核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析

• 0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增 强抑制作用。
• 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶 解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核 蛋白迅速与核酸分离。
• β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。
注意：Trizol是强腐蚀性物质，小心存放于4℃
主要核酸类药物及用途
名称 聚肌胞苷酸（聚肌胞）
腺苷三磷酸（ATP）
核酸-氨基酸混合物 辅酶A（CoA） 脱氧核苷酸钠 腺苷一磷酸（AMP） 鸟苷三磷酸（GTP） 辅酶Ⅰ（NDA） 辅酶Ⅱ（NADP）
治疗范围
干扰素诱导物，具有广普抗病毒作用；用化学合 成、酶促合成方法生产
用于心力衰竭、心肌炎、心肌梗死、脑动脉和冠 状动脉硬化、急性脊髓灰质炎、肌肉萎缩、慢性 肝炎等
氯仿：氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在 水相中的酚，还能去除植物色素和蔗糖。
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可
以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于 分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相、 下层有机溶剂相维持稳定。
无水乙醇沉淀DNA：与核酸不发生任何化学反应；对盐类沉 淀少，沉淀中所含微量乙醇易挥发除去。
选择原则
根据具体生物材料的性质与起始量、待分离核酸的 性质与用途而采取不同的方案。
无论采取何种方法，都应遵循总的原则： 保证核酸一级结构的完整性， 尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。
核酸制备时应注意的事项:
①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解(pH4-10) ③减少物理因素对核酸的降解,如机械剪 切力和高温 ④防止核酸的生物降解。
主要核酸类药物及用途
名称
治疗范围
核糖核酸（RNA） 脱氧核糖核酸（DNA） 免疫核糖核酸（iRNA） 转移因子（TF）
口服用于精神迟缓、记忆衰退、动脉硬化性痴呆 治疗；静脉注射用于刺激造血和促进白细胞生成， 治疗慢性肝炎、肝硬化初期癌症
有抗放射作用，能改善机体虚弱疲劳；与细胞毒 药物合用，能提高细胞毒药物对癌细胞的选择性 作用；与红霉素合用，能降低其毒性，提高抗癌 疗效
RNA酶抑制剂：
1. 皂土：带负电荷，能吸附RNase，使其失活。
2. DEPC(焦碳酸二乙酯 )：通过和RNA酶的活性基团组氨酸
的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
(二) 核酸的分离与纯化
利用核酸与其它物质在一个或多个性质 上的差异设计有效方案，才能使核酸得以分 离。核酸与其它物质的差异包括细胞定位与 组织分布上的差异、物理化学性质上的不同 以及各自独特的生物学特性。
DNA酶抑制剂：
1. 金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的 激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。 如：EDTA
2. 阴离子表面活性剂：如SDS。该试剂除对核酸酶有抑制作 用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷 的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
三 鉴定与保存
(一)核酸的鉴定 分离纯化后的核酸质量如何，是否
达到后继实验研究与应用的要求，可以 通过相关的方法来鉴定其浓度、纯度及 完整性。
1．浓度鉴定
(1)紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分 子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，其 最大吸收波长在250 ~ 270 nm 之间。 在波长260nm紫外光下，1 OD值得吸光度相当于双 链DNA浓度为50 µg/ml；单链DNA和RNA为40 µg/ml；寡核苷酸为35 µg/ml。 OD值范围应该在0.1~0.99之间，否则不符合上述线 性关系。
2．纯度鉴定
(1)紫外分光光度法：紫外分光光度法主 要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白 质的污染。在TE缓冲液中，纯DNA的A260 ／A280比值为1.8 ，纯RNA的A260／A280比 值为2.0。比值升高与降低均表示不纯。
(2)荧光光度法：用溴化乙锭等荧光染料示踪 的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于 DNA分子比RNA大许多，电泳迁移率低。通过分 析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果， 可以鉴定DNA制品中有无RNA的干扰，亦可鉴定 在RNA制品中有无DNA的污染。
(2) 荧光光度法
• 核酸的荧光染料溴化乙锭(ethidium bromide，EB) 嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线 激发下发出橙红色的荧光，且荧光强度积分与核 酸含量呈正比。该法灵敏度可达1-5ng，适合低浓 度核酸溶液的定量分析。
• 另外，SYBR Gold作为一种新的超灵敏荧光染料， 可以从琼脂糖凝胶中检出低于20pg的双链DNA。
