核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析
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用于气管炎、神经衰弱等
用于动脉硬化，白细胞、血小板减少，肝、肾病
用于放疗、化疗引起的急性白细胞减少症
有周围血管扩张作用、减压作用；用于静脉曲张 性溃疡等
用于慢性肝炎、进行性肌肉萎缩等症
用于白细胞减少及冠状动脉硬化
促进体内物质的生物氧化
➢ 细胞内的核酸具有复杂的结构，均与蛋白质结合成核蛋 白。
➢ 分子的总长度在不同生物间差异很大，一般随生物的 进化程度而增长。
汇报结束
谢谢大家! 请各位批评指正
主要核酸类药物及用途
名称 聚肌胞苷酸（聚肌胞）
腺苷三磷酸（ATP）
核酸-氨基酸混合物 辅酶A（CoA） 脱氧核苷酸钠 腺苷一磷酸（AMP） 鸟苷三磷酸（GTP） 辅酶Ⅰ（NDA） 辅酶Ⅱ（NADP）
治疗范围
干扰素诱导物，具有广普抗病毒作用；用化学合 成、酶促合成方法生产
用于心力衰竭、心肌炎、心肌梗死、脑动脉和冠 状动脉硬化、急性脊髓灰质炎、肌肉萎缩、慢性 肝炎等
选择原则
根据具体生物材料的性质与起始量、待分离核酸的 性质与用途而采取不同的方案。
无论采取何种方法，都应遵循总的原则： 保证核酸一级结构的完整性， 尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。
核酸制备时应注意的事项:
①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解(pH4-10) ③减少物理因素对核酸的降解,如机械剪 切力和高温 ④防止核酸的生物降解。
(2) 荧光光度法
• 核酸的荧光染料溴化乙锭(ethidium bromide，EB) 嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线 激发下发出橙红色的荧光，且荧光强度积分与核 酸含量呈正比。该法灵敏度可达1-5ng，适合低浓 度核酸溶液的定量分析。
• 另外，SYBR Gold作为一种新的超灵敏荧光染料， 可以从琼脂糖凝胶中检出低于20pg的双链DNA。
来自百度文库
所有的组织中均存在RNA酶，人的皮肤、手指、试剂、容 器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并 经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥 烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如 塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理， 再用蒸馏水冲净。
EDTA：破坏细胞膜，螯合Mg2+、Ca2+，使DNase 失活；
SDS：可破坏细胞膜、抑制核酸酶，还可使核酸从 蛋白质上游离下来；
蛋白酶K：非特异性蛋白酶，可将蛋白质消化成氨 基酸；
65℃：高温下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性， 释放出核酸；
冰浴：降低温度使蛋白质及多糖杂质沉淀；
水饱和苯酚：由于蛋白与DNA连结键已断裂，蛋白分子表面 又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相， DNA溶于水相。苯酚使蛋白质变性，并抑制了DNase的降解 作用。
• 0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增 强抑制作用。
• 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶 解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核 蛋白迅速与核酸分离。
• β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。
注意：Trizol是强腐蚀性物质，小心存放于4℃
DEPC：焦碳酸二乙酯，是一种强烈但并不彻底的RNA酶抑 制剂，通过和RNA酶中His结合使蛋白质变性，抑制RNA酶活 性。
利用乙醇的易挥发性洗掉异丙醇,氯仿； 溶解一些沉淀中可能的有机物杂质
会极大降低RNA的可溶性
(三) 核酸的浓缩
随着核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物 过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度 会遂渐下降，当不能满足后继研究与应用的需要时， 应对核酸进行浓缩。沉淀是核酸浓缩最常用的方法。 优点：核酸沉淀后,可以很容易地改变溶解缓冲液和调 整核酸溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能去除部 分杂质与某些盐离子，有一定的纯化作用。
➢ DNA与RNA性质上的差异决定了两者的最适分离与纯 化的条件是不同的。
DNA ：主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少 量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA （cpDNA），质粒DNA。
RNA：主要存在于细胞质中，如mRNA，rRNA， tRNA，miRNA等。
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和 噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。
三 鉴定与保存
(一)核酸的鉴定 分离纯化后的核酸质量如何，是否
达到后继实验研究与应用的要求，可以 通过相关的方法来鉴定其浓度、纯度及 完整性。
1．浓度鉴定
