第十章核酸的分离和纯化
核酸的分离与纯化
核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多 糖、脂肪等生物大分子分开。 在分离核酸时，应遵循两个原则：一是保 证核酸一级结构的完整性；二是尽量排除 其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。
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核酸分离与纯化的过程一般都包括了材料 的选择、核酸的释放、核酸与其它生物大 分子的分离、核酸的纯化与鉴定、核酸的 浓缩、保存等几个主要步骤。 每一步骤又可由多种不同的方法单独或联 合实现。
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5. 质粒DNA的纯化
（1）聚乙二醇沉淀法 质粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子 RNA，并用RNase消化小分子RNA；然 后在高盐条件下，用PEG选择性地沉淀大 的质粒DNA；沉淀的质粒DNA进一步用 酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。
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（2）柱层析法 柱层析法纯化质粒DNA的关键是其填充的树脂。 树脂可分为两类：一类是利用疏水的相互作用来 纯化质粒DNA样品；一类则通过离子交换与吸附 的相互作用进行纯化。 以硅基质作为填充材料的柱层析，其作用原理是 在多盐条件下，依靠DNA与硅基质的可逆性结合 来进行纯化。通过暴露的磷酸盐残基，DNA吸附 到硅基质上，以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖 类等生物大分子，然后加入TE或水溶液使DNA 分子重新水合，并通过离心洗脱出来。
在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以
减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保
持分相的稳定性。
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为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生 自由基，如果直接用于DNA分离，会使磷酸二 酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过 高温重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl饱和酚， 并调节至中性。使用饱和酚可以减少酚吸收更 多的DNA，降低DNA的损失率。
核酸的分离与纯化.
使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉 红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如 醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验， 因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 (2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时 应戴手套。
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2.3 核酸的沉淀
沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点：
DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
（3）聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
(1） 金属离子螯合剂：
DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因 此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。 如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉； (2） 阴离于型表面活性剂：
如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还 能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷 的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电 吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非 极性的范德华力。
分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合 的蛋白质分开，同时避免核酸降解。
2.2.1 加入浓盐溶液（如NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力， 使氢键破坏，核蛋白解聚；
2.2.2 加入SDS
SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还 具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
