分子生物学检验技术-第五章 核酸的分离与纯化
《核酸的分离纯化》课件
《核酸的分离纯化》课件课程目标：1. 理解核酸分离纯化的意义和重要性。
2. 掌握核酸分离纯化的基本原理和步骤。
3. 学习核酸分离纯化的实验操作技巧。
4. 了解核酸分离纯化在科学研究和临床诊断中的应用。
第一部分：核酸分离纯化的意义和重要性1. 核酸的定义和功能核酸是生物体内携带遗传信息的分子，包括DNA和RNA。
核酸在遗传信息的传递、基因表达调控和疾病发生中起着重要作用。
2. 核酸分离纯化的意义核酸分离纯化是研究核酸结构和功能的基础。
核酸分离纯化有助于研究基因表达调控、基因突变和基因功能。
核酸分离纯化在临床诊断和疾病治疗中具有重要意义，如病原体检测、基因突变筛查和个体化治疗。
第二部分：核酸分离纯化的基本原理和步骤1. 核酸分离纯化的基本原理根据核酸的物理化学性质，如大小、电荷、亲和性和稳定性等，进行分离纯化。
常用的分离纯化方法包括离心、电泳、亲和色谱和质谱等。
2. 核酸分离纯化的基本步骤样品处理：收集含有核酸的样品，如细胞裂解、核提取等。
核酸释放：通过机械或化学方法将核酸从样品中释放出来。
核酸沉淀：通过盐析、酒精沉淀等方法将核酸从溶液中沉淀下来。
核酸洗涤：去除沉淀中的杂质，如蛋白、RNA等。
核酸纯化：通过柱层析、亲和色谱等方法进一步纯化核酸。
核酸鉴定：通过紫外线吸收、琼脂糖凝胶电泳等方法检测核酸的质量和数量。
第三部分：核酸分离纯化的实验操作技巧1. 样品处理技巧细胞裂解：使用酶或化学方法裂解细胞，释放核酸。
核提取：使用盐水或缓冲液提取核酸。
2. 核酸沉淀技巧盐析：加入高盐浓度使核酸沉淀。
酒精沉淀：加入酒精使核酸沉淀。
3. 核酸洗涤技巧离心：使用离心机去除沉淀中的杂质。
洗涤缓冲液：选择适当的洗涤缓冲液去除杂质。
4. 核酸纯化技巧柱层析：使用固定相和流动相进行核酸纯化。
亲和色谱：利用核酸与特定配体之间的亲和力进行纯化。
5. 核酸鉴定技巧紫外线吸收：测量核酸在紫外线波段的吸光度。
琼脂糖凝胶电泳：将核酸样品在琼脂糖凝胶上进行电泳，观察核酸的迁移率和条带形状。
核酸的分离纯化技术
核酸的分离纯化技术从细胞中提取核酸后，仍混杂着蛋白质、多糖和各种大小分子核酸同类物。
除去这些“杂质”的过程，也就是核酸提纯过程。
在核酸的分离纯化时，为防止核酸大分子的变性降解，必须在0～4℃的低温条件下操作。
核酸酶的水解作用，是过去制备具有活性核酸大分子的严重障碍，现普遍采用加入去污剂或加入EDTA、8-羟基喹啉、柠檬酸钠以除去核酸酶的激活剂Mg2+，就可以抑制核酸酶的活性，保证在提纯过程中核酸大分子的完整。
关于核酸分离纯化阶段中除去多糖、蛋白质及不同类型核酸之间分离的一些方法，分别介绍如下：（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化学性质与核酸有许多相似之处，常在提取液中残存下来。
除去的方法常有：①取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大大减少。
②加入淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。
③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中。
④以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离。
（2）蛋白质的除去：由于核酸在细胞内以核蛋白体形式存在，不论采用哪种方法提取核酸，蛋白质都不同程度地存在于体系中。
因此，除去蛋白质是核酸分离纯化不可避免的步骤。
常用方法有下列几种：①加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。
去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用，效果更加理想。
②氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。
此法在分离纯化中也常反复使用。
③苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白质则沉淀于酚层，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA 或DNA，残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。
（3）不同类型核酸的分离：两种类型核酸的制备过程中，DNA制品中混杂着少量RNA或RNA制品中混杂着少量DNA是经常发生的。
核酸分离纯化
当前你正在浏览到的事第一页PPTT，共六十三页。
概述
• 核酸的分类、分布及意义
• 核酸分离纯化的意义 • 核酸的存在方式：DNP、RNP
• 核酸的结构特征
当前你正在浏览到的事第二页PPTT，共六十三页。
核酸分离的技术路线
ETOH ppt
Phenol
ProtK
SDS
Spin
Chloro
当前你正在浏览到的事第二十三页PPTT，共六十三页。
DNA样品的纯化： 1. 分子大，容易断裂 2.容易污染其它来源的DNA
纯化方法： 1.透析
2.层析
3.选择性沉淀
4.凝胶电泳
当前你正在浏览到的事第二十四页PPTT，共六十三页。
Agarose Gel Electrophoresis
_
+
片段回收
核酸的浓缩、沉淀与洗涤： 1.浓缩：提高样品浓度； 2.沉淀：常用的浓缩方法，如醋酸钠、
醋酸铵等 3.洗涤：除去共沉淀的盐，常用70%-
75%的乙醇。
当前你正在浏览到的事第九页PPTT，共六十三页。
三、核酸的鉴定与保存
浓度鉴定： 1. 紫外分光光度法：
原理：紫外吸收特性
粗略定量：1 OD相当于 50g/ml双链DNA， 38g/ml单链 DNA或单链RNA，33g/ml单链寡聚核苷酸；
tissue
Paper Towels
当前你正在浏览到的事第三页PPTT，共六十三页。
1
第一节 核酸分离与纯化的原则
• 材料与方法的选择原则 • 技术路线的设计 • 核酸的鉴定与保存
当前你正在浏览到的事第四页PPTT，共六十三页。
一、材料与方法的选择
实验要求： 1.质量高:完整性、产量、纯度和浓度符 合实验要求； 2.方法好：简便快速、安全、经济； 3.标本易得:血液、尿液、组织切块、培 养的细胞和细菌等。
医学课件-核酸的分离与纯化
课程背景
化学组成
核酸是由核苷酸构成的，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两种。
结构特征
DNA的双螺旋结构以及RNA的单链结构是核酸的典型结构特征。
核酸简介
获得高纯度核酸
提高核酸检测灵敏度
研究和开发需求
分离与纯化的目的
02
核酸的分离
将生物样品处理成匀浆或细胞裂解液，以便释放其中的核酸。
要点一
要点二
自动化和智能化
未来的核酸分离和纯化技术将更加注重自动化和智能化，能够实现自动化操作、减少人为误差和增加批量化生产的能力。
应用领域的拓展
随着生命科学和医学的不断发展和进步，核酸分离和纯化技术的应用领域也将不断拓展，将会有更多的应用场景和用途被发现和应用。
要点三
谢谢您的观看
THANKS
xx年xx月xx日
医学课件-核酸的分离与纯化
CATALOGUE
目录
引言核酸的分离核酸的纯化核酸的鉴定实验方案设计总结与展望
01
引言
核酸是生物体内的重要遗传物质，对于研究基因组、基因表达、基因功能等生物学核心问题具有重要意义。
生物学研究需求
随着生物学和生物技术学的不断发展，不断有新的核酸分离与纯化方法和技术出现，推动了医学和生物医学领域的发展。
步骤
将细胞裂解后，加入酚氯仿混合液，充分混匀，离心，取上清液，再加入氯仿充分混匀，离心，取上清液，最后加入异戊醇沉淀核酸。
实验方案设计一：酚氯仿抽提法
原理
乙醇沉淀法是一种利用乙醇沉淀核酸的方法。
步骤
将细胞裂解后，加入乙醇，充分混匀，离心，弃去上清液，再加入乙醇洗涤沉淀，离心，弃去上清液，最后干燥沉淀得到核酸。
核酸的分离与纯化
实验室常见样本核酸提取方法
——痰标本提取方法：
Saccomno液：每50毫升固定液中含50％ 乙醇48 mL，2％聚乙
二醇1 mL、0.3利福平1 mL ；
DTT (二硫苏糖醇)液: 0.1g DTT、0.78g NaCl、0.02g KCl、