(1)紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分 子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，其 最大吸收波长在250 ~ 270 nm 之间。 在波长260nm紫外光下，1 OD值得吸光度相当于双 链DNA浓度为50 µg/ml；单链DNA和RNA为40 µg/ml；寡核苷酸为35 µg/ml。 OD值范围应该在0.1~0.99之间，否则不符合上述线 性关系。
氯仿：氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在 水相中的酚，还能去除植物色素和蔗糖。
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可
以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于 分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相、 下层有机溶剂相维持稳定。
无水乙醇沉淀DNA：与核酸不发生任何化学反应；对盐类沉 淀少，沉淀中所含微量乙醇易挥发除去。
2．纯度鉴定
(1)紫外分光光度法：紫外分光光度法主 要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白 质的污染。在TE缓冲液中，纯DNA的A260 ／A280比值为1.8 ，纯RNA的A260／A280比 值为2.0。比值升高与降低均表示不纯。
(2)荧光光度法：用溴化乙锭等荧光染料示踪 的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于 DNA分子比RNA大许多，电泳迁移率低。通过分 析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果， 可以鉴定DNA制品中有无RNA的干扰，亦可鉴定 在RNA制品中有无DNA的污染。
推动正常RNA分子在基因水平上通过对癌细胞 DNA分子进行诱导，或通过反转录酶系统促使癌 细胞发生逆分化，如：可用于肝炎治疗的抗乙肝 iRNA，治疗肺癌的抗肺癌iRNA
相对分子质量较小，含有多核苷酸、多肽化合物， Mr<10000；它只传递细胞免疫信息，无体液免 疫作用，不致促进肿瘤生长，治疗恶性肿瘤比较 安全；亦可用于治疗肝炎等
二 技术路线的设计 核酸制备的步骤：
破碎细胞
提取
纯化
(一) 核酸的释放
正常情况下，无论是DNA还是RNA均位 于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就 是破碎细胞、释放核酸。
破碎细胞 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。
动物：液氮处理后用匀浆器破碎。
细胞器DNA，首先纯化细胞器。 以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
1. DNA分离纯化过程
破碎细胞 + DNA抽提液(EDTA、去污剂、蛋白酶K) 65℃温
育20’
冰浴冷却 离心去细胞碎片 上清液
用水饱和苯酚抽提2~3次 上层液相用氯仿抽至界面无蛋白变性
物 上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀 沉淀物用70%冷乙醇
洗涤,干燥 溶于缓冲液 加入RNase处理除去RNA
苯酚氯仿抽提 沉淀干燥
DNA酶抑制剂：
1. 金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的 激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。 如：EDTA
2. 阴离子表面活性剂：如SDS。该试剂除对核酸酶有抑制作 用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷 的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
主要核酸类药物及用途
名称
治疗范围
核糖核酸（RNA） 脱氧核糖核酸（DNA） 免疫核糖核酸（iRNA） 转移因子（TF）
口服用于精神迟缓、记忆衰退、动脉硬化性痴呆 治疗；静脉注射用于刺激造血和促进白细胞生成， 治疗慢性肝炎、肝硬化初期癌症
有抗放射作用，能改善机体虚弱疲劳；与细胞毒 药物合用，能提高细胞毒药物对癌细胞的选择性 作用；与红霉素合用，能降低其毒性，提高抗癌 疗效
一、 材料与方法的选择
➢ 核酸存在于各种生物中。临床常见的样品 有血液、尿液、唾液、头发、组织及培养 细胞等。
➢ 核酸分离与纯化的方法非常多。如何选择 合适的分离与纯化方法是一个首要的问题。 因为不同的研究目的对核酸的完整性、产 量、纯度和浓度有不同的要求。
➢ 近年来，试剂盒(Kit)的开发与自动化仪器 的使用大大提高了分离与纯化的效率。
RNA酶抑制剂：
1. 皂土：带负电荷，能吸附RNase，使其失活。
2. DEPC(焦碳酸二乙酯 )：通过和RNA酶的活性基团组氨酸
的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
(二) 核酸的分离与纯化
利用核酸与其它物质在一个或多个性质 上的差异设计有效方案，才能使核酸得以分 离。核酸与其它物质的差异包括细胞定位与 组织分布上的差异、物理化学性质上的不同 以及各自独特的生物学特性。
2. RNA分离纯化----Trizol一步法
• TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织 中提取总RNA。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用 是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯 酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因 此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙 醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。
