的吸光度与标准曲线的关系来确定核酸的浓度。
实验结果显示，所提取的核酸样品的浓度为Xμg/μl。
3. 碱基组成分析核酸的碱基组成是指核酸中腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）的相对含量。
碱基组成分析可以通过核酸测序技术来完成。
本实验中使用了Sanger测序技术，通过测序结果可以确定所提取核酸的碱基组成。
4. 凝胶电泳分析凝胶电泳是一种常用的核酸分析方法，可以根据核酸的大小和电荷来分离核酸。
本实验中使用琼脂糖凝胶电泳，将提取的核酸样品与DNA分子量标准品一同加载到琼脂糖凝胶槽中，通电分离。
通过观察凝胶上的DNA条带，可以初步判断核酸的大小和纯度。
结论：通过本实验，我们成功提取了核酸样品，并进行了一系列的鉴定实验。
通过纯度检测、浓度测定、碱基组成分析和凝胶电泳分析，我们确定了所提取核酸的质量和纯度。
核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述
核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述一、核酸的分离纯化技术1.超声破碎法超声破碎法是一种通过超声波的振动作用破碎细胞膜，释放细胞内的核酸分子的方法。
该方法操作简便，效果较好。
2.酚-氯仿提取法酚-氯仿提取法是一种经典的核酸提取方法，通过酚和氯仿相间重复萃取的方法，将细胞或组织中的核酸分子提取到有机相中，然后用酒精沉淀。
3.离心沉淀法离心沉淀法是利用不同物质在不同离心力下沉降速度的不同，将核酸从其他组分中分离出来的方法。
可通过高速离心使核酸沉淀到底部，将上清液中的其他杂质倒掉，最后用缓冲液重悬核酸。
4.配对离心法配对离心法是利用核酸的碱基配对性质，在特定的条件下使目标DNA 与特异性探针配对，然后通过离心将核酸-探针复合物从其他杂质中分离出来。
这种方法常用于核酸的富集和寡核苷酸修饰位点的分析。
二、核酸的鉴定技术1. 紫外-可见分光光度法（UV-Vis）紫外-可见分光光度法是通过核酸分子在紫外光或可见光波长范围内的吸收特性来确定其存在和浓度的方法。
根据核酸中含有的吸收波长为260 nm处的碱基特征吸光峰，可以判断核酸的纯度和浓度。
2.电泳分析法电泳分析法是通过核酸分子在电场中的迁移速率和特定条件下的尺寸分离效应来分析核酸的方法。
主要包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方法。
核酸经电泳后可以观察到DNA或RNA在凝胶中的特征性带状图案，确定其分子大小、纯度和带电性。
3.PCR（聚合酶链式反应）PCR是一种常用的核酸鉴定技术，通过特定引物和聚合酶的作用，在体外进行核酸的扩增以达到检测目的。
PCR可用于快速检测目标DNA的存在与否，以及定性和定量分析。
4.基因测序技术基因测序技术是指利用测序反应将核酸序列信息转化为比特（通常指二进制），然后通过计算机软件分析的方法对核酸序列进行鉴定。
常用的基因测序技术有dideoxy测序和串联反应测序。
三、应用核酸的分离纯化及鉴定技术广泛应用于生物医学研究、遗传学、分子生物学、基因工程和疾病诊断等领域。
核酸的分离纯化
（4）精胺
精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。
原理是： 精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝 缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质 杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。
2.3.3 核酸沉淀的温度和时间
低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。 影响以后的实验。一般使用0℃冰水，1015min， DNA样品足可达到实验要求。
贮存液浓度（mol/L)
1 3 (pH5.2) 3 (pH5.2) 10 5 8
终浓度(mol/L)
0.01 0.3 0.3 2.5 0.2 0.8
2.3.2 有机沉淀剂
（1）乙醇