核酸提取方法——分离与纯化
——盐析法
产量较低，但方法简单，比较酚氯仿方法无化学危害； 同样不适合大规模自动化提取。 提取好的DNA用蛋白酶处理纯度会提高。
核酸提取方法——分离与纯化
——硅胶吸附法
1、细胞裂解和酶处理同前述；
2、处理好的裂解液转入硅胶离心柱，高速离心，利用硅胶可以吸附核酸 而不能与其它物质如蛋白质，脂类等结合的特点，洗脱这类杂质；
STE 等)
在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋 白质和多糖沉淀,核酸释放到水相；某些缓冲液中的一些金属离 子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子 Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。
核酸提取方法——细胞裂解
——酶作用（生物作用）：
实验室常见样本核酸提取方法
——血清样本核酸提取方法：
血清中微生物来源RNA提取方法： 1、 酚氯仿法； 繁琐，手工操作重复性较差
2、磁珠法； 方便，易于自动化，重复性很好，成本较高
实验室常见样本核酸提取方法
——血清样本核酸提取方法：
血清中循环核酸提取方法： 1、酚氯仿法；
2、磁珠法；
人类基因组、发生肿瘤时异常升高；-孕妇的循环核酸亦可来源于 胎儿。
主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、 植物蛋白酶或链酶蛋白酶) 以使细胞破裂,核 酸释放。
核酸的分离与纯化
荧光光度法： 原理：核酸的荧光染料溴化乙锭（EB）嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线 激发下发出检红色的荧光，且荧光强度积分与核酸含量呈正比。 灵敏度：1-5ng
核酸的分离与纯化
基本知识回顾
核酸(nucleic acid)：以核苷酸为基本组成单位 的生物 核酸 信息大分子
具有复杂的结构
DNA 天然存在的核酸 RNA
重要的功能 信息的载体 信息的储存、传递与表达
基本知识回顾
DNP-脱氧核糖核蛋白 RNP-核糖核蛋白 真核生物-染色体DNA和细胞器DNA 原核生物-双链环装质粒DNA
三、鉴定与保存
2.纯度鉴定： 2.纯度鉴定： 纯度鉴定
紫外分光光度法
DNA：在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280比值为1.8 蛋白质（280nm）与酚（270nm）使比值下降 RNA（260nm）使比值升高
RNA：在TE缓冲液中，纯RNA的A260/A280比值为2.0，但由于RNA二级 结构不同，其读数可能在1.8-2.1之间波动。 鉴定RNA纯度所用溶液的pH会影响A260/A280读数。
1.DEAE纤维素膜插片电泳法：阴离子交换；500bp－5kb 2.电泳洗脱法：切胶纯化 3.冷冻挤压法：液氮冷冻挤压；<5kb 4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法：切胶纯化；PFGE高分子量DNA
从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA 从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段 DNA片段
压碎与浸泡法：能较好回收<1kb的DNA，回收率依分子量不同为30-90％， DNA纯度高，无酶抑制剂，是小片断DNA回收的较好方法。
医学课件-核酸的分离与纯化
xx年xx月xx日
目 录
• 核酸的分离与纯化概述 • 核酸的分离与纯化技术 • 核酸的分离与纯化步骤 • 核酸的分离与纯化挑战及解决方案 • 核酸的分离与纯化展望
01
核酸的分离与纯化概述
核酸的分离与纯化的定义和重要性
定义
核酸的分离与纯化是生物学和医学研究中的一项基本技术， 主要是通过一系列的离心、过滤、萃取等步骤将样品中的核 酸与其他大分子物质、小分子物质、细胞结构等进行分离， 同时进一步纯化核酸的过程。
核酸的鉴定和检测
核酸鉴定
