6核酸的分离与纯化讲解
《核酸的分离纯化》课件
《核酸的分离纯化》课件课程目标：1. 理解核酸分离纯化的意义和重要性。
2. 掌握核酸分离纯化的基本原理和步骤。
3. 学习核酸分离纯化的实验操作技巧。
4. 了解核酸分离纯化在科学研究和临床诊断中的应用。
第一部分：核酸分离纯化的意义和重要性1. 核酸的定义和功能核酸是生物体内携带遗传信息的分子，包括DNA和RNA。
核酸在遗传信息的传递、基因表达调控和疾病发生中起着重要作用。
2. 核酸分离纯化的意义核酸分离纯化是研究核酸结构和功能的基础。
核酸分离纯化有助于研究基因表达调控、基因突变和基因功能。
核酸分离纯化在临床诊断和疾病治疗中具有重要意义，如病原体检测、基因突变筛查和个体化治疗。
第二部分：核酸分离纯化的基本原理和步骤1. 核酸分离纯化的基本原理根据核酸的物理化学性质，如大小、电荷、亲和性和稳定性等，进行分离纯化。
常用的分离纯化方法包括离心、电泳、亲和色谱和质谱等。
2. 核酸分离纯化的基本步骤样品处理：收集含有核酸的样品，如细胞裂解、核提取等。
核酸释放：通过机械或化学方法将核酸从样品中释放出来。
核酸沉淀：通过盐析、酒精沉淀等方法将核酸从溶液中沉淀下来。
核酸洗涤：去除沉淀中的杂质，如蛋白、RNA等。
核酸纯化：通过柱层析、亲和色谱等方法进一步纯化核酸。
核酸鉴定：通过紫外线吸收、琼脂糖凝胶电泳等方法检测核酸的质量和数量。
第三部分：核酸分离纯化的实验操作技巧1. 样品处理技巧细胞裂解：使用酶或化学方法裂解细胞，释放核酸。
核提取：使用盐水或缓冲液提取核酸。
2. 核酸沉淀技巧盐析：加入高盐浓度使核酸沉淀。
酒精沉淀：加入酒精使核酸沉淀。
3. 核酸洗涤技巧离心：使用离心机去除沉淀中的杂质。
洗涤缓冲液：选择适当的洗涤缓冲液去除杂质。
4. 核酸纯化技巧柱层析：使用固定相和流动相进行核酸纯化。
亲和色谱：利用核酸与特定配体之间的亲和力进行纯化。
5. 核酸鉴定技巧紫外线吸收：测量核酸在紫外线波段的吸光度。
琼脂糖凝胶电泳：将核酸样品在琼脂糖凝胶上进行电泳，观察核酸的迁移率和条带形状。
核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述
核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述一、核酸的分离纯化技术1.超声破碎法超声破碎法是一种通过超声波的振动作用破碎细胞膜，释放细胞内的核酸分子的方法。
该方法操作简便，效果较好。
2.酚-氯仿提取法酚-氯仿提取法是一种经典的核酸提取方法，通过酚和氯仿相间重复萃取的方法，将细胞或组织中的核酸分子提取到有机相中，然后用酒精沉淀。
3.离心沉淀法离心沉淀法是利用不同物质在不同离心力下沉降速度的不同，将核酸从其他组分中分离出来的方法。
可通过高速离心使核酸沉淀到底部，将上清液中的其他杂质倒掉，最后用缓冲液重悬核酸。
4.配对离心法配对离心法是利用核酸的碱基配对性质，在特定的条件下使目标DNA 与特异性探针配对，然后通过离心将核酸-探针复合物从其他杂质中分离出来。
这种方法常用于核酸的富集和寡核苷酸修饰位点的分析。
二、核酸的鉴定技术1. 紫外-可见分光光度法（UV-Vis）紫外-可见分光光度法是通过核酸分子在紫外光或可见光波长范围内的吸收特性来确定其存在和浓度的方法。
根据核酸中含有的吸收波长为260 nm处的碱基特征吸光峰，可以判断核酸的纯度和浓度。
2.电泳分析法电泳分析法是通过核酸分子在电场中的迁移速率和特定条件下的尺寸分离效应来分析核酸的方法。
主要包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方法。
核酸经电泳后可以观察到DNA或RNA在凝胶中的特征性带状图案，确定其分子大小、纯度和带电性。
3.PCR（聚合酶链式反应）PCR是一种常用的核酸鉴定技术，通过特定引物和聚合酶的作用，在体外进行核酸的扩增以达到检测目的。