优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易 挥发除去，不影响以后实验。 缺点： 需要量大，一般要求低温操作。
（2）异丙醇
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核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.1.1 —级结构还决定其高级结构的形式以及 和其他生物大分子结合的方式。
1.1.2 分离核酸原则：
1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
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2.4
核酸的浓度测定
2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、 琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml 。 结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度 相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
核酸的分离与纯化
2.DAPI （4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚）染色反应 DAPI 为一种荧光染料，可以穿透扰乱的细胞膜与细胞核中的双链 DNA结合而发挥标记的作用，粘附在DNA双螺旋的小沟区，可以产生 比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要 高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞 标记的效率高(几乎为100 %) ，且对活细胞无毒副作用。DAPI染色常 用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。 DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。 DAPI-DNA复合物的激发和发射波长分别为360nm和460nm
1.核酸的变性
核酸在某些物理或化学因素的作用下，其空
间结构发生改变，从而引起理化性质的改变及生 物活性的降低或丧失。
使氢键断裂，破
坏碱基堆集力，从
而引起核酸二级结 构的破坏。
2.核酸的降解 核酸的降解是指多核苷酸链的磷酸二酯键的断裂 （1）RNA的降解 在稀碱溶液中能降解生成单核苷酸的混合物， 在高温浓碱下可降解生成核苷和磷酸。在低温酸性条件下稳定，在 高温酸性条件下降解成碱基或者嘌呤碱基和嘧啶单核苷酸的混合物。 RNA在Rnase和磷酸二酯酶等的作用下，降解成3 ‘或5 ’-单核 苷酸。 （2）DNA的降解 在稀碱溶液中较稳定，但在较高浓度的碱溶液中 高温处理会降解产生单核苷酸，且嘌呤和嘧啶碱基常有破坏。在低 温的酸性条件下也比较稳定，但在高温时降解生成嘌呤碱基和嘧啶 核苷酸。 DNA在Dnase、磷酸二酯酶等的作用下。降解成3 ‘或5 ’-脱氧 核糖核苷酸。
原核生物
真核生物
70S
80S
30S 50S 40S 60S
RNA的分子结构
mRNA
第六章核酸的分离与纯化
三、鉴定、保存与应用
（一）核酸的鉴定
1．浓度鉴定核酸浓度的定量鉴定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。
（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，最大吸收波长在250nm～270nm之间。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收波长不变。由核苷酸组成核酸后，其最大吸收波长为260nm，该物理特性为测定溶液中核酸的浓度奠定了基础。在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度大约相当于50µg/ml的双链DNA，38µg/ml的单链DNA或单链RNA，33µg/ml的单链寡聚核苷酸。如果要精确定量已知序列的单链寡核苷酸分子的浓度，就必须结合其实际分子量与摩尔吸光系数，根据朗伯-比尔定律进行计算。若DNA样品中含有盐，则会使A260的读数偏高，尚需测定A310以扣除背景，并以A260与A310的差值作为定量计算的依据。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25µg/ml的核酸溶液。
