核酸的分离与纯化

2.DAPI （4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚）染色反应 DAPI 为一种荧光染料，可以穿透扰乱的细胞膜与细胞核中的双链 DNA结合而发挥标记的作用，粘附在DNA双螺旋的小沟区，可以产生 比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要 高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞 标记的效率高(几乎为100 %) ，且对活细胞无毒副作用。DAPI染色常 用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。 DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。 DAPI-DNA复合物的激发和发射波长分别为360nm和460nm
1.核酸的变性
核酸在某些物理或化学因素的作用下，其空
间结构发生改变，从而引起理化性质的改变及生 物活性的降低或丧失。
使氢键断裂，破
坏碱基堆集力，从
而引起核酸二级结 构的破坏。
2.核酸的降解 核酸的降解是指多核苷酸链的磷酸二酯键的断裂 （1）RNA的降解 在稀碱溶液中能降解生成单核苷酸的混合物， 在高温浓碱下可降解生成核苷和磷酸。在低温酸性条件下稳定，在 高温酸性条件下降解成碱基或者嘌呤碱基和嘧啶单核苷酸的混合物。 RNA在Rnase和磷酸二酯酶等的作用下，降解成3 ‘或5 ’-单核 苷酸。 （2）DNA的降解 在稀碱溶液中较稳定，但在较高浓度的碱溶液中 高温处理会降解产生单核苷酸，且嘌呤和嘧啶碱基常有破坏。在低 温的酸性条件下也比较稳定，但在高温时降解生成嘌呤碱基和嘧啶 核苷酸。 DNA在Dnase、磷酸二酯酶等的作用下。降解成3 ‘或5 ’-脱氧 核糖核苷酸。
原核生物
真核生物
70S
80S
30S 50S 40S 60S
RNA的分子结构
mRNA
mRNA是蛋白质生物合成的模板，单链，大小不一。 原核生物和真核生物的mRNA在结构上有所不同： 1) 原核生物的mRNA是多顺反子的，真核生物的mRNA 是单顺反子的；
2) 原核mRNA 5 '端无帽子结构，真核mRNA 5 '端有一段 帽子结构（m7GpppNmpNmp-）；
5.核酸的紫外吸收
嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收紫外 光。在260nm处有最大吸收峰。对于纯的DNA或 RNA，可以通过测得A260来推测其核酸含量。
A260/ A280值可以反映核酸的纯度。
纯的DNA：A260/ A280 =1.8 纯的RNA：A260/ A280 =2.0
6.核酸的变性、降解与复性
携带、转移aa 原核生物：细胞质 真核生物：75%在细胞质、 蛋白质合成的模 m RNA RNA 15%在线粒体和叶 板 绿体、10%在细胞 核糖体的主要成 核 r RNA 分 t RNA
核酸组成
核糖 戊糖
脱氧核糖
核苷
核苷酸
磷酸
碱基
嘌呤 嘧啶
戊 糖
核酸组成
核苷
戊糖第1位碳原子上的羟基与嘌呤的第9位氮原子 或与嘧啶的第1位氮原子形成的b型N-C糖苷键。
3) 原核mRNA 3 ’端无PolyA，真核mRNA 3 ’端有PolyA。
2.核酸的一般理化性质
DNA —— 白色纤维状固体，溶液中粘度很高
RNA —— 白色粉末状固体
微溶于水 不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂 RNA核蛋白体(RNP)易溶于0.14mol/L的NaCl溶液 DNP可溶于高浓度(1~2mol/L)的NaCl溶液
3.核酸的复性
变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的 链重新缔合成为双螺旋结构，此过程成为复性。
退火：热变性的DNA在缓慢冷却的条件下的复性过程。
减色效应：当变性的DNA经复性以重新形成双螺旋结构时，其溶液的A260值则 减小，这种现象称为减色效应。
7.核酸的颜色反应
1.与EB （溴化乙锭）的荧光反应 EB可嵌入到核酸碱基对之间，使EB-核酸络合物的荧光强度比游离EB显著 增加达80-100倍。在一定条件下，一定浓度的EB溶液的荧光增强与核酸双链 区的浓度成正比。根据这个原理，可测定双链核酸的浓度。RNA的分源自结构三叶草形tRNA
四环：二氢尿嘧啶环（D环）、反密码环、
额外环、TC环
四臂：二氢尿嘧啶臂、反密码臂、氨基酸臂TC臂
倒L型：一端是-CCA，另一端是反密码子环。
RNA的分子结构
rRNA
细胞RNA中rRNA含量最高，是构成核糖体 的骨架，占核糖体质量的2/3 。 核糖体 rRNA 16S 23S、5S 18S 28S、5S、5.8S
1’
核酸组成
核苷酸的衍生物
核苷酸除了作为核酸的基本结构单元外，它们在机 体中还行使着许多重要的生理功能。 能量分子：ATP、GTP 第二信使：cAMP 辅酶：FAD、NADH、CoA
DNA一级结构

无分枝的长链。
具有方向性。两个末端分别为5'端和3'端。 在天然DNA中，5'端常为磷酸，3'端为游离羟基。 由糖-磷酸相互间隔连接，构成主链；碱基连接 在主链的核糖上，形成侧链。
碱基堆积力：碱基堆积成非极性的区域，相互间产
生疏水作用和范德华力 离子键
DNA三级结构
1）环状DNA分子 双螺旋扭曲而形成麻花状的超螺旋结构。
2）线状DNA分子 双螺旋与蛋白质结合 后扭曲盘绕而形成螺 旋的超螺旋结构。
RNA的分子结构
不同类型的RNA 分子可自身回折形成发卡、 局部双螺旋区，形成二级结构，并折叠产生三级结 构。 tRNA的二级结构为三叶草形（四环四臂）， 三级结构为倒L 形。 mRNA 则是把遗传信息从DNA 转移到核糖体 以进行蛋白质合成的载体。
核酸的分离纯化概 述
前 言
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
1.核酸的结构
核酸分类
种类 DNA
分 布
功能
原核生物：核质区 真核生物：95%在细胞核，5% 遗传信息的载体 在线粒体和叶绿体
3.核酸中糖的颜色反应 含有核糖的RNA，在3价铁离子存在条件下，与浓盐酸及地衣酚一起 沸水浴中加热20-40min左右，产生绿色化合物。这是由于RNA脱嘌呤后 的核糖与酸作用生成糠醛，再与地衣酚作用显绿色。 DNA在酸性条件下与二苯胺一起水浴加热5min，生成蓝色化合物。 这是由于脱氧核糖遇酸生成-w-羟基-γ-酮基戊醛，再与二苯胺反应而显 蓝色。
DNA二级结构
DNA的二级结构是指DNA的双螺旋结构。
DNA的双螺旋模型是由Watson和Crick两位科学
家于1953年提出的。
1962
1962 1962
1928Harvard University
1916-2004 Cambridge
1916-2004 London
DNA二级结构 作用力
互补碱基之间的氢键
3.核酸的两性解离性质
核酸既含有酸性的磷酸基团，又含有弱碱性
的碱基，故可发生两性解离。其解离状态随溶液
的pH值而改变。 利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液 的pH来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。
4.核酸的旋光性
核酸分子具有高度不对称性，故核酸具有旋 光性，旋光方向为右旋，这是核酸的一个重 要特性。当核酸变性时，比旋度大大降低。