PCR可用于快速检测目标DNA的存在与否，以及定性和定量分析。
4.基因测序技术基因测序技术是指利用测序反应将核酸序列信息转化为比特（通常指二进制），然后通过计算机软件分析的方法对核酸序列进行鉴定。
常用的基因测序技术有dideoxy测序和串联反应测序。
三、应用核酸的分离纯化及鉴定技术广泛应用于生物医学研究、遗传学、分子生物学、基因工程和疾病诊断等领域。
医学课件-核酸的分离与纯化
课程背景
化学组成
核酸是由核苷酸构成的，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两种。
结构特征
DNA的双螺旋结构以及RNA的单链结构是核酸的典型结构特征。
核酸简介
获得高纯度核酸
提高核酸检测灵敏度
研究和开发需求
分离与纯化的目的
02
核酸的分离
将生物样品处理成匀浆或细胞裂解液，以便释放其中的核酸。
要点一
要点二
自动化和智能化
未来的核酸分离和纯化技术将更加注重自动化和智能化，能够实现自动化操作、减少人为误差和增加批量化生产的能力。
应用领域的拓展
随着生命科学和医学的不断发展和进步，核酸分离和纯化技术的应用领域也将不断拓展，将会有更多的应用场景和用途被发现和应用。
要点三
谢谢您的观看
THANKS
xx年xx月xx日
医学课件-核酸的分离与纯化
CATALOGUE
目录
引言核酸的分离核酸的纯化核酸的鉴定实验方案设计总结与展望
01
引言
核酸是生物体内的重要遗传物质，对于研究基因组、基因表达、基因功能等生物学核心问题具有重要意义。
生物学研究需求
随着生物学和生物技术学的不断发展，不断有新的核酸分离与纯化方法和技术出现，推动了医学和生物医学领域的发展。
步骤
将细胞裂解后，加入酚氯仿混合液，充分混匀，离心，取上清液，再加入氯仿充分混匀，离心，取上清液，最后加入异戊醇沉淀核酸。
实验方案设计一：酚氯仿抽提法
原理
乙醇沉淀法是一种利用乙醇沉淀核酸的方法。
步骤
将细胞裂解后，加入乙醇，充分混匀，离心，弃去上清液，再加入乙醇洗涤沉淀，离心，弃去上清液，最后干燥沉淀得到核酸。
6核酸的分离与纯化剖析PPT课件
2020年9月28日
5
• 3.氯仿能加速有机相与水相分离，去除植物 色素和蔗糖。用氯仿抽提以去除迹量酚。
• 4.用水饱和的乙醚抽提最后一次，彻底去除 迹量酚和氯仿。然后68℃水浴10分钟蒸发迹 量乙醚。
• 5.异戊醇可减少蛋白质变性操作过程中产生 气泡。
• 酚/氯仿抽提法标准程序是：
• 酚抽提一次，酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一 次。
2020年9月28日
10
• 1.CsCl沉降平衡超速离心
• CsCl沉降平衡超速离心是纯化DNA分子的主要方 法：
• ①可分离CC(双链闭合环状)、OC（开环双链）、 L（线性）三种结构的DNA分子。质粒DNA的这三 种结构分子与EB结合能力不同（L>OC>CC），EB 插入DNA分子中可使其浮力密度下降，结合EB越 多、浮力密度越小。。
• 2. 酚的水饱和：饱和酚的pH值接近8.0，可减少离心 后水酚双向的交界面上的DNA滞留；由于在酸性pH值条 件下，DNA分配于有机相，因此使用前必须对酚进行平 衡使其pH值在7.8以上。
制好的饱和酚贮于棕色瓶中4℃可保存1个月。因酚 的氧化随pH值的增高而增加，如所用平衡缓冲液的 pH值＞8及RNA的提取都应使用新鲜饱和的酚。
• 2.蔗糖密度梯度超速离心
• 可用于分离不同大小的DNA片段
2020年9月28日
13
• 五.核酸的沉淀浓缩法
• 原理：核酸与Na、K、Mg等形成的盐在许多种有 机溶剂中不溶解，但也不会被有机溶剂变性。
• （一）核酸沉淀的盐类及浓度
• 1.NaAc：最常用，终浓度为0.3M（pH5.0）
• 2.NaCl：终浓度为0.2M，除去SDS。
2020年9月28日
医学课件-核酸的分离与纯化