2．纯度鉴定紫外分光光度法还是荧光光度法，均可用于核酸的纯度鉴定。
核酸的分离
核酸的分离
1. 酚-氯仿抽提法：这是一种传统的核酸分离方法，常用于从细胞或组织中提取 DNA。
该方法利用酚和氯仿的混合物来溶解细胞膜和蛋白质，而核酸则不溶于其中。
通过离心和萃取步骤，可以将核酸与其他成分分离开来。
2. 离心柱法：离心柱法是一种快速、简便的核酸分离方法。
它使用特殊的离心柱，其中填充了吸附核酸的树脂或膜。
将细胞或组织裂解物加载到离心柱上，通过离心和洗涤步骤，核酸可以选择性地结合到柱子上，而其他杂质被洗去。
3. 磁珠法：磁珠法利用磁性颗粒来结合核酸。
这些磁珠通常表面修饰有特定的探针或抗体，可以与目标核酸结合。
通过外加磁场，可以将结合了核酸的磁珠从混合物中分离出来。
4. 凝胶电泳：凝胶电泳是一种基于分子量差异的核酸分离方法。
它将核酸样品加载到琼脂糖凝胶中，并在电场作用下分离不同大小的核酸片段。
通过电泳后的染色或荧光标记，可以检测和分离特定大小的核酸。
5. 色谱法：色谱法包括亲和层析、离子交换层析和尺寸排阻层析等技术，可以根据核酸的物理和化学性质进行分离。
这些方法通常用于纯化和分离特定类型的核酸。
无论使用哪种核酸分离方法，都需要注意操作的准确性和实验条件的控制，以确保获得高质量的核酸样品。
核酸分离是许多分子生物学和遗传学研究的基础步骤，对于后续的分析和应用非常重要。
核酸分离纯化方法
核酸分离纯化方法
核酸分离纯化方法包括以下几种常用方法：
1. 酚酸法（Phenol-Chloroform Extraction）：通过酚酸混合液溶解蛋白质，然后进行醚抽提，可分离出核酸。
该方法通常用于大量样品的纯化。
2. 高盐法（Salt Precipitation）：通过加入高浓度盐溶液，如氯化钠，使核酸在低温下形成沉淀，然后离心分离。
3. 硅胶柱法（Silica Column）：将核酸样品通过硅胶柱，利用硅胶对核酸的亲合性，使核酸固定在柱中，通过洗脱剂洗脱纯化的核酸。
4. 钠离子交换柱法（Sodium Ion Exchange Column）：利用柱内载体对核酸的亲合性，在一定的钠离子浓度下，核酸与载体结合，通过洗脱缓冲液洗脱纯化的核酸。
5. 凝胶电泳法（Gel Electrophoresis）：利用电场作用，将核酸样品在凝胶上进行分离和纯化。
根据核酸的大小，可选择琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。
核酸的分离和纯化
琼脂糖凝胶电泳操作注意细节
1） 根据片段大小配制不同浓度的胶（改变分辨率），片段越小， 需要胶浓度越大。 2） 胶要现制先用 3） 选择合适的Marker 4） 配胶的缓冲液与电泳缓冲液要是同一种，且浓度一致（1倍） 5） 点样时要加入loading buffer，并注意，不要将样点到点样 孔之外（飘样），也不要将胶戳漏（漏样） 6） 根据片段大小及电泳检测目的，选择合适的电压及电泳时间 7）EB染色。
检测原理：
溴化乙锭（EB）可插入双链DNA分子中， 在紫外光照射下，发射荧光。
EB: 先染与后染
核酸凝胶电泳技术
溴化乙锭染料的化学结构及 其 对 DNA 分 子 的 插 入 作 用 。 由于插入了溴化乙锭分子， 在紫外光照射下，琼脂糖凝 胶 电 泳 中 DNA 的 条 带 便 呈 现 出荧光，易于鉴定。
琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的 能力
凝胶类型及浓度 （bp）
分离DNA的大小范围
0.3%琼脂糖
50 000~1 000
0.7%琼脂糖
20 000~1 000
1.4%琼脂糖
6 000~300
4.0%聚丙烯酰胺
1 000~100
10.0%聚~1
琼脂糖凝胶电泳的原理
rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列， 特别是28S和18S特征性条带是电泳鉴定总 RNA纯度和完整性的重要参数。