用于动脉硬化，白细胞、血小板减少，肝、肾病
用于放疗、化疗引起的急性白细胞减少症
有周围血管扩张作用、减压作用；用于静脉曲张 性溃疡等
用于慢性肝炎、进行性肌肉萎缩等症
用于白细胞减少及冠状动脉硬化
促进体内物质的生物氧化
➢ 细胞内的核酸具有复杂的结构，均与蛋白质结合成核蛋 白。
➢ 分子的总长度在不同生物间差异很大，一般随生物的 进化程度而增长。
汇报结束
谢谢大家! 请各位批评指正
主要核酸类药物及用途
名称 聚肌胞苷酸（聚肌胞）
腺苷三磷酸（ATP）
核酸-氨基酸混合物 辅酶A（CoA） 脱氧核苷酸钠 腺苷一磷酸（AMP） 鸟苷三磷酸（GTP） 辅酶Ⅰ（NDA） 辅酶Ⅱ（NADP）
治疗范围
干扰素诱导物，具有广普抗病毒作用；用化学合 成、酶促合成方法生产
用于心力衰竭、心肌炎、心肌梗死、脑动脉和冠 状动脉硬化、急性脊髓灰质炎、肌肉萎缩、慢性 肝炎等
选择原则
根据具体生物材料的性质与起始量、待分离核酸的 性质与用途而采取不同的方案。
无论采取何种方法，都应遵循总的原则： 保证核酸一级结构的完整性， 尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。
核酸制备时应注意的事项:
①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解(pH4-10) ③减少物理因素对核酸的降解,如机械剪 切力和高温 ④防止核酸的生物降解。
(2) 荧光光度法
• 核酸的荧光染料溴化乙锭(ethidium bromide，EB) 嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线 激发下发出橙红色的荧光，且荧光强度积分与核 酸含量呈正比。该法灵敏度可达1-5ng，适合低浓 度核酸溶液的定量分析。
• 另外，SYBR Gold作为一种新的超灵敏荧光染料， 可以从琼脂糖凝胶中检出低于20pg的双链DNA。
来自百度文库
所有的组织中均存在RNA酶，人的皮肤、手指、试剂、容 器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并 经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥 烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如 塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理， 再用蒸馏水冲净。
EDTA：破坏细胞膜，螯合Mg2+、Ca2+，使DNase 失活；
SDS：可破坏细胞膜、抑制核酸酶，还可使核酸从 蛋白质上游离下来；
蛋白酶K：非特异性蛋白酶，可将蛋白质消化成氨 基酸；
65℃：高温下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性， 释放出核酸；
冰浴：降低温度使蛋白质及多糖杂质沉淀；
水饱和苯酚：由于蛋白与DNA连结键已断裂，蛋白分子表面 又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相， DNA溶于水相。苯酚使蛋白质变性，并抑制了DNase的降解 作用。
• 0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增 强抑制作用。
• 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶 解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核 蛋白迅速与核酸分离。
• β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。
注意：Trizol是强腐蚀性物质，小心存放于4℃
DEPC：焦碳酸二乙酯，是一种强烈但并不彻底的RNA酶抑 制剂，通过和RNA酶中His结合使蛋白质变性，抑制RNA酶活 性。
利用乙醇的易挥发性洗掉异丙醇,氯仿； 溶解一些沉淀中可能的有机物杂质
会极大降低RNA的可溶性
(三) 核酸的浓缩
随着核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物 过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度 会遂渐下降，当不能满足后继研究与应用的需要时， 应对核酸进行浓缩。沉淀是核酸浓缩最常用的方法。 优点：核酸沉淀后,可以很容易地改变溶解缓冲液和调 整核酸溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能去除部 分杂质与某些盐离子，有一定的纯化作用。
➢ DNA与RNA性质上的差异决定了两者的最适分离与纯 化的条件是不同的。
DNA ：主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少 量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA （cpDNA），质粒DNA。
RNA：主要存在于细胞质中，如mRNA，rRNA， tRNA，miRNA等。
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和 噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。
三 鉴定与保存
(一)核酸的鉴定 分离纯化后的核酸质量如何，是否
达到后继实验研究与应用的要求，可以 通过相关的方法来鉴定其浓度、纯度及 完整性。
1．浓度鉴定
(1)紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分 子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，其 最大吸收波长在250 ~ 270 nm 之间。 在波长260nm紫外光下，1 OD值得吸光度相当于双 链DNA浓度为50 µg/ml；单链DNA和RNA为40 µg/ml；寡核苷酸为35 µg/ml。 OD值范围应该在0.1~0.99之间，否则不符合上述线 性关系。