xx年xx月xx日
目 录
• 核酸的分离与纯化概述 • 核酸的分离与纯化技术 • 核酸的分离与纯化步骤 • 核酸的分离与纯化挑战及解决方案 • 核酸的分离与纯化展望
01
核酸的分离与纯化概述
核酸的分离与纯化的定义和重要性
定义
核酸的分离与纯化是生物学和医学研究中的一项基本技术， 主要是通过一系列的离心、过滤、萃取等步骤将样品中的核 酸与其他大分子物质、小分子物质、细胞结构等进行分离， 同时进一步纯化核酸的过程。
核酸的鉴定和检测
核酸鉴定
利用紫外吸收光谱、分子量测定、凝胶电泳等方法，对纯化的核酸进行鉴定 ，确认其是否为目标核酸。
核酸检测
利用特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，检测目标核酸的存在和含量 。
04
核酸的分离与纯化挑战及解决方案
样品中核酸的降解和损失问题
稳定性差
核酸在体内易被核酸酶降解，影响分离效果。
鉴定方法选择
采用多种鉴定方法，如琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，以确保鉴 定结果的准确性。
标准化操作
通过使用标准化的操作流程和试剂盒，减少操作误差。
05
核酸的分离与纯化展望
核酸的分离与纯化技术的发展趋势
高效分离方法
在核酸分离方面，开发高效、快速、安全的分离方法将是未来的发展趋势，例如 ，改进离心技术、色谱技术等，提高分离效率和纯度。
生物技术应用
核酸的分离与纯化在生物技术领域也具有很大的应用潜力， 例如，用于基因工程、细胞工程和蛋白质工程等领域。通过 核酸分离，可以获得特定基因序列，用于基因克隆、基因敲 除和蛋白质表达等研究。
核酸的分离与纯化技术的未来研究方向
新技术的研发
《分子生物学》课件——核酸的分离与纯化
保持核酸的完整性
遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构还 决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。
温度不要过高； 控制pH值范围（pH值4-10）；
保持一定离子强度； 减少物理因素对核酸的机械剪切力；
防止核酸酶对核酸的降解。
核酸提取步骤
细胞裂解
酶处理
核酸与其他生物 大分子物质分离
裂解液、 洗涤液、 洗脱液转入位置
硅胶层 液体流出管道
核酸分离与纯化方法
磁珠硅胶吸附法 加热煮沸法 玻璃缠绕法
甲酰胺解聚法 离子交换层析 密度梯度离心法
……
小结
核酸的分离与纯化
背景 核酸存在的形式 提取核酸的原则 保持核酸完整性
提取核酸步骤 核酸分离与纯化方法
思考题
核酸分离与纯化的步骤有哪些？
核酸与其他生物 大分子物质分离
核酸纯化
根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染， 并除去提取过程中的系列试剂（盐、有机溶剂 等）杂质，最后得到均一的核酸样品。
核酸分离与纯化方法
酚/氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。 氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚， 同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振荡，为防止气泡和促使水相与 有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醇=25:24:1）。
DNA 细胞核DNP线粒体 环状DNA。 RNA 细胞质中，mRNA，rRNA，tRNA。
提取核酸总的原则
➢ 保证核酸一级结构的完整性； ➢ 排除其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度； ➢ 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； ➢ 其他核酸分子，也应尽量去除。