3、 琼脂糖凝胶电泳
• 3. 1 原理： • 3. 2 用途：
琼脂糖凝胶电泳的原理
DNA电泳迁移：电荷效应＋分子筛效益
（1）DNA带负电，电场中，向正极移动； （2）决定移动速度三因素：DNA大小，电荷数，构 型（超螺旋 > 线性 > 开环）； （3） 线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成 反比（分子量越大，跑得越慢）；
核酸分离鉴定_实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握核酸分离与鉴定的原理和方法。
2. 了解核酸的组成和结构。
3. 学会使用实验仪器和试剂，进行核酸的分离与鉴定。
二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，包括DNA和RNA。
DNA主要存在于细胞核中，负责遗传信息的存储和传递；RNA主要存在于细胞质中，参与蛋白质的合成和调控。
核酸的分离与鉴定是分子生物学研究的基础。
核酸分离与鉴定主要包括以下步骤：1. 核酸提取：利用细胞破碎技术，将细胞内的核酸释放出来。
2. 核酸纯化：去除杂质，得到纯净的核酸。
3. 核酸鉴定：通过物理、化学或生物学方法，鉴定核酸的种类和结构。
本实验以酵母细胞为实验材料，采用碱法提取RNA，并通过紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：酵母细胞2. 试剂：0.04mol/L NaOH溶液、酸性乙醇溶液、琼脂糖凝胶、缓冲液、核酸染料、DNA/RNA Marker等四、实验步骤1. 核酸提取（1）称取1g干酵母细胞，加入2ml 0.04mol/L NaOH溶液，研磨至匀浆状。
（2）加入4ml 0.04mol/L NaOH溶液，混匀，转移至离心管中。
（3）沸水浴加热30min，冷却后离心（2000r/min，15min）。
（4）取上清液，加入等体积的酸性乙醇溶液，混匀，静置2h。
（5）离心（2000r/min，15min），弃去上清液。
（6）加入70%乙醇洗涤沉淀，离心（2000r/min，15min），弃去上清液。
2. 核酸鉴定（1）紫外分光光度法：取适量RNA溶液，在260nm和280nm波长下测定吸光度值，计算RNA浓度。
（2）琼脂糖凝胶电泳：将提取的RNA与DNA/RNA Marker混合，加样至琼脂糖凝胶孔中，电泳（100V，30min）。
观察电泳结果，判断RNA的纯度和完整性。
五、实验结果与分析1. 紫外分光光度法测定结果显示，RNA浓度为0.5mg/ml。
2. 琼脂糖凝胶电泳结果显示，RNA条带清晰，无杂质带，表明RNA纯度和完整性良好。
核酸的检测实验报告
一、实验目的1. 了解核酸的基本概念和特性。
2. 掌握核酸提取、纯化及检测的方法。
3. 学会使用紫外分光光度计进行核酸定量分析。
二、实验原理核酸是生物细胞中重要的生物大分子，包括DNA和RNA。
DNA主要存在于细胞核中，RNA主要存在于细胞质中。
核酸的检测方法主要包括提取、纯化和定量分析。
1. 提取：通过化学或物理方法将核酸从细胞或其他生物材料中分离出来。
2. 纯化：去除提取过程中产生的杂质，提高核酸的纯度。
3. 定量分析：通过紫外分光光度计测定核酸的浓度。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌细胞、提取缓冲液、乙醇、RNAase抑制剂等。
2. 仪器：紫外分光光度计、离心机、电子天平、移液器、研钵、试管等。
四、实验步骤1. 核酸提取（1）将大肠杆菌细胞加入提取缓冲液中，充分振荡混匀。
（2）将混匀后的细胞溶液转移至离心管中，离心5分钟，弃去上清液。
（3）向离心管中加入等体积的70%乙醇，充分混匀。
（4）再次离心5分钟，弃去上清液。
（5）将沉淀用少量提取缓冲液溶解，转移至新的离心管中。
2. 核酸纯化（1）向含有核酸的离心管中加入等体积的70%乙醇，充分混匀。
（2）离心5分钟，弃去上清液。
（3）将沉淀用少量RNAase抑制剂溶液溶解，转移至新的离心管中。
3. 核酸定量分析（1）使用紫外分光光度计测定核酸溶液的吸光度。
（2）根据标准曲线计算核酸浓度。