一、 材料与方法的选择
➢ 核酸存在于各种生物中。临床常见的样品 有血液、尿液、唾液、头发、组织及培养 细胞等。
➢ 核酸分离与纯化的方法非常多。如何选择 合适的分离与纯化方法是一个首要的问题。 因为不同的研究目的对核酸的完整性、产 量、纯度和浓度有不同的要求。
➢ 近年来，试剂盒(Kit)的开发与自动化仪器 的使用大大提高了分离与纯化的效率。
➢ DNA与RNA性质上的差异决定了两者的最适分离与纯 化的条件是不同的。
DNA ：主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少 量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA （cpDNA），质粒DNA。
RNA：主要存在于细胞质中，如mRNA，rRNA， tRNA，miRNA等。
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和 噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。
EDTA：破坏细胞膜，螯合Mg2+、Ca2+，使DNase 失活；
SDS：可破坏细胞膜、抑制核酸酶，还可使核酸从 蛋白质上游离下来；
蛋白酶K：非特异性蛋白酶，可将蛋白质消化成氨 基酸；
65℃：高温下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性， 释放出核酸；
冰浴：降低温度使蛋白质及多糖杂质沉淀；
水饱和苯酚：由于蛋白与DNA连结键已断裂，蛋白分子表面 又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相， DNA溶于水相。苯酚使蛋白质变性，并抑制了DNase的降解 作用。
DEPC：焦碳酸二乙酯，是一种强烈但并不彻底的RNA酶抑 制剂，通过和RNA酶中His结合使蛋白质变性，抑制RNA酶活 性。
利用乙醇的易挥发性洗掉异丙醇,氯仿； 溶解一些沉淀中可能的有机物杂质
会极大降低RNA的可溶性
(三) 核酸的浓缩
随着核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物 过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度 会遂渐下降，当不能满足后继研究与应用的需要时， 应对核酸进行浓缩。沉淀是核酸浓缩最常用的方法。 优点：核酸沉淀后,可以很容易地改变溶解缓冲液和调 整核酸溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能去除部 分杂质与某些盐离子，有一定的纯化作用。
汇报结束
谢谢大家! 请各位批评指正
2. RNA分离纯化----Trizol一步法
• TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织 中提取总RNA。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用 是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯 酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因 此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙 醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。
1. DNA分离纯化过程
破碎细胞 + DNA抽提液(EDTA、去污剂、蛋白酶K) 65℃温
育20’
冰浴冷却 离心去细胞碎片 上清液
用水饱和苯酚抽提2~3次 上层液相用氯仿抽至界面无蛋白变性
物 上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀 沉淀物用70%冷乙醇
洗涤,干燥 溶于缓冲液 加入RNase处理除去RNA
苯酚氯仿抽提 沉淀干燥
推动正常RNA分子在基因水平上通过对癌细胞 DNA分子进行诱导，或通过反转录酶系统促使癌 细胞发生逆分化，如：可用于肝炎治疗的抗乙肝 iRNA，治疗肺癌的抗肺癌iRNA
相对分子质量较小，含有多核苷酸、多肽化合物， Mr<10000；它只传递细胞免疫信息，无体液免 疫作用，不致促进肿瘤生长，治疗恶性肿瘤比较 安全；亦可用于治疗肝炎等
用于气管炎、神经衰弱等
用于动脉硬化，白细胞、血小板减少，肝、肾病
用于放疗、化疗引起的急性白细胞减少症
有周围血管扩张作用、减压作用；用于静脉曲张 性溃疡等
用于慢性肝炎、进行性肌肉萎缩等症
用于白细胞减少及冠状动脉硬化
促进体内物质的生物氧化
➢ 细胞内的核酸具有复杂的结构，均与蛋白质结合成核蛋 白。
➢ 分子的总长度在不同生物间差异很大，一般随生物的 进化程度而增长。
二 技术路线的设计 核酸制备的步骤：
放
正常情况下，无论是DNA还是RNA均位 于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就 是破碎细胞、释放核酸。
破碎细胞 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。
动物：液氮处理后用匀浆器破碎。
细胞器DNA，首先纯化细胞器。 以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
所有的组织中均存在RNA酶，人的皮肤、手指、试剂、容 器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并 经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥 烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如 塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理， 再用蒸馏水冲净。