简述核酸分离纯化的主要步骤
简述核酸分离纯化的主要步骤核酸分离纯化的主要步骤其实就是一场与基因的“亲密接触”。
我们就像是在进行一场精密的科学“约会”，只不过对象是DNA或RNA，而不是人。
好啦，咱们来看看这个过程如何进行的吧。
1. 材料准备
1.1 样品收集
首先，你得找点样品，可能是植物、动物，甚至是细菌。
想象一下，就像挑选食材一样，你需要挑选新鲜的“原料”。
1.2 细胞裂解
接下来，咱们要“破壳”了！通过加入一些裂解缓冲液，把细胞膜弄开，释放出里面的核酸。
这个过程就像是打开一个“宝箱”，哇，里面可真丰富！
2. 去除杂质
2.1 去除蛋白质
这一步，你得用一些蛋白酶，把细胞里的蛋白质都搞定。
想象一下，就像是把不需要的东西清理出去，只留下最闪亮的宝物。
2.2 沉淀核酸
然后，咱们需要加入酒精，通常是乙醇。
核酸会跟酒精“亲密接触”，沉淀下来。
这个时候你会发现，核酸就像是被请出舞池的主角，闪闪发光！
3. 洗涤与重溶
3.1 洗涤
在沉淀后的核酸上，加点洗涤液，就像给它洗个澡，把残留的杂质都冲走。
你得小心翼翼，别让它“滑了”！。
3.2 重溶
最后一步，是把洗净的核酸重新溶解在缓冲液中。
这个过程就像是给核酸穿上新衣服，焕然一新，准备出门见客！
完成这些步骤后，你的核酸就“出炉”啦！感觉就像是一场成功的约会，满载而归。
希望这个过程能让你对核酸分离纯化有个更轻松的了解。
就这样，你成功地和基因建立了“深厚的友谊”，为后续的实验打下了良好的基础！。
核酸分离与纯化的技术路线与原则
核酸分离与纯化的技术路线与原则核酸包括DNA 、RNA两类分子，在细胞内均与蛋白质结合成核蛋白。
真核生物基因组中，95%DNA 为双链线性分子，存在于细胞核中，5%为双链环状分子，存在于细胞器中；原核生物DNA 及质粒DNA 为双链或单链环状分子；RNA 为单链线性分子，主要存在于细胞质中。
DNA 与RNA 性质的不同导致对其分离与纯化的条件也不相同。
一、核酸分离与纯化的原则(1)保证核酸一级结构的完整性。
生物的遗传信息全部贮存在核酸一级结构中，而且核酸的一级结构还决定其高级结构的形式及和其他大分子结合的方式。
所以，所提取的核酸一级结构的完整性直接影响着后续实验中对其结构与功能研究的质量。
因此，在制备核酸的过程中，要做到：尽量简化操作程序，缩短提取过程；避免过酸、过碱等化学因素对核酸链中磷酸二酯键的破坏，在pH 值4～10条件下进行操作；操作时动作要轻缓，提取的样品小包装保存，以免诸多的物理因素对核酸的降解；避免细胞内及环境中核酶对核酸的生物性降解。
(2)排除其他生物大分子的污染，如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应尽可能降低到最低程度，特别是提取DNA 分子时应除去RNA 分子，反之亦然。
(3)排除核酸样品中有机溶剂和过高浓度的金属离子。
二、分离与纯化的技术路线(一)核酸的释放通常情况下DNA 及RNA 均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是制备单个细胞，再破碎细胞，从而释放核酸。
破碎细胞的方法包括机械法与非机械法两大类。
机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法；非机械法可分为干燥法与溶胞法。
由于溶胞法采用适宜的化学试剂与酶，能有效地裂解细胞，方法温和，能保证较高的核酸获得率，并能较好地保持核酸的完整性，从而得到广泛的应用。
(二)核酸的分离与纯化利用核酸与其他物质性质上的差异，可以分离与纯化核酸。
这种差异包括细胞定位与组织分布上的差异，物理、化学性质上的不同，以及各自独特的生物学特性。
操作过程中，既可以从复杂样品中抽提出核酸分子，也可以将样品中的非核酸成分(非核酸的生物大分子、非需要的核酸分子及在操作过程中加入的溶液与试剂)逐步清除。
核酸的分离纯化(1)
Kanamycin resistance gene
Stanley Cohen & Annie Chan
Plasmi d
pSC10 1
Tetracycline resistance gene
E. coli transformed with recombinant plasmid
Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline
（五）核酸的保存
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前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
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一、核酸分离、纯化原整版课件ppt
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一把特殊的剪刀 —限制性内切酶的发现
阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)， 获1978年诺贝尔生理学和医学奖
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Herbert Boyer, Stanley Cohen 1972年获得第一 个重组DNA分子 (实现不同来源 DNA的重组)
1 意义
遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸 的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其 他生物大分子结合的方式。
2 分离核酸原则：
1）温度不要过高；
2）控制一定的pH值范围(pH值5-9);
3）保持一定的离子强度;
4）减少物理因素对核酸降解的机械剪切力.