五、实验结果与分析1. 核酸提取：通过观察离心管中的沉淀，可判断核酸是否成功提取。
2. 核酸纯化：通过观察离心管中的沉淀，可判断核酸是否成功纯化。
3. 核酸定量分析：根据标准曲线，计算核酸浓度。
六、实验讨论1. 在核酸提取过程中，注意细胞破碎程度，以确保核酸充分释放。
2. 在核酸纯化过程中，注意去除杂质，提高核酸纯度。
3. 在核酸定量分析过程中，注意标准曲线的制作和吸光度的测定。
七、实验结论通过本实验，成功提取、纯化和定量分析了大肠杆菌细胞中的核酸。
实验结果表明，核酸提取、纯化和定量分析方法在生物研究领域具有重要意义。
核酸分离鉴定实验报告
核酸分离鉴定实验报告核酸分离鉴定实验报告引言：核酸分离鉴定是一项重要的实验技术，广泛应用于生物学、医学和法医学等领域。
通过分离和鉴定核酸，我们可以了解生物体的基因组结构、基因表达以及遗传变异等信息，为研究生物学问题提供了有力的工具。
本实验旨在通过核酸分离鉴定的方法，对样本中的DNA进行提取、纯化和鉴定。
材料与方法：1. 实验所需材料：- 细胞样本：选择合适的生物样本，如人体组织、血液、植物叶片等。
- 细胞破碎缓冲液：含有细胞破碎酶和蛋白酶抑制剂的缓冲液。
- DNA提取缓冲液：含有离子、洗涤剂和蛋白酶的缓冲液。
- 乙酰酸：用于沉淀DNA。
- 乙醇：用于洗涤DNA。
- 离心管、离心机、恒温水浴等实验仪器。
2. 实验步骤：1）取适量的细胞样本，加入细胞破碎缓冲液，使细胞破碎释放DNA。
2）加入DNA提取缓冲液，与细胞破碎缓冲液中的DNA结合形成DNA-缓冲液复合物。
3）通过离心将DNA-缓冲液复合物沉淀到离心管底部。
4）去除上清液，加入乙酸使DNA沉淀。
5）离心沉淀，去除上清液。
6）加入乙醇洗涤DNA，去除杂质。
7）离心洗涤液，去除乙醇。
8）将离心管倒置晾干，使DNA干燥。
9）加入适量的无菌水溶解DNA。
结果与讨论：经过上述步骤，我们成功地从细胞样本中提取和纯化了DNA。
通过电泳分析，我们可以观察到DNA带状图谱，判断DNA的纯度和完整性。
在电泳图中，我们可以看到DNA分子呈现出明显的带状条带，条带的大小和形态可以反映DNA的大小和形态多样性。
同时，我们可以通过比对DNA的条带与已知DNA标准的条带，来确定DNA的分子量。
在实验过程中，我们需要注意以下几点：1. 细胞破碎缓冲液中的细胞破碎酶和蛋白酶抑制剂的浓度和作用时间要控制好，以充分破坏细胞膜并保护DNA的完整性。
2. DNA提取缓冲液中的离子浓度和pH值要适宜，以促进DNA与缓冲液的结合和沉淀。
3. 乙酸的加入量要适量，过多会导致DNA溶解，过少则不能有效沉淀DNA。
提取核酸的方法及原理
提取核酸的方法及原理
提取核酸的方法有以下几种：
1. 碱裂解法：将细胞或组织样本加入含有氢氧化钠或EDTA的缓冲液中，使细胞或组织中的蛋白质、脂质等被丧失活性，然后用氯仿酚提取法将核酸从碱裂解液中分离出来。
2. 酚/氯仿法：将细胞或组织样本加入含有酚和氯仿的缓冲液中，酚在高pH条件下能溶解蛋白质，氯仿用于分离酚的上清液和有机相，进而分离出核酸。
3. 乙醇沉淀法：将核酸溶液中加入适量的醋酸钠和乙醇，使核酸从溶液中析出，然后通过离心沉淀收集纯化的核酸。
4. 硅基法：利用硅基质具有与核酸亲和性的特点，将核酸结合到硅基上，然后通过洗脱等步骤来分离纯化核酸。
这些方法的原理是基于核酸与其他有机物质（如蛋白质、脂质）的不同性质，在不同环境条件下发生反应，从而达到分离和纯化核酸的目的。
其中，碱裂解法和酚/氯仿法通过改变样本的pH值和溶剂的成分，使核酸与其他物质发生相互作用，然后通过沉淀或上清液的分离来分离核酸。
乙醇沉淀法则是利用核酸与乙醇相互作用，形成可沉淀的复合物，然后通过离心沉淀收集纯化的核酸。
硅基法利
用硅基质与核酸的亲和性，将核酸定向结合到硅基上，然后通过洗脱等步骤分离纯化核酸。
核酸的分离与识别实验报告
核酸的分离与识别一、实验原理分离提纯核酸的主要过程，一般先要经过以下几个步骤：①细胞组织的破碎；②解聚核蛋白并使蛋白质变性；③除去蛋白质和多糖等杂质；④抽提和沉淀核酸等。
破碎细胞的方法有物理法（如超声波、匀浆和组织捣碎等）、化学和生化的方法（如去污剂、蛋白质变性剂和溶菌酶等）。
本实验采用组织捣碎的方法，捣碎之前加入柠檬酸钠抑制DNA降解酶的作用。