核酸的分离纯化优秀课件
前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
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核酸的分离纯化优秀课件
一、核酸分离、纯化原则
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
1 意义
遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸 的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其 他生物大分子结合的方式。
核酸的分离纯化优秀课件
General process of gene engineering
1. 从生物有机体基因组中， 分离出带有目的基因的DNA片 段。
2. 将带有目的基因的外源DNA片段连 接到能够自我复制的并具有选择记号 的载体分子上，形成重组DNA分子。
3. 将重组DNA分子转移到适当的受体 细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增 殖。 4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出 获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛 核酸的分离纯选化出优秀已课件经得到扩增的目的基因。
1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA 侵染细菌实验
核酸的分离纯化优秀课件
2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交 替问题；
Rosalind Franklin拍出 了第一张 能反映DNA美丽双螺旋结构的X
射线照片
X-ray source
（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-
Ribonucleoside Complex, VRC)
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核酸的分离纯化优秀课件
第六章核酸的分离与纯化
核酸分离与纯化的方法很多，应根据具体生物材料的性质与起始量、待分离核酸的性质与用途而采取不同的方案。无论采取何种方法，都应遵循总的原则：一是保证核酸一级结构的完整性，因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的最基本的要求；二是尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度，这是本章讨论的主要内容。
（三）核酸质量与提取步骤的关系
一般地，分离纯化步骤越多，核酸的纯度也越高，但得率会逐渐下降，完整性也愈难以保证。相反，通过分离纯化步骤少的实验方案，我们可以得到比较多的完整性较好的核酸分子，但纯度不一定很高。这需要结合核酸的用途而加以选择。
（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤
