6核酸的分离与纯化讲解

• 2.蔗糖密度梯度超速离心
• 可用于分离不同大小的DNA片段
• 五.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ酸的沉淀浓缩法
• 原理：核酸与 Na 、 K 、 Mg 等形成的盐在许多种有 机溶剂中不溶解，但也不会被有机溶剂变性。 • （一）核酸沉淀的盐类及浓度 • 1.NaAc：最常用，终浓度为0.3M（pH5.0） • 2.NaCl：终浓度为0.2M，除去SDS。 • 3.NH4Ac: 去除dNTP，铵盐抑制磷酸化等反应。 • 4.LiCl ：高浓度（0.8M）可直接沉淀大分子量 RNA 。抑 制反转录酶反应和翻译（蛋白合成）实验。 • 5.KAc：与NaAc相似，钾盐形式难溶于含SDS的溶液。 • 6.MgCl2 ： 对于浓度低于 0.1μg/ml或长度小于 100 个核
第六章 核酸的分离与纯化
王文君
广州中医药大学 分子生物学技术实验室免疫研究室
一、概述
• • • • 核酸分离提取的原则 常用方法及基本原理 DNA的分离纯化 RNA的分离纯化
第一节 核酸分离提取的原则
• 一、基本原则
• 1.保证核酸一级结构的完整性。 • 2.排除其它分子的污染。
• 二、注意事项
沉淀不同分子量的DNA片段。 PEG 6000 ，其使用浓 度与DNA片段的大小成反比。70%乙醇漂洗沉淀2次。
• 三、电泳法
• 凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点， 已成为分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。 常用于核酸分离的凝胶电泳主要有琼脂糖电泳 和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
• 四、超速离心法
• 根据核酸分子的物理特性如分子量、密度等的 不同，可用密度梯度超速离心的方法加以分离 纯化。
• 1.CsCl沉降平衡超速离心
• 二、层析法
• 利用物质在静止相和移动相之间分配系数的差异， 进行物质的分离和纯化的技术称为层析。层析体 系中一般由两个互相不溶的介质组成，静止相多 为固体，移动相多为液体。
• 羟磷灰石是一类特殊的层析材料，对核酸有较大的亲和 力，并在大多数条件下不吸附蛋白质和多糖，所以能纯 化核酸。双股DNA与羟磷灰石的结合较牢固，如将细胞的 溶解液流经羟磷灰石柱，然后用低浓度磷酸缓冲液流洗， 以去除RNA、蛋白质及其它物质。随即再用浓度高的磷酸 缓冲液洗脱，即可获得DNA。
• 1.简化操作步骤，减少对核酸的破坏。 • 2.避免过酸（碱）等化学因素的影响（pH4～10）。 • 3.减少物理因素对核酸的降解。 • 4.防止核酸的生物降解。
• 三. 主要步骤：
• 1.破碎细胞。 • 2.去除与核酸结合的蛋白质，多糖以及脂类等 生物大分子。 • 3. 去除其它不需要的核酸分子。 • 4. 沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质。 • 5. 核酸纯化。
• 1.交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性 剂，以增加去除蛋白杂质的效果。 • 2.氯仿与苯酚混合使用，对于RNA的提取显得更 加重要，因酚可有效变性蛋白质，但不能完全 抑制RNA酶的活性。而且酚能溶解10～15%的水， 从而溶解部分Poly（A)RNA。
• 3.氯仿能加速有机相与水相分离，去除植物 色素和蔗糖。用氯仿抽提以去除迹量酚。 • 4.用水饱和的乙醚抽提最后一次，彻底去除 迹量酚和氯仿。然后68℃水浴10分钟蒸发迹 量乙醚。 • 5.异戊醇可减少蛋白质变性操作过程中产生 气泡。
苷酸的样品，可提高核酸沉淀的回收率。
• 样品溶液中含盐浓度过高，应用TE进行稀释。
• （二）核酸的有机沉淀剂 • 1. 乙醇：沉淀DNA的首选有机溶剂。DNA沉
淀用2倍体积，RNA沉淀用2.5～3倍体积。
• 2.异丙醇：所需体积小速度快。0.54～1倍
体积。常规需用70%乙醇漂洗沉淀数次。
• 3.聚乙二醇（PEG）：可用不同浓度的PEG选择
• 酚/氯仿抽提法标准程序是：
• 酚抽提一次，酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一 次。
水相（核酸溶液） 蛋白杂质 有机相
•高速离心后的分层情况（酚/氯仿抽提法）
• 注意事项：
• 1. 一般酚是透明无色的结晶。酚结晶如呈现粉红色或 黄色，表明其中含有酚的氧化产物如醌、二酸等。变 色的酚溶液不能用于实验，因其中的酚氧化物可破坏 核酸的磷酸二酯键，并引起DNA链的交联。 • 2. 酚的水饱和：饱和酚的pH值接近8.0，可减少离心 后水酚双向的交界面上的DNA滞留；由于在酸性pH值条 件下，DNA分配于有机相，因此使用前必须对酚进行平 衡使其pH值在7.8以上。 制好的饱和酚贮于棕色瓶中4℃可保存1个月。因酚 的氧化随pH值的增高而增加，如所用平衡缓冲液的 pH值＞8及RNA的提取都应使用新鲜饱和的酚。
• CsCl沉降平衡超速离心是纯化DNA分子的主要方 法： • ①可分离CC(双链闭合环状)、OC（开环双链）、 L（线性）三种结构的DNA分子。质粒DNA的这三 种结构分子与EB结合能力不同（L>OC>CC），EB 插入DNA分子中可使其浮力密度下降，结合EB越 多、浮力密度越小。。 • ②可分离双链DNA分子的两条互补链。 • ③分离浮力密度不同的DNA分子或其他分子颗粒， 如图1。
• 核酸提取的方案，应根据具体生物材料和待提取的核 酸分子的特点而定。只有采取合适的核酸提取方法， 才可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。 下面介绍核酸分离纯化的基本方法及不同来源DNA的分 离提取方法。
第二节 分离制备核酸的常用方法及基本原理
• 一.溶解法： • 酚/氯仿抽提法的基本原理
图1 氯化铯梯度纯化λ噬菌体
噬菌体在 1.45g/ml 与 1.50g/ml 氯化铯界面之间形成一肉眼可 见的带。在 1.45g/ml 与 1.50g/ml 氯化铯界面之间可看到一个 由噬菌体颗粒形成的浅蓝色带。
• ④纯化DNA分子。在中性CsCl溶液中，DNA的 浮力密度为1.7g/ml，RNA为2.0g/ml，蛋白 质的浮力密度为1.3～1.4g/ml。在起始密度 为1.7g/ml的CsCl溶液中进行超速离心，可 以很好地将三者区分开。蛋白质浮在上层液 面，DNA分子在离心管中间形成区带，RNA沉 于管底，从而达到从DNA样品中去除微量RNA 和蛋白质的目的。