在细胞核内，核酸通常是与某些组织蛋白质结合成复合物——核糖核蛋白（RNP）和脱氧核糖核蛋白（DNP）形式存在的，利用在0.14mol/L盐溶液中RNP溶解而DNP溶解度最小的性质将两者分开。
另外，DNP能溶于水和高浓度盐溶液。
在核酸提纯的过程中，除去蛋白质是很关键的一步。
要除去蛋白质首先是使核蛋白解聚和蛋白质变性，常用的方法有：浓盐法（10%NaCI）、去污剂和有机溶剂法等。
本实验中，1.71mol/L的NaCl使蛋白质变性，而后用氯仿抽提除去蛋白质。
利用氯仿-异戊醇解聚分离蛋白质，从而分离DNA和蛋白质。
经上述分离纯化处理后的核酸盐溶液，再利用其不溶于有机溶剂的性质，使其在适当浓度的亲水有机溶剂（如乙醇）中成絮状沉淀析出。
二、仪器试剂(1)主要仪器电动组织捣碎机、大容量离心机、冰箱、具塞磨口玻璃锥形瓶、真空干燥器、烧杯等。
(2)主要试剂NaCI(0.1mol/L)、pH=7.0柠檬酸钠混合盐溶液(0.05mol/L)、NaCI溶液(1.71mol/L)、氯仿-异戊醇溶液(体积比为24:1)、95%乙醇、无水乙醇等。
三、实验步骤、现象与结果实验操作实验目的实验现象(1)猪脾细胞核的提取取猪肝40克，冰浴迅速剪成小块。
加80mL0.1mol/L NaCl和0.05mol/L、pH=7.0的柠檬酸钠混合液，在组织捣碎机内，用慢档捣碎3次，每次5s，间隔30s。
上述匀浆液以转速300/mim离心20min，收集沉淀(含细胞核)，弃去上清液。
冰浴猪肝或猪脾可以起到防止变质的作用，搅拌捣碎起到破坏细胞组织，使DNP释放出来。
核酸的分离原理
核酸的分离原理核酸的分离原理主要包括物理法和化学法两类。
物理法包括电泳法、超离心法和温度梯度法；化学法包括酚-氯仿法、酒精沉淀法、盐沉淀法和硅基法等。
以下将分别详细介绍这些分离原理。
一、电泳法：电泳法是核酸分离中最常用的物理法，它的原理基于核酸的电荷特性。
核酸在电场中的运动速度与其大小和形状相关。
电泳法主要分为凝胶电泳、溶液电泳和毛细管电泳等。
凝胶电泳是将熔融状态下的琼脂糖或琼脂糖-琼脂糖乳胶混合物浇注在平板或离心管中凝固成胶状，然后将样品装入孔洞中，施加电场使核酸在胶状基质中移动。
根据核酸的分子量大小，可以采用不同浓度的凝胶来进行分离。
溶液电泳是将核酸样品直接溶解于缓冲液中，然后直接进行电泳。
这种方法在分离小分子核酸片段时非常常用。
毛细管电泳是将核酸样品注入毛细管中，然后利用电场进行分离。
这种方法的优势在于分离速度快，分辨率高。
二、超离心法：超离心法是通过离心作用，根据核酸在高速离心过程中的沉淀速度和分子量大小的不同，来实现核酸的分离。
该方法可分为差速离心和密度梯度离心两种。
差速离心是通过离心机产生离心力，使核酸按照沉淀速度的不同进行分离。
这种方法可以根据核酸的分子量大小来调节离心时间和离心速度，进而实现分离。
密度梯度离心是通过在离心管中制备离心液，使其密度呈梯度分布。
样品在离心过程中，根据核酸的密度与离心液的密度对比，核酸会沉淀在合适的密度梯度处，从而进行分离。
三、温度梯度法：温度梯度法是一种物理分离方法，利用DNA在升温和降温过程中的变性和重绕特性实现核酸分离。
样品经过热变性后，再经过慢降温或快速冷却，核酸会根据其序列和长度在一定温度范围内恢复特定的空间结构，从而进行分离。
四、酚-氯仿法：酚-氯仿法是一种化学分离方法，通过DNA与酚和氯仿在酸性pH条件下形成两相体系，从而实现核酸的分离。
酚主要是通过溶解蛋白质沉淀，而氯仿则用于去除酚。
五、酒精沉淀法：酒精沉淀法是一种常用的化学分离方法，可以将核酸从溶液中沉淀。
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大分子物质得以分离并在保留于凝胶中，在不同位置形成
条带。
• 电泳迁移率的大小与物质的带电量与分子量的比值（荷质
比）相关。
• 在中性pH或碱性缓冲液中，核酸分子骨架上的磷
酸基团在水中的解离带有负电荷，在电场中由负极 向正极迁移。
• 在均一的凝胶网络中，核酸的迁移速率只与分子的
注意，任何DNA样品或实验试剂均应仔细避免发生污染，
确保实验结果的准确、可靠。
二、PCR反应体系与条件优化
标准的PCR反应体系： 50μl ~100μl体积，包括：模板DNA，底物（dNTP），Taq DNA聚合酶（2.5U），2条引物（各0.25μmol/L），KCl（50
mmol/L），Tris· HCl（10 mmol/L，pH8.4），MgCl2（1.5