随着核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度会逐渐下降，及至影响到后面的实验操作或不能满足后继研究与应用的需要时，需要对核酸进行浓缩。沉淀是核酸浓缩最常用的方法，其优点在于核酸沉淀后，可以很容易地改变溶解缓冲液和调整核酸溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能去除部分杂质与某些盐离子，有一定的纯化作用。加入一定浓度的盐类后，用有机溶剂沉淀核酸。其中常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁等，常用的有机溶剂则有乙醇、异丙醇和聚乙二醇。核酸沉淀往往含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除。对于浓度低并且体积较大的核酸样品，可在有机溶剂沉淀前，采用固体的聚乙二醇或丁醇对其进行浓缩处理。
其次对无法避免的有害因素，应采取多种措施，尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏。应尽量简化分离纯化的步骤，缩短提取的时间，减轻各种有害因素对核酸完整性的破坏；DNA酶（DNase或DNAase）的激活需要Mg2+、Ca2+等二价金属离子，若使用EDTA、柠檬酸盐并在低温条件下操作，基本上就可以抑制DNA酶的活性。RNA酶（RNase或RNAase）的广泛存在与不易失活的特点，决定了生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。
《核酸的分离与纯化》课件
凝胶层析
柱体上填充的凝胶为物质提供 分子筛作用，不同大小的分子 在凝胶中被阻碍的程度不同。
结论与要点
1 核酸是由核苷酸组成的生物高分子。 2 常见的核酸类型有DNA和RNA。
3 分离技术包括盐析、凝胶电泳、超
速离心和柱层析等。
5 超速离心技术包括差速离心和密度
梯度离心。
4 凝胶电泳可分为琼脂糖凝胶、聚丙
差速离心
通过旋转离心管，根据密度差异使分子分层。
密度梯度离心
将不同密度的离子或分子加入离心管，创建密 度梯度，然后离心管使分子按照密度梯度分 层。
柱层析
吸附层析
利用柱体上填充的化学吸附剂 与物质的亲和性差异使其分离。
离子交换层析
利用电荷性质进行分离，负载 离子的功能团能够与物质中带 正电荷的离子相互作用。
《核酸的分离与纯化》 PPT课件
此课件旨在介绍核酸的分离与纯化方法，从而为纯核酸的获得提供帮助。
核酸是什么
1 分子组成
核酸是由核苷酸组成的生物高分子。每个核苷酸由糖、碱基和磷酸基团三部分组成。
2 功能与作用
核酸参与了生命活动的多个方面，包括传递遗传信息、调控基因表达等。
3 常见类型
常见的核酸有DNA、RNA等多种类型，它们在分子组成和生物功能上存在差异。
核酸的分离方法
1
盐析
通过调节溶液的离子强度，使核酸与溶
凝胶电泳
2
液中的其他物质分离。
利用电场作用使核酸在凝胶中移动，根
据大小和电荷差异分离不同的核酸。
3
超速离心
通过调节离心力和离心时间，使不同重
柱层析
4
量的分子沉淀到不同位置。
利用柱体中填充的吸附剂、离子交换剂、 凝胶等材料，按照不同的物性实现分离。
医学课件-核酸的分离与纯化
医学课件-核酸的分离与纯化xx年xx月xx日•核酸的概述•核酸的分离技术•核酸的纯化技术目录•核酸分离与纯化的应用01核酸的概述1核酸的化学组成23核酸的基本组成单位，由碱基、戊糖和磷酸组成。
核苷酸以脱氧核糖为戊糖，主要分布在细胞核中，是细胞内遗传信息的主要载体。
脱氧核糖核酸（DNA）以核糖为戊糖，主要分布在细胞质中，参与蛋白质合成和其他细胞活动。
核糖核酸（RNA）03核酸的功能作为遗传信息的载体，参与蛋白质合成、基因表达调控等生命活动。
核酸的结构与功能01DNA的双螺旋结构由两条反向平行的多核苷酸链组成，互补碱基对之间的氢键连接维持其稳定性。
02RNA的结构多样性根据功能不同，RNA可形成单链、双链或复杂的三级结构，如核糖体、microRNA等。
分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。
核酸的分类与分布根据来源分为编码RNA和非编码RNA。