利用紫外吸收光谱、分子量测定、凝胶电泳等方法，对纯化的核酸进行鉴定 ，确认其是否为目标核酸。
核酸检测
利用特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，检测目标核酸的存在和含量 。
04
核酸的分离与纯化挑战及解决方案
样品中核酸的降解和损失问题
稳定性差
核酸在体内易被核酸酶降解，影响分离效果。
鉴定方法选择
采用多种鉴定方法，如琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，以确保鉴 定结果的准确性。
标准化操作
通过使用标准化的操作流程和试剂盒，减少操作误差。
05
核酸的分离与纯化展望
核酸的分离与纯化技术的发展趋势
高效分离方法
在核酸分离方面，开发高效、快速、安全的分离方法将是未来的发展趋势，例如 ，改进离心技术、色谱技术等，提高分离效率和纯度。
生物技术应用
核酸的分离与纯化在生物技术领域也具有很大的应用潜力， 例如，用于基因工程、细胞工程和蛋白质工程等领域。通过 核酸分离，可以获得特定基因序列，用于基因克隆、基因敲 除和蛋白质表达等研究。
核酸的分离与纯化技术的未来研究方向
新技术的研发
核酸的分离与纯化讲解
• 二.质粒和噬菌体DNA的提取和纯化
• （一）质粒DNA的提取 • 基本步骤 • 1.细菌的培养 • 2.细菌的收集与裂解 • 3.质粒DNA的纯化 • 提取方法
• 煮沸法： • 碱法：最常用的质粒DNA提取方法。 • SDS法：
• （二）噬菌体DNA的提取
• 1.细菌培养 • 2.细菌的感染及裂解 • 3.噬菌体的沉淀及纯化 • 4.噬菌体DNA的提取
• 图1 玻璃砂研磨提取总DNA的电泳结果
• 1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法 • 1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶
• 图2 氧化铝研磨提取总DNA的电泳结果
• 1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法 • 1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶
一、概述
• 核酸分离提取的原则 • 常用方法及基本原理 • DNA的分离纯化 • RNA的分离纯化
第一节 核酸分离提取的原则
• 一、基本原则
• 1.保证核酸一级结构的完整性。 • 2.排除其它分子的污染。
• 二、注意事项
• 1.简化操作步骤，减少对核酸的破坏。 • 2.避免过酸（碱）等化学因素的影响（pH4～10）。 • 3.减少物理因素对核酸的降解。 • 4.防止核酸的生物降解。
• ③分离浮力密度不同的DNA分子或其他分子颗粒， 如图1。
图1 氯化铯梯度纯化λ噬菌体
噬菌体在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间形成一肉眼可 见的带。在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间可看到一个 由噬菌体颗粒形成的浅蓝色带。
• ④纯化DNA分子。在中性CsCl溶液中，DNA的 浮力密度为1.7g/ml，RNA为2.0g/ml，蛋白 质的浮力密度为1.3～1.4g/ml。在起始密度 为1.7g/ml的CsCl溶液中进行超速离心，可 以很好地将三者区分开。蛋白质浮在上层液 面，DNA分子在离心管中间形成区带，RNA沉 于管底，从而达到从DNA样品中去除微量RNA 和蛋白质的目的。
《分子生物学》课件——核酸的分离与纯化
保持核酸的完整性
遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构还 决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。
温度不要过高； 控制pH值范围（pH值4-10）；
保持一定离子强度； 减少物理因素对核酸的机械剪切力；
防止核酸酶对核酸的降解。
核酸提取步骤
细胞裂解
酶处理
核酸与其他生物 大分子物质分离
裂解液、 洗涤液、 洗脱液转入位置