• 双链DNA分子在临近沸点的温度下便会分离成两条单链的
DNA分子，当温度降低时，DNA聚合酶以单链DNA为模板并 利用反应混合物中的引物和四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）
合成新生的DNA互补链。
循环1 温度（℃） 94 72 60 60℃ 退 火 （ 1min） 室温下开始 72℃ 延 伸 （ 1.5min）
第三章 核酸的分离与分析
第一节 核酸的分离纯化
一、核酸分离提取的原则与要求 二、核酸提取的主要步骤 三、质粒DNA的分离纯化 四、基因组DNA的制备 五、RNA的提取 六、核酸的定量
一、核酸分离提取的原则要求
• 总的原则：
保证核酸一级结构的完整性， 防止降解，排除其它分 子的污染。
如：防止核酸酶，特别是RNase的污染， 又如：提取DNA分子时，应去除RNA分子，反之亦然。
质粒DNA、RNA以及蛋白质等，
可在离心管内不同位置形成区带。 RNA可与Cs+结合，因此密度最
大，沉积管底，蛋白质漂浮于液
面上。
四、基因组DNA的制备
• 基因组DNA分子量大，受热易变性，复性困难，受剪切力
作用易断裂，因此要采用较温和的条件和方法。如SDS加上 蛋白酶K温和裂解方法。
• 杂蛋白质的去除可用酚/氯仿萃取法。对植物基因组可能需
• PCR引物通常长15~25碱基，其中G＋C约占50%。 • 引物之间不能互配形成双链结构，引物内部也不能形成发夹结构。 • 引物的3’末端必须与目的片段完全相配。 • 引物的5’末端可以不与目的片段互补，可以包含内切酶位点或启动子序
列，但在下一轮反应中，这些序列会被同样合成。
（2）引物Tm
• 加热可以打开双链结构，当一半分子为单链而另外一半分
子仍处于双链状态时的温度称为该双链DNA的熔解温度，
即Tm。由于G· C碱基对间的氢键数较A· T碱基对间的多，故
G· C含量高的DNA的Tm值也较高。
• PCR反应中引物浓度一般为0.1~0.5μmol/L，引物浓度偏高
会引起错配和非特异性产物扩增，同时会增加引物之间形
二聚体的几率。
6. PCR反应条件的选择
3. 分离纯化核酸 关键步骤是去除蛋白质，还要避免核酸的降解。 酚/氯仿抽提法： 酚、氯仿: 两种不同的蛋白质变性剂。氯仿还能加速有机相
与液相分层，去除植物色素和蔗糖。
异戊醇: 减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。
水相 （ DNA 、 小 分 子 RNA ） 细胞破碎 酚/氯仿 界面（絮状 蛋白质沉淀） 有机相（色 素、脂类、 糖类）
——利用质粒分子量小和闭合环状超螺旋结构性质。
• 分离方法：碱裂解法、煮沸法、去污剂（Triton/SDS）裂解
法、CsCl-EB（氯化铯-溴乙锭）密度梯度平衡离心法、羟基
磷灰石柱层析法等。
1. 碱裂解法：
小量制备DNA较好的方法。
基本原理：在碱性pH（12-12.5）下，DNA分子 均变性，恢复中性时，线性染色体DNA由于两条链 分开且基因组分子量大，单链互相无规则缠绕，不 能准确复性而沉淀；质粒DNA分子因紧密缠绕在一
大小相关，使不同分子量者分开，而相同分子量聚
集形成条带。
一、琼脂糖凝胶电泳
• 琼脂糖凝胶作为电泳基质有如下优点：①形成的凝
胶具有大量微孔，其孔径尺寸取决于它的浓度，如 0.75%琼脂糖的孔径为800 nm，1%琼脂糖孔径为
150nm；②透明，无紫外吸收；③无毒，热熔冷凝，
制胶方便；④热可逆性，具有一定强度。
循环2
循 环 3…
94℃ 变 性 （ 1min）
时间（
• PCR扩增能力是十分惊人的，理论上讲经过30次的循环反
应，便可使靶DNA得到109倍的扩增，但实际上大约是 106~107倍的扩增。
• 正因为PCR技术具有如此高的扩增敏感性，意味着分子生物
学分析只需要含有痕量DNA的样品，包括一根头发、血迹 等。这对于法医学鉴定具有特别的应用价值。同时，应当
六、核酸的定量
• 核酸定性定量分析是指导核酸分离纯化的重要手段。 • 常见的方法：紫外分光光度法、荧光分光光度法。
紫外分光光度法
• 核酸的最大吸收波长是260nm，吸收波谷在230nm。 • 根据测定，在波长260nm时，1 OD值的光密度相当于双链
DNA浓度为50μg／mL；单链DNA或RNA为40μg／mL；单链