根据功能DNA主要分布在细胞核中，RNA 主要分布在细胞质中。
分布02核酸的分离技术低速离心机用于分离小分子物质，如蛋白质、核酸等。
高速离心机用于分离大分子物质，根据物质的不同密度和粒径进行分离。
微量离心机用于分离小量样品，如血液、组织等。
离心分离技术电泳分离技术凝胶电泳用于分离大分子物质，如蛋白质、核酸等。
聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分离蛋白质、多肽等小分子物质。
等电聚焦电泳用于分离具有等电点的蛋白质等生物分子。
常用的色谱分离技术，可用于分离各种物质，如蛋白质、核酸等。
柱色谱将样品在薄层板上进行分离，适用于小量样品的分离。
薄层色谱一种高分离效能的色谱技术，可用于分离各种物质，如蛋白质、核酸等。
高效液相色谱色谱分离技术03核酸的纯化技术原理分子筛层析是一种根据分子大小不同对样品进行分离的方法。
它利用了分子筛的孔径大小，只有符合孔径大小的分子才能进入分子筛内部，从而达到分离效果。
分子筛层析应用分子筛层析在核酸纯化中广泛应用于分离和纯化DNA和RNA，特别是对于较大分子的分离效果更佳。
核酸的分讲义离纯化及鉴定技术生化分析详解
核酸的分讲义离纯化及鉴定技术生化分析详解核酸的分离纯化及鉴定技术在生化分析领域具有重要的应用价值。
核酸是生物体内重要的生物大分子，它们具有保存、传递和表达遗传信息的功能。
为了研究核酸的结构和功能，需要对其进行分离、纯化和鉴定。
本文将详细介绍核酸的分离纯化和鉴定技术的生物化学分析。
1.核酸的提取与分离核酸提取是获得核酸样品的第一步，通过破碎细胞膜和细胞壁来释放核酸。
核酸的提取方法主要包括酸性酚/氯仿提取法、盐酸酚/氯仿提取法以及商业化的核酸提取试剂盒等。
2.核酸的纯化核酸提取后，常常需要对核酸进行纯化。
纯化目的是去除杂质，使核酸得到高纯度、高浓度、完整和可靠的分离。
核酸纯化方法主要有：凝胶柱层析、离心柱层析、沉淀、电泳、凝胶电泳纯化、离心纯化、溶液法纯化等。
3.核酸的鉴定核酸的鉴定一般包括酶切鉴定、PCR扩增鉴定和测序鉴定等。
(1)酶切鉴定酶切鉴定是通过限制性内切酶作用分析核酸的序列和结构。
通过将样品与不同酶切加入，并经过酶切电泳后，观察电泳图的特征带，可以推测样品的核酸类型和纯度。
(2)PCR扩增鉴定PCR扩增鉴定是通过聚合酶链式反应（PCR）扩增特定片段的核酸。
通过选择特异的引物，可以扩增出目标核酸片段，从而确定核酸的存在和纯度。
(3)测序鉴定测序鉴定是通过测序技术研究核酸的序列。
常见的测序技术包括Sanger测序、下一代测序（NGS）和单分子测序等。
通过测序，可以确定核酸的准确序列，从而判断核酸的类型和功能。
整体而言，核酸的分离纯化及鉴定技术是生化分析中核心的内容。
通过这些技术，可以获得高纯度、高质量的核酸样品，并准确地鉴定核酸的存在和序列信息。
这些技术的应用广泛，包括基因组学、生物信息学、分子生物学、疾病诊断和药物研发等领域。
随着生化分析技术的不断发展，核酸的分离纯化及鉴定技术将越来越重要，为科学研究和生物医学领域的发展提供强有力的支持。
《核酸分离纯化》课件
《核酸分离纯化》课件一、课件概述核酸分离纯化是分子生物学和生物技术领域中的一项基本技术，其目的是从复杂的生物样品中提取和纯化出高质量的核酸，以便进行后续的分析和应用。
本课件将介绍核酸分离纯化的基本原理、方法和步骤，帮助学生掌握这一技术。
二、课件内容1. 核酸分离纯化的意义核酸是生物体内重要的遗传物质，其分离纯化对于研究基因表达、基因调控、基因突变等方面具有重要意义。
核酸分离纯化是进行基因克隆、基因测序、PCR等实验的基础步骤。
2. 核酸分离纯化的基本原理核酸的物理化学性质：核酸具有一定的溶解度、吸附性、变性温度等。
核酸与蛋白质、RNA、DNA等分子的差异：通过特定条件下对不同分子的相互作用进行分离。
利用核酸的特异性：通过特定酶的作用，实现对核酸的分离纯化。