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（二）防止核酸的生物降解
简述核酸分离纯化的主要步骤。
简述核酸分离纯化的主要步骤。
在生物实验中，核酸分离纯化可谓是一个神奇的过程，像是把“混乱的书房”整理成一间“整洁的书房”，让我们能从一堆杂乱的物质中找出我们需要的那一部分。
要想搞清楚这个过程，我们得从头说起。
先别急，跟我来，我们一块儿来聊聊这些神奇的步骤。
1. 核酸提取的开篇首先，我们得“扒拉扒拉”样品。
也就是说，要从样本里提取出核酸。
这一步就像是把原料放到面粉筛里筛选一样，我们得把细胞破坏开，释放里面的核酸。
这里用的工具有点像“万用刀”，既可以是研磨机，也可以是液氮冷冻破碎机，总之就是要让细胞壁的“防线”彻底崩溃。
像打破冰层一样，把里面的核酸暴露出来。
1.1 细胞破碎：好比“猛兽入笼”细胞破碎的过程，听起来就像是猛兽入笼，猛烈而直接。
为了完成这个步骤，我们可以使用各种各样的试剂，比如说细胞裂解液。
这个液体就像是一把万能钥匙，能把细胞膜一举撬开，释放里面的核酸。
当然，有时候我们也可以用物理手段，比如说搅拌、超声波破碎等，像摇晃沙袋一样，把核酸搞出来。
1.2 去除杂质：清除“杂草”一旦细胞壁被破坏，里面的核酸和其他成分混杂在一起。
接下来，我们要做的就是清除那些“杂草”。
这时候我们会用到一些化学试剂，比如说酚/氯仿混合液。
这些试剂像是高效的“除草剂”，能够把蛋白质和其他杂质从核酸中分离出来。
我们会把样品离心分层，这样就能把核酸分离出来。
记得，离心就像洗衣机的脱水功能，快速旋转让东西分开。
2. 核酸纯化的妙招接下来是核酸纯化的部分了。
这个过程可以说是给核酸做一个“美容”，让它看起来干净又光鲜。
纯化的方式有很多，其中最常用的是柱子纯化。
我们把样品经过特制的柱子，就像是把泥土过滤掉，把精华留下来一样。
柱子的材料有一种特殊的性质，能吸附核酸，而把其他杂质排除在外。
2.1 柱子纯化：像“过滤咖啡”柱子纯化的过程其实就像是过滤咖啡。
你把咖啡粉放到过滤纸里，然后慢慢滴下清水，最终只剩下干净的咖啡液。
类似地，我们把核酸溶液通过柱子，里面的核酸会被柱子吸附，而其他的杂质会被洗掉。
核酸的分离与纯化讲解
• 二.质粒和噬菌体DNA的提取和纯化
• （一）质粒DNA的提取 • 基本步骤 • 1.细菌的培养 • 2.细菌的收集与裂解 • 3.质粒DNA的纯化 • 提取方法
• 煮沸法： • 碱法：最常用的质粒DNA提取方法。 • SDS法：
• （二）噬菌体DNA的提取
• 1.细菌培养 • 2.细菌的感染及裂解 • 3.噬菌体的沉淀及纯化 • 4.噬菌体DNA的提取
• 图1 玻璃砂研磨提取总DNA的电泳结果
• 1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法 • 1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶
• 图2 氧化铝研磨提取总DNA的电泳结果
• 1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法 • 1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶
一、概述
• 核酸分离提取的原则 • 常用方法及基本原理 • DNA的分离纯化 • RNA的分离纯化
第一节 核酸分离提取的原则
• 一、基本原则
• 1.保证核酸一级结构的完整性。 • 2.排除其它分子的污染。
• 二、注意事项
• 1.简化操作步骤，减少对核酸的破坏。 • 2.避免过酸（碱）等化学因素的影响（pH4～10）。 • 3.减少物理因素对核酸的降解。 • 4.防止核酸的生物降解。
• ③分离浮力密度不同的DNA分子或其他分子颗粒， 如图1。
图1 氯化铯梯度纯化λ噬菌体
噬菌体在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间形成一肉眼可 见的带。在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间可看到一个 由噬菌体颗粒形成的浅蓝色带。
• ④纯化DNA分子。在中性CsCl溶液中，DNA的 浮力密度为1.7g/ml，RNA为2.0g/ml，蛋白 质的浮力密度为1.3～1.4g/ml。在起始密度 为1.7g/ml的CsCl溶液中进行超速离心，可 以很好地将三者区分开。蛋白质浮在上层液 面，DNA分子在离心管中间形成区带，RNA沉 于管底，从而达到从DNA样品中去除微量RNA 和蛋白质的目的。
核酸分离纯化方法
核酸分离纯化方法
核酸分离纯化方法包括以下几种常用方法：
1. 酚酸法（Phenol-Chloroform Extraction）：通过酚酸混合液溶解蛋白质，然后进行醚抽提，可分离出核酸。
该方法通常用于大量样品的纯化。