• PCR反应中，dNTP浓度应在20~200μmol/L，高浓度dNTP可
加快反应速度，但同时会增加碱基的错误掺入率和实验成
本；低浓度dNTP虽会导致反应速度下降，但可提高实验的
精确性。4种dNTP在使用时必须以等当量浓度配制，以减 少错配误差。此外，由于dNTP可能与Mg2+结合，因此应注
意二者浓度之间的关系。
要注意的是糖类的除去，可选用十六烷基三甲基溴化铵
（CTAB）选择性沉淀RNA或DNA，也可用四或三甲基溴化铵
（TEAB）加上50%乙醇沉淀多糖。
五、RNA的提取
• 细胞中的rRNA、tRNA和mRNA不容易完全分开，可先制得
细胞核、线粒体、核糖体等细胞器和细胞质，然后再从中
分离某一类RNA。
• mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一、含量少、易降解，
mmol/L），明胶或牛血清白蛋白（BSA）（1μg/ml）。
1. PCR反应模板
• （1）种类：可来自任何生物的单链或双链DNA，也可以是
用化学方法合成的。
• （2）数量：一般而言，PCR检测可以用纳克（ng）级的
DNA克隆模板或微克（μg）级的基因组DNA，或者是拷贝数 为105的目的DNA片段。
块法、冻融法、玻璃奶法、QIAEX法等。
• DEAE纤维素膜插片法简便易行，回收率、纯度都很高，对回收
500bp~5kb左右大小的DNA片段效果很好。电泳洗脱法对大于5kb的
DNA片段较适合。冻融法、SDS溶液浸出法等方法都极为简便，但纯度
与回收率较差。
• 将低熔点琼脂糖挖块与玻璃奶法结合，可回收到质量较好的DNA片段。
寡核苷酸为20μg／mL。可以此来计算核酸样品的浓度，检
测最低限为0.5~1.0μg／mL。
• 通过测定在260nm和280nm的紫外吸收值的比值来估计核
酸的纯度。
DNA的比值为1.8，RNA的比值为2.0。若A样品的比值高 于1.8，说明其中的RNA尚未除尽，比值小于1.8则说明残留 酚或蛋白质。
辅助因子。反应体系中许多成分都结合Mg2＋，包 括引物、模板、PCR产物和dNTP。通常，Mg2＋的 总浓度必须超过dNTP的总浓度。在一般的PCR反应
中，1.5~2.0 mmol/L Mg2＋是比较合适的（对应
dNTP浓度为200 μmol/L左右）。
3. 底物（脱氧核糖核苷三磷酸，dNTPs）浓度
• 该凝胶孔径小、透明、弹性好、无紫
聚丙烯酰胺 浓度（%）
3.5 5.0 8.0
有效分离范围 （bp）
100~1000 80~500 60~400
外吸收，可用于DNA、蛋白质等的分离。
12.0
20.0
40~200
10~100
三、凝胶电泳分离后核酸片段的回收及纯化
• 方法：电泳洗脱法、DEAE纤维素膜插片法、低熔点琼脂糖凝胶电泳挖
荧光分光光度法
• DNA、RNA本身并不产生荧光，但在荧光染料溴化
乙锭（EB）嵌入碱基平面之间后，DNA样品在紫外 线照射激发下，可以发出红色荧光，其荧光强度与
核酸含量成正比。由此可建立标准曲线，测定未知
样品的浓度。
第二节 核酸的凝胶电泳
• 电泳：是利用带电荷物质的电场中的迁移速率的不同而将
其分离的方法。
分离较为困难。可利用寡聚脱氧胸苷酸（oligo dT)亲和色谱
柱分离。
• RNA的提取要点：
①样品细胞或组织的有效破碎； ②核蛋白复合体变性解离，释放出RNA；
③对R中分离； ⑤多糖含量高的样品还要采取措施有效去除多糖杂质。 最关键的是抑制RNA酶的活性。
起，能准确复性而留于上清溶液中。
2.煮沸法 利用DNA加热变性原理，结合不同DNA复性的差异进 行分离。复性的超螺旋质粒DNA分子以溶解状态存在液相
中，通过高速离心（12,000 × g）可实现分离。
适于快速提取质粒 DNA并进行鉴定，也适用于大量提 取，对纯度要求高的，可做进一步纯化处理。
3. CsCl-EB密度梯度平衡离心 CsCl是一种大分子量的重金属 盐，长时间超速离心时，在管中 形成1～1.8052g/cm3自上而下 增加的密度梯度。染色体DNA、
二、核酸提取的主要步骤
1. 样品准备 2. 细胞破碎 3. 分离纯化核酸
4.核酸的沉淀浓缩
1. 样品准备 新鲜动植物组织材料：清洗、去掉杂质。少量样品可用液 氮冻结，然后快速碾磨成粉未状。
动物细胞：胰酶消化，离心沉淀，PBS液漂洗，收集沉淀