3. 核酸分离纯化的方法盐析法：利用核酸在高盐浓度下的溶解度降低，将核酸与其他物质分离。
有机溶剂沉淀法：利用有机溶剂（如酚、氯仿等）与水相不相溶的性质，将核酸与其他物质分离。
吸附法：利用特定吸附剂（如硅胶、纤维素等）对核酸的选择性吸附，将核酸与其他物质分离。
透析法：利用透析袋的选择性透过性，将核酸与其他大分子物质分离。
酶法：利用特定酶（如DNA酶、RNA酶等）对核酸的降解作用，实现对核酸的分离纯化。
4. 核酸分离纯化的步骤样品处理：取适量生物样品，加入适量裂解液，进行充分搅拌，使细胞破碎并释放核酸。
核酸提取：将样品转移至离心管中，进行高速离心，将核酸沉淀与其他物质分离。
核酸纯化：根据核酸的物理化学性质，选择适当的分离方法（如盐析、有机溶剂沉淀等），将核酸与其他物质分离。
核酸洗涤：用适量的洗涤液对核酸沉淀进行洗涤，去除残留的杂质。
核酸重悬：加入适量的溶解液，将核酸沉淀重悬，以便进行后续分析或应用。
5. 实验操作注意事项实验操作应在生物安全柜中进行，避免交叉污染。
实验过程中应使用无RNA酶、无DNA酶的试剂和工具。
实验操作过程中应注意个人防护，避免接触核酸样品。
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• 三、电泳法
• 凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点， 已成为分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。 常用于核酸分离的凝胶电泳主要有琼脂糖电泳 和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
• 四、超速离心法
• 根据核酸分子的物理特性如分子量、密度等的 不同，可用密度梯度超速离心的方法加以分离 纯化。
• 1.CsCl沉降平衡超速离心
• 2.蔗糖密度梯度超速离心
• 可用于分离不同大小的DNA片段
• 五.核酸的沉淀浓缩法
• 原理：核酸与 Na 、 K 、 Mg 等形成的盐在许多种有 机溶剂中不溶解，但也不会被有机溶剂变性。 • （一）核酸沉淀的盐类及浓度 • 1.NaAc：最常用，终浓度为0.3M（pH5.0） • 2.NaCl：终浓度为0.2M，除去SDS。 • 3.NH4Ac: 去除dNTP，铵盐抑制磷酸化等反应。 • 4.LiCl ：高浓度（0.8M）可直接沉淀大分子量 RNA 。抑 制反转录酶反应和翻译（蛋白合成）实验。 • 5.KAc：与NaAc相似，钾盐形式难溶于含SDS的溶液。 • 6.MgCl2 ： 对于浓度低于 0.1μg/ml或长度小于 100 个核
苷酸的样品，可提高核酸沉淀的回收率。
• 样品溶液中含盐浓度过高，应用TE进行稀释。
• （二）核酸的有机沉淀剂 • 1. 乙醇：沉淀DNA的首选有机溶剂。DNA沉
淀用2倍体积，RNA沉淀用2.5～3倍体积。
• 2.异丙醇：所需体积小速度快。0.54～1倍
体积。常规需用70%乙醇漂洗沉淀数次。
• 3.聚乙二醇（PEG）：可用不同浓度的PEG选择
第六章 核酸的分离与纯化
王文君
广州中医药大学 分子生物学技术核酸分离提取的原则 常用方法及基本原理 DNA的分离纯化 RNA的分离纯化
第一节 核酸分离提取的原则
• 一、基本原则
• 1.保证核酸一级结构的完整性。 • 2.排除其它分子的污染。
• 二、注意事项
• CsCl沉降平衡超速离心是纯化DNA分子的主要方 法： • ①可分离CC(双链闭合环状)、OC（开环双链）、 L（线性）三种结构的DNA分子。质粒DNA的这三 种结构分子与EB结合能力不同（L>OC>CC），EB 插入DNA分子中可使其浮力密度下降，结合EB越 多、浮力密度越小。。 • ②可分离双链DNA分子的两条互补链。 • ③分离浮力密度不同的DNA分子或其他分子颗粒， 如图1。