2. 高盐法（Salt Precipitation）：通过加入高浓度盐溶液，如氯化钠，使核酸在低温下形成沉淀，然后离心分离。
3. 硅胶柱法（Silica Column）：将核酸样品通过硅胶柱，利用硅胶对核酸的亲合性，使核酸固定在柱中，通过洗脱剂洗脱纯化的核酸。
4. 钠离子交换柱法（Sodium Ion Exchange Column）：利用柱内载体对核酸的亲合性，在一定的钠离子浓度下，核酸与载体结合，通过洗脱缓冲液洗脱纯化的核酸。
5. 凝胶电泳法（Gel Electrophoresis）：利用电场作用，将核酸样品在凝胶上进行分离和纯化。
根据核酸的大小，可选择琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。
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一、双脱氧末端终止法
原理： 模板：单链DNA（待测序的DNA） 酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 引物：5｀端标记的寡核苷酸链 底物：dNTP(AGCT)
ddNTP(AGCT)
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反应体系：四组独立的反应体系 每组均含有dNTP(AGCT) ddNTP(一种)
操作： 1.获得标记片段组 2.电泳 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 3.显影 4.读序
伤 感 青 春 的 心情说 说短语 句子推 荐
1)那 年 ， 未 来 遥远 得没有 形状， 我们单 纯得没 有烦恼 。 2)我 爱 得 发 了 疯， 还相信 我守着 就有用 ，不管 我醒着 睡着， 呼吸喝 水，哭 着笑着
都 会 觉 的 心 痛。
3)你 的 话 ， 就 像冷 冷的最 后一箭 ，我看 着，心 碎成一 片片。 4)年 少 的 爱 情 ，赌 上的是 青春， 赔上的 是一去 不返的 时光。
RNase 注意：1.细胞外RNase的污染
2. 抑制细胞内RNase
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措施：1.洁净的实验室 2.戴手套与口罩 3.一次性的实验材料和新包装的试剂 4.玻璃器皿用DEPC处理 5.冰浴条件下进行操作
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二、总RNA的分离与纯化
（异）硫氰酸胍-酚氯仿一步法
硫氰酸胍+β-巯基乙醇 裂解细胞 pH4.0
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2.DNA样品的进一步纯化 方法: 透析、层析、电泳、选择性沉淀
聚丙烯酰胺凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳
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二、DNA片段的回收
(一) 原则与要求
1.提高DNA片段的回收率
2.除去回收DNA样品中的污染
(二) 回收方法：
1.DEAE纤维素膜插片电泳法 琼脂糖凝胶
2.电泳洗脱法
3.压碎与浸泡法
聚丙烯酰胺凝胶
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第三节 质粒DNA的提取与纯化
一、提取与纯化
基本过程：
细菌培养
细菌裂解
提取质粒
1.提取方法： 碱裂解法 煮沸裂解法
SDS裂解法 2.纯化方法：
氯化铯-溴化乙锭等密度梯度超速离心法（CsCI-EB法） 聚乙二醇沉淀法
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裂解细胞 pH12.0~12.6 细胞蛋白质、染色体变性
释放质粒DNA
调pH中性
3
第一节核酸分离与纯化的基本过程
一、材料与方法 1.材料：血液、尿液、唾液、组织、培养细胞
2.方法： 保证核酸一级结构的完整性
原则 排除其他分子的污染，保证样品的纯度
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二、技术路线 1.核酸的释放 破碎细胞，释放核酸 方法：机械法 破坏线性DNA 非机械法 2.核酸的分离与纯化 大分子污染物 污染物 非需要的核酸分子 对后续实验有影响的溶液和试剂
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7
②纯度鉴定 a 紫外分光光度法： 测A260／A280的比值判断是否有蛋白质污染 （为什么） A260／A280比值为1.8，纯DNA A260／A280比值为2.0, 纯RNA b 荧光光度法：用溴化乙锭为染料示踪核 酸电泳结果判断纯度