硅胶层 液体流出管道
核酸分离与纯化方法
磁珠硅胶吸附法 加热煮沸法 玻璃缠绕法
甲酰胺解聚法 离子交换层析 密度梯度离心法
……
小结
核酸的分离与纯化
背景 核酸存在的形式 提取核酸的原则 保持核酸完整性
提取核酸步骤 核酸分离与纯化方法
思考题
核酸分离与纯化的步骤有哪些？
核酸与其他生物 大分子物质分离
核酸纯化
根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染， 并除去提取过程中的系列试剂（盐、有机溶剂 等）杂质，最后得到均一的核酸样品。
核酸分离与纯化方法
酚/氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。 氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚， 同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振荡，为防止气泡和促使水相与 有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醇=25:24:1）。
DNA 细胞核DNP线粒体 环状DNA。 RNA 细胞质中，mRNA，rRNA，tRNA。
提取核酸总的原则
➢ 保证核酸一级结构的完整性； ➢ 排除其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度； ➢ 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； ➢ 其他核酸分子，也应尽量去除。
《核酸的分离与纯化》课件
凝胶层析
柱体上填充的凝胶为物质提供 分子筛作用，不同大小的分子 在凝胶中被阻碍的程度不同。
结论与要点
1 核酸是由核苷酸组成的生物高分子。 2 常见的核酸类型有DNA和RNA。
3 分离技术包括盐析、凝胶电泳、超
速离心和柱层析等。
5 超速离心技术包括差速离心和密度
梯度离心。
4 凝胶电泳可分为琼脂糖凝胶、聚丙
差速离心
通过旋转离心管，根据密度差异使分子分层。
密度梯度离心
将不同密度的离子或分子加入离心管，创建密 度梯度，然后离心管使分子按照密度梯度分 层。
柱层析
吸附层析
利用柱体上填充的化学吸附剂 与物质的亲和性差异使其分离。
离子交换层析
利用电荷性质进行分离，负载 离子的功能团能够与物质中带 正电荷的离子相互作用。
《核酸的分离与纯化》 PPT课件
此课件旨在介绍核酸的分离与纯化方法，从而为纯核酸的获得提供帮助。
核酸是什么
1 分子组成
核酸是由核苷酸组成的生物高分子。每个核苷酸由糖、碱基和磷酸基团三部分组成。
2 功能与作用
核酸参与了生命活动的多个方面，包括传递遗传信息、调控基因表达等。
3 常见类型
常见的核酸有DNA、RNA等多种类型，它们在分子组成和生物功能上存在差异。
核酸的分离方法
1
盐析
通过调节溶液的离子强度，使核酸与溶
凝胶电泳
2
液中的其他物质分离。
利用电场作用使核酸在凝胶中移动，根
据大小和电荷差异分离不同的核酸。
3
超速离心
通过调节离心力和离心时间，使不同重
柱层析
4
量的分子沉淀到不同位置。
利用柱体中填充的吸附剂、离子交换剂、 凝胶等材料，按照不同的物性实现分离。
核酸分离与纯化技术的实验操作步骤
核酸分离与纯化技术的实验操作步骤引言：核酸分离与纯化技术是现代生命科学研究中不可或缺的重要手段。
在分子生物学研究中，分离和纯化核酸的高效率和高质量是保证实验结果准确性的关键。
本文将介绍一种常用的核酸分离与纯化技术，并详细叙述其实验操作步骤。
材料与设备准备：首先，我们需要准备以下实验材料与设备：1. 厌氧蒸馏水：用于制备实验过程中所需的缓冲液和试剂；2. 离心管：用于收集和离心样品；3. 磁力搅拌器：用于在适当温度下进行试剂反应；4. 超低温冰箱：用于保存实验动物组织和细胞样品；5. 离心机：用于离心样品以分离细胞碎片和细胞核；6. 高速离心机：用于离心样品以分离核酸；7. 离心管架：用于固定离心管，防止其在离心过程中翻倒。
实验操作步骤：一、细胞收获与裂解1. 从培养皿中收集待处理的细胞，并用无菌生理盐水洗涤一次，去除培养基残留。