• 核酸提取的方案，应根据具体生物材料和待提取的核 酸分子的特点而定。只有采取合适的核酸提取方法， 才可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。 下面介绍核酸分离纯化的基本方法及不同来源DNA的分 离提取方法。
第二节 分离制备核酸的常用方法及基本原理
• 一.溶解法： • 酚/氯仿抽提法的基本原理
• 酚/氯仿抽提法标准程序是：
• 酚抽提一次，酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一 次。
水相（核酸溶液） 蛋白杂质 有机相
•高速离心后的分层情况（酚/氯仿抽提法）
• 注意事项：
• 1. 一般酚是透明无色的结晶。酚结晶如呈现粉红色或 黄色，表明其中含有酚的氧化产物如醌、二酸等。变 色的酚溶液不能用于实验，因其中的酚氧化物可破坏 核酸的磷酸二酯键，并引起DNA链的交联。 • 2. 酚的水饱和：饱和酚的pH值接近8.0，可减少离心 后水酚双向的交界面上的DNA滞留；由于在酸性pH值条 件下，DNA分配于有机相，因此使用前必须对酚进行平 衡使其pH值在7.8以上。 制好的饱和酚贮于棕色瓶中4℃可保存1个月。因酚 的氧化随pH值的增高而增加，如所用平衡缓冲液的 pH值＞8及RNA的提取都应使用新鲜饱和的酚。
• 1.交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性 剂，以增加去除蛋白杂质的效果。 • 2.氯仿与苯酚混合使用，对于RNA的提取显得更 加重要，因酚可有效变性蛋白质，但不能完全 抑制RNA酶的活性。而且酚能溶解10～15%的水， 从而溶解部分Poly（A)RNA。
• 3.氯仿能加速有机相与水相分离，去除植物 色素和蔗糖。用氯仿抽提以去除迹量酚。 • 4.用水饱和的乙醚抽提最后一次，彻底去除 迹量酚和氯仿。然后68℃水浴10分钟蒸发迹 量乙醚。 • 5.异戊醇可减少蛋白质变性操作过程中产生 气泡。
图1 氯化铯梯度纯化λ噬菌体
噬菌体在 1.45g/ml 与 1.50g/ml 氯化铯界面之间形成一肉眼可 见的带。在 1.45g/ml 与 1.50g/ml 氯化铯界面之间可看到一个 由噬菌体颗粒形成的浅蓝色带。
• ④纯化DNA分子。在中性CsCl溶液中，DNA的 浮力密度为1.7g/ml，RNA为2.0g/ml，蛋白 质的浮力密度为1.3～1.4g/ml。在起始密度 为1.7g/ml的CsCl溶液中进行超速离心，可 以很好地将三者区分开。蛋白质浮在上层液 面，DNA分子在离心管中间形成区带，RNA沉 于管底，从而达到从DNA样品中去除微量RNA 和蛋白质的目的。
• 二、层析法
• 利用物质在静止相和移动相之间分配系数的差异， 进行物质的分离和纯化的技术称为层析。层析体 系中一般由两个互相不溶的介质组成，静止相多 为固体，移动相多为液体。
• 羟磷灰石是一类特殊的层析材料，对核酸有较大的亲和 力，并在大多数条件下不吸附蛋白质和多糖，所以能纯 化核酸。双股DNA与羟磷灰石的结合较牢固，如将细胞的 溶解液流经羟磷灰石柱，然后用低浓度磷酸缓冲液流洗， 以去除RNA、蛋白质及其它物质。随即再用浓度高的磷酸 缓冲液洗脱，即可获得DNA。
沉淀不同分子量的DNA片段。 PEG 6000 ，其使用浓 度与DNA片段的大小成反比。70%乙醇漂洗沉淀2次。
• 1.简化操作步骤，减少对核酸的破坏。 • 2.避免过酸（碱）等化学因素的影响（pH4～10）。 • 3.减少物理因素对核酸的降解。 • 4.防止核酸的生物降解。
• 三. 主要步骤：
• 1.破碎细胞。 • 2.去除与核酸结合的蛋白质，多糖以及脂类等 生物大分子。 • 3. 去除其它不需要的核酸分子。 • 4. 沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质。 • 5. 核酸纯化。