核酸的分离与纯化

1’
核酸组成
核苷酸的衍生物
核苷酸除了作为核酸的基本结构单元外，它们在机 体中还行使着许多重要的生理功能。 能量分子：ATP、GTP 第二信使：cAMP 辅酶：FAD、NADH、CoA
DNA一级结构
百度文库
无分枝的长链。
具有方向性。两个末端分别为5'端和3'端。 在天然DNA中，5'端常为磷酸，3'端为游离羟基。 由糖-磷酸相互间隔连接，构成主链；碱基连接 在主链的核糖上，形成侧链。
3) 原核mRNA 3 ’端无PolyA，真核mRNA 3 ’端有PolyA。
2.核酸的一般理化性质
DNA —— 白色纤维状固体，溶液中粘度很高
RNA —— 白色粉末状固体
微溶于水 不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂 RNA核蛋白体(RNP)易溶于0.14mol/L的NaCl溶液 DNP可溶于高浓度(1~2mol/L)的NaCl溶液
原核生物
真核生物
70S
80S
30S 50S 40S 60S
RNA的分子结构
mRNA
mRNA是蛋白质生物合成的模板，单链，大小不一。 原核生物和真核生物的mRNA在结构上有所不同： 1) 原核生物的mRNA是多顺反子的，真核生物的mRNA 是单顺反子的；
2) 原核mRNA 5 '端无帽子结构，真核mRNA 5 '端有一段 帽子结构（m7GpppNmpNmp-）；
2.DAPI （4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚）染色反应 DAPI 为一种荧光染料，可以穿透扰乱的细胞膜与细胞核中的双链 DNA结合而发挥标记的作用，粘附在DNA双螺旋的小沟区，可以产生 比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要 高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞 标记的效率高(几乎为100 %) ，且对活细胞无毒副作用。DAPI染色常 用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。 DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。 DAPI-DNA复合物的激发和发射波长分别为360nm和460nm
3.核酸的复性
变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的 链重新缔合成为双螺旋结构，此过程成为复性。
退火：热变性的DNA在缓慢冷却的条件下的复性过程。
减色效应：当变性的DNA经复性以重新形成双螺旋结构时，其溶液的A260值则 减小，这种现象称为减色效应。
7.核酸的颜色反应
1.与EB （溴化乙锭）的荧光反应 EB可嵌入到核酸碱基对之间，使EB-核酸络合物的荧光强度比游离EB显著 增加达80-100倍。在一定条件下，一定浓度的EB溶液的荧光增强与核酸双链 区的浓度成正比。根据这个原理，可测定双链核酸的浓度。
3.核酸中糖的颜色反应 含有核糖的RNA，在3价铁离子存在条件下，与浓盐酸及地衣酚一起 沸水浴中加热20-40min左右，产生绿色化合物。这是由于RNA脱嘌呤后 的核糖与酸作用生成糠醛，再与地衣酚作用显绿色。 DNA在酸性条件下与二苯胺一起水浴加热5min，生成蓝色化合物。 这是由于脱氧核糖遇酸生成-w-羟基-γ-酮基戊醛，再与二苯胺反应而显 蓝色。
RNA的分子结构
三叶草形
tRNA
四环：二氢尿嘧啶环（D环）、反密码环、
额外环、TC环
四臂：二氢尿嘧啶臂、反密码臂、氨基酸臂TC臂
倒L型：一端是-CCA，另一端是反密码子环。
RNA的分子结构
rRNA
细胞RNA中rRNA含量最高，是构成核糖体 的骨架，占核糖体质量的2/3 。 核糖体 rRNA 16S 23S、5S 18S 28S、5S、5.8S
5.核酸的紫外吸收
嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收紫外 光。在260nm处有最大吸收峰。对于纯的DNA或 RNA，可以通过测得A260来推测其核酸含量。
A260/ A280值可以反映核酸的纯度。
纯的DNA：A260/ A280 =1.8 纯的RNA：A260/ A280 =2.0
6.核酸的变性、降解与复性
1.核酸的变性
核酸在某些物理或化学因素的作用下，其空
间结构发生改变，从而引起理化性质的改变及生 物活性的降低或丧失。
使氢键断裂，破
坏碱基堆集力，从
而引起核酸二级结 构的破坏。
2.核酸的降解 核酸的降解是指多核苷酸链的磷酸二酯键的断裂 （1）RNA的降解 在稀碱溶液中能降解生成单核苷酸的混合物， 在高温浓碱下可降解生成核苷和磷酸。在低温酸性条件下稳定，在 高温酸性条件下降解成碱基或者嘌呤碱基和嘧啶单核苷酸的混合物。 RNA在Rnase和磷酸二酯酶等的作用下，降解成3 ‘或5 ’-单核 苷酸。 （2）DNA的降解 在稀碱溶液中较稳定，但在较高浓度的碱溶液中 高温处理会降解产生单核苷酸，且嘌呤和嘧啶碱基常有破坏。在低 温的酸性条件下也比较稳定，但在高温时降解生成嘌呤碱基和嘧啶 核苷酸。 DNA在Dnase、磷酸二酯酶等的作用下。降解成3 ‘或5 ’-脱氧 核糖核苷酸。
携带、转移aa 原核生物：细胞质 真核生物：75%在细胞质、 蛋白质合成的模 m RNA RNA 15%在线粒体和叶 板 绿体、10%在细胞 核糖体的主要成 核 r RNA 分 t RNA
核酸组成
核糖 戊糖
脱氧核糖
核苷
核苷酸
磷酸
碱基
嘌呤 嘧啶
戊 糖
核酸组成
核苷
戊糖第1位碳原子上的羟基与嘌呤的第9位氮原子 或与嘧啶的第1位氮原子形成的b型N-C糖苷键。
核酸的分离纯化概 述
前 言
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
1.核酸的结构
核酸分类
种类 DNA
分 布
功能
原核生物：核质区 真核生物：95%在细胞核，5% 遗传信息的载体 在线粒体和叶绿体
碱基堆积力：碱基堆积成非极性的区域，相互间产
生疏水作用和范德华力 离子键
DNA三级结构
1）环状DNA分子 双螺旋扭曲而形成麻花状的超螺旋结构。
2）线状DNA分子 双螺旋与蛋白质结合 后扭曲盘绕而形成螺 旋的超螺旋结构。
RNA的分子结构
不同类型的RNA 分子可自身回折形成发卡、 局部双螺旋区，形成二级结构，并折叠产生三级结 构。 tRNA的二级结构为三叶草形（四环四臂）， 三级结构为倒L 形。 mRNA 则是把遗传信息从DNA 转移到核糖体 以进行蛋白质合成的载体。
3.核酸的两性解离性质
核酸既含有酸性的磷酸基团，又含有弱碱性
的碱基，故可发生两性解离。其解离状态随溶液
的pH值而改变。 利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液 的pH来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。
4.核酸的旋光性
核酸分子具有高度不对称性，故核酸具有旋 光性，旋光方向为右旋，这是核酸的一个重 要特性。当核酸变性时，比旋度大大降低。
DNA二级结构
DNA的二级结构是指DNA的双螺旋结构。
DNA的双螺旋模型是由Watson和Crick两位科学
家于1953年提出的。
1962
1962 1962
1928Harvard University
1916-2004 Cambridge
1916-2004 London
DNA二级结构 作用力
互补碱基之间的氢键