2. 加入适量的细胞裂解缓冲液（含有蛋白酶抑制剂）裂解细胞，在低温条件下搅拌1-2小时。
二、细胞碎片与细胞核的分离1. 将裂解后的细胞样品离心10分钟，离心速度2000g，室温，将上清液（上清液中包含细胞碎片和核糖核蛋白等）转移到新的离心管中。
2. 将上清液进行二次离心，离心速度10000g， 10分钟，4℃。
3. 丢弃上清液中的细胞碎片，在室温下用冷蒸馏水悬浮沉淀。
三、核酸的纯化1. 向沉淀中加入适量的核酸提取试剂，充分悬浮沉淀，并在室温下搅拌5-10分钟。
2. 通过离心的方式将沉淀分离，离心速度10000g，10分钟，室温。
3. 取出上清液（富含核酸）放入离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后放置于室温下搅拌10分钟。
4. 通过离心分离异丙醇上清液和沉淀，离心速度10000g，10分钟，室温。
5. 倒掉上清液，用70%无菌酒精洗涤沉淀。
将酒精去除后，用离心机低速离心，离心速度2000g，5分钟，即可获得纯化的核酸。
结论：通过上述实验操作步骤，我们可以成功地进行核酸的分离与纯化。
医学课件-核酸的分离与纯化
医学课件-核酸的分离与纯化xx年xx月xx日•核酸的概述•核酸的分离技术•核酸的纯化技术目录•核酸分离与纯化的应用01核酸的概述1核酸的化学组成23核酸的基本组成单位，由碱基、戊糖和磷酸组成。
核苷酸以脱氧核糖为戊糖，主要分布在细胞核中，是细胞内遗传信息的主要载体。
脱氧核糖核酸（DNA）以核糖为戊糖，主要分布在细胞质中，参与蛋白质合成和其他细胞活动。
核糖核酸（RNA）03核酸的功能作为遗传信息的载体，参与蛋白质合成、基因表达调控等生命活动。
核酸的结构与功能01DNA的双螺旋结构由两条反向平行的多核苷酸链组成，互补碱基对之间的氢键连接维持其稳定性。
02RNA的结构多样性根据功能不同，RNA可形成单链、双链或复杂的三级结构，如核糖体、microRNA等。
分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。
核酸的分类与分布根据来源分为编码RNA和非编码RNA。
根据功能DNA主要分布在细胞核中，RNA 主要分布在细胞质中。
分布02核酸的分离技术低速离心机用于分离小分子物质，如蛋白质、核酸等。
高速离心机用于分离大分子物质，根据物质的不同密度和粒径进行分离。
微量离心机用于分离小量样品，如血液、组织等。
离心分离技术电泳分离技术凝胶电泳用于分离大分子物质，如蛋白质、核酸等。
聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分离蛋白质、多肽等小分子物质。
等电聚焦电泳用于分离具有等电点的蛋白质等生物分子。
常用的色谱分离技术，可用于分离各种物质，如蛋白质、核酸等。
柱色谱将样品在薄层板上进行分离，适用于小量样品的分离。
薄层色谱一种高分离效能的色谱技术，可用于分离各种物质，如蛋白质、核酸等。
高效液相色谱色谱分离技术03核酸的纯化技术原理分子筛层析是一种根据分子大小不同对样品进行分离的方法。
它利用了分子筛的孔径大小，只有符合孔径大小的分子才能进入分子筛内部，从而达到分离效果。
分子筛层析应用分子筛层析在核酸纯化中广泛应用于分离和纯化DNA和RNA，特别是对于较大分子的分离效果更佳。
核酸提取与纯化
核酸提取与纯化1. 引言核酸提取与纯化技术是分子生物学研究中的一项基本操作。
随着分子生物学研究的深入，核酸提取与纯化技术变得越来越重要。
通过提取和纯化核酸，可以从生物样本中分离出DNA和RNA，并用于后续的实验分析，如PCR、测序、基因克隆等。
本文将介绍核酸提取与纯化的基本原理、常用方法以及注意事项，以帮助读者更好地理解和应用这一技术。
2. 核酸提取与纯化的基本原理核酸提取与纯化的基本原理是利用不同物质间的化学和物理性质的差异实现核酸的分离和纯化。
一般情况下，核酸提取与纯化的基本步骤包括细胞破碎、核酸溶解、核酸分离、纯化和沉淀。
下面将逐步介绍每个步骤的原理。
2.1 细胞破碎细胞破碎是核酸提取与纯化的第一步，目的是将细胞破坏，释放出细胞内的核酸。
常见的细胞破碎方法包括机械破碎、化学破碎和酶解。