氯仿：氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在 水相中的酚，还能去除植物色素和蔗糖。
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可
以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于 分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相、 下层有机溶剂相维持稳定。
无水乙醇沉淀DNA：与核酸不发生任何化学反应；对盐类沉 淀少，沉淀中所含微量乙醇易挥发除去。
2．纯度鉴定
(1)紫外分光光度法：紫外分光光度法主 要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白 质的污染。在TE缓冲液中，纯DNA的A260 ／A280比值为1.8 ，纯RNA的A260／A280比 值为2.0。比值升高与降低均表示不纯。
(2)荧光光度法：用溴化乙锭等荧光染料示踪 的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于 DNA分子比RNA大许多，电泳迁移率低。通过分 析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果， 可以鉴定DNA制品中有无RNA的干扰，亦可鉴定 在RNA制品中有无DNA的污染。
推动正常RNA分子在基因水平上通过对癌细胞 DNA分子进行诱导，或通过反转录酶系统促使癌 细胞发生逆分化，如：可用于肝炎治疗的抗乙肝 iRNA，治疗肺癌的抗肺癌iRNA
相对分子质量较小，含有多核苷酸、多肽化合物， Mr<10000；它只传递细胞免疫信息，无体液免 疫作用，不致促进肿瘤生长，治疗恶性肿瘤比较 安全；亦可用于治疗肝炎等
二 技术路线的设计 核酸制备的步骤：
破碎细胞
提取
纯化
(一) 核酸的释放
正常情况下，无论是DNA还是RNA均位 于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就 是破碎细胞、释放核酸。
破碎细胞 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。
动物：液氮处理后用匀浆器破碎。
细胞器DNA，首先纯化细胞器。 以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
1. DNA分离纯化过程
破碎细胞 + DNA抽提液(EDTA、去污剂、蛋白酶K) 65℃温
育20’
冰浴冷却 离心去细胞碎片 上清液
用水饱和苯酚抽提2~3次 上层液相用氯仿抽至界面无蛋白变性
物 上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀 沉淀物用70%冷乙醇
洗涤,干燥 溶于缓冲液 加入RNase处理除去RNA
苯酚氯仿抽提 沉淀干燥
DNA酶抑制剂：
1. 金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的 激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。 如：EDTA
2. 阴离子表面活性剂：如SDS。该试剂除对核酸酶有抑制作 用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷 的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
主要核酸类药物及用途
名称
治疗范围
核糖核酸（RNA） 脱氧核糖核酸（DNA） 免疫核糖核酸（iRNA） 转移因子（TF）
口服用于精神迟缓、记忆衰退、动脉硬化性痴呆 治疗；静脉注射用于刺激造血和促进白细胞生成， 治疗慢性肝炎、肝硬化初期癌症
有抗放射作用，能改善机体虚弱疲劳；与细胞毒 药物合用，能提高细胞毒药物对癌细胞的选择性 作用；与红霉素合用，能降低其毒性，提高抗癌 疗效
一、 材料与方法的选择
➢ 核酸存在于各种生物中。临床常见的样品 有血液、尿液、唾液、头发、组织及培养 细胞等。
➢ 核酸分离与纯化的方法非常多。如何选择 合适的分离与纯化方法是一个首要的问题。 因为不同的研究目的对核酸的完整性、产 量、纯度和浓度有不同的要求。
➢ 近年来，试剂盒(Kit)的开发与自动化仪器 的使用大大提高了分离与纯化的效率。
RNA酶抑制剂：
1. 皂土：带负电荷，能吸附RNase，使其失活。
2. DEPC(焦碳酸二乙酯 )：通过和RNA酶的活性基团组氨酸
的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
(二) 核酸的分离与纯化
利用核酸与其它物质在一个或多个性质 上的差异设计有效方案，才能使核酸得以分 离。核酸与其它物质的差异包括细胞定位与 组织分布上的差异、物理化学性质上的不同 以及各自独特的生物学特性。
2. RNA分离纯化----Trizol一步法
• TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织 中提取总RNA。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用 是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯 酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因 此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙 醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。