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③完整性鉴定：用溴化乙锭为染料示踪核酸 电泳结果判断完整性。 2）核酸的保存
5
3.核酸的浓缩、沉淀与洗涤 浓缩: 沉淀：有机溶剂沉淀法 原理： 洗涤：用70％～75％乙醇去除沉淀中的盐
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4、鉴定与保存 1.）核酸的鉴定 浓度、纯度、完整性 ①浓度鉴定 a 紫外分光光度法 260nm 在标准条件下，1个吸光度单位相当于 50g/ml的双链DNA 38g/ml的单链DNA或RNA 33g/ml的单链寡聚核苷酸 b 荧光光度法 荧光染料：溴化乙锭 发出橙红色荧光
第十章 核酸的分离与纯化
1
❖ 核酸是分子生物学实验的主要研究对象， 许多分子生物学实验的第一步都要进行 核酸的提取，如PCR、基因组DNA、 质粒DNA、总RNA及mRNA
2
❖ 提取的核酸样品的完整性和纯度直接 关系到最后实验的结果
❖ 鉴定技术 : 分光光度技术:样品定量、纯度鉴定 凝胶电泳技术:样品定量、纯度鉴定 分子量测定 、分离核酸片段
了 要 溃 不 成 军。
9)有 时候 明明很 脆弱， 却刻意 假装坚 强，难 道这就 是命运 吗？看 着一朵 枯萎的 花， 还 有 一 句 未 说出的 话。
10)爱 情 ， 就 是 一个 人相信 了另一 个人的 谎言。 最 新 伤 感 青 春的心 情说说 短语句 子
1)难 过 了 ， 不 要告 诉别人 ，因为 没有人 会在乎 。 2)获 致 幸 福 的
质粒DNA恢复天然结构 高浓度盐
沉淀（质
粒DNA溶于上清液中） 取上清液
无水乙醇沉淀质粒DNA 70％乙醇洗涤
质粒DNA
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二、质粒DNA的回收 提取纯化的质粒DNA
凝胶电泳 回收
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第四节 RNA的分离与纯化
rRNA 80~85% tRNA 15~20% 总RNA mRNA 1~5%
mRNA 一、RNA制备的条件与环境
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二、Maxam-Gilbert化学降解法
待测DNA标记 四组独立反应体系 针对某一种碱基进行切割
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三、 DNA测序自动化 DNA自动测序仪，凝胶电泳、数据收集、
序列分析均自动化。 原理：四组反应体系均含有dNTP和
ddNTP及一种荧光标记的引物，并且四组反应 体系的引物用不同颜色的荧光染料标记。
酚／氯仿抽提裂解溶液
异丙醇沉淀
75％乙醇洗涤
RNA
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三、mRNA的分离与纯化
细胞内mRNA特点：含量少 种类多 分子大小不一
mRNA结构特点：多聚腺苷酸尾（polyA） 方法：oligo(dT)-纤维素柱层析法
oligo (dT)-纤维素液相结合离心法
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第五节 DNA测序
❖ 主要方法: 双脱氧末端终止法 Maxam-Gilbert化学降解法 DNA自动化测序
5)许 多 东 西 就 像风 一般， 虽然摸 不着， 但是却 能感受 到。 6)走 得 最 急 的 ，都 是最美 的风景 ;伤得最 深的， 也总是 那些最 真的感 情。
7)我 不 说 我 不 问， 并我代 表我不 在乎。 8)我 一 直 都 是 美丽 世界里 的孤儿 ，孤单 ，寂寞 ，执着 。一旦 和温暖 相遇， 便注定
① DNA的保存 pH 影响DNA稳定性 pH7.0~8.0 EDTA 减少二价金属离子 氯仿 防止细菌污染 温度 低温 -70℃ 保存数年 4 ℃保存
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② RNA的保存 a 0.3mol／L的醋酸钠或双蒸水，-70℃～-80 ℃。若加入RNA酶抑制剂可延长保存时间。 b 将RNA沉淀溶于70％乙醇溶液或去离子的 甲酰胺溶液中，-20 ℃可长期保存。
小量分装保存
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第二节 基因组DNA的分离与纯化
一、分离与纯化的方法
1.酚抽提法:
EDTA 裂解缓冲液 SDS 裂解细胞
蛋白酶K
RNA酶
pH8.0的Tris饱和酚抽提 醋酸铵、无
水乙醇沉淀
70％乙醇洗涤 DNA
11
那 年 的 青 春 ，我们 谁也没 有留住 它。下 面是美 文网小 编搜集 整理的 一些伤 感青春 的 心 情 说 说 短语句 子内容 ，希望 对你有 帮助。