机械破碎是通过物理力量（如搅拌、振荡、高压等）破坏细胞结构，使细胞内的核酸释放。
化学破碎则是利用化学物质（如酸、碱、溶剂等）破坏细胞膜和核酸结构，使核酸溶解。
酶解则是利用特定酶（如蛋白酶、核酸酶等）降解细胞内的蛋白质和核酸，使核酸得以释放。
2.2 核酸溶解核酸溶解是在细胞破碎后，将核酸从其他组分中溶解出来。
核酸的溶解需要满足一定的条件，如适当的温度、pH值和离子浓度等。
常见的核酸溶解缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、EDTA缓冲液和含有盐的缓冲液等。
这些缓冲液能够提供适当的pH值和离子浓度，有利于核酸的稳定和溶解。
2.3 核酸分离核酸分离是将溶解的核酸与其他杂质分离的过程。
核酸的分离可通过差速离心、柱层析和电泳等方法实现。
差速离心是利用离心力将核酸与其他物质分离的方法。
由于核酸的分子量较大，其在离心过程中沉降速度较慢，从而与其他物质分离。
柱层析则是利用柱状填料的吸附、分配和排除等原理，通过溶液在柱中的流动进行分离，将核酸与其他组分分离。
电泳是利用核酸在电场中的迁移速度的差异进行分离的方法。
2.4 核酸纯化核酸纯化是将分离的核酸进一步纯化，去除可能存在的杂质。
核酸的分讲义离纯化及鉴定技术生化分析详解
核酸的分讲义离纯化及鉴定技术生化分析详解核酸的分离纯化及鉴定技术在生化分析领域具有重要的应用价值。
核酸是生物体内重要的生物大分子，它们具有保存、传递和表达遗传信息的功能。
为了研究核酸的结构和功能，需要对其进行分离、纯化和鉴定。
本文将详细介绍核酸的分离纯化和鉴定技术的生物化学分析。
1.核酸的提取与分离核酸提取是获得核酸样品的第一步，通过破碎细胞膜和细胞壁来释放核酸。
核酸的提取方法主要包括酸性酚/氯仿提取法、盐酸酚/氯仿提取法以及商业化的核酸提取试剂盒等。
2.核酸的纯化核酸提取后，常常需要对核酸进行纯化。
纯化目的是去除杂质，使核酸得到高纯度、高浓度、完整和可靠的分离。
核酸纯化方法主要有：凝胶柱层析、离心柱层析、沉淀、电泳、凝胶电泳纯化、离心纯化、溶液法纯化等。
3.核酸的鉴定核酸的鉴定一般包括酶切鉴定、PCR扩增鉴定和测序鉴定等。
(1)酶切鉴定酶切鉴定是通过限制性内切酶作用分析核酸的序列和结构。
通过将样品与不同酶切加入，并经过酶切电泳后，观察电泳图的特征带，可以推测样品的核酸类型和纯度。
(2)PCR扩增鉴定PCR扩增鉴定是通过聚合酶链式反应（PCR）扩增特定片段的核酸。
通过选择特异的引物，可以扩增出目标核酸片段，从而确定核酸的存在和纯度。
(3)测序鉴定测序鉴定是通过测序技术研究核酸的序列。
常见的测序技术包括Sanger测序、下一代测序（NGS）和单分子测序等。
通过测序，可以确定核酸的准确序列，从而判断核酸的类型和功能。
整体而言，核酸的分离纯化及鉴定技术是生化分析中核心的内容。
通过这些技术，可以获得高纯度、高质量的核酸样品，并准确地鉴定核酸的存在和序列信息。
这些技术的应用广泛，包括基因组学、生物信息学、分子生物学、疾病诊断和药物研发等领域。
随着生化分析技术的不断发展，核酸的分离纯化及鉴定技术将越来越重要，为科学研究和生物医学领域的发展提供强有力的支持。
分子生物学检验技术-第五章 核酸的分离与纯化
纯度标准： 纯DNA：A260/A280=1.8 比值<1.8 蛋白质、酚（A270）污染 比值>1.8 RNA污染 比值〧1.8 也可能既有蛋白质污染，又有 RNA污染。需结合电泳方法进一步鉴定。
纯RNA: A260/A280=2.0（1.8~2.1） 由于受pH影响，应用水溶液加空白对照测定 A260/A280 。
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的鉴定与保存
荧光光度法： 琼脂糖凝胶电泳鉴定。 电泳完毕后，将胶在荧光染料溴化乙锭的水溶 液中染色 ；经紫外光照射可发射出红橙色荧光。
琼脂糖凝胶电泳技术
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的鉴定与保存
DNA电泳区带
DNA分子大，电泳时 移动速度慢，电泳条带位 于点样孔附近。
2）RNA的储存
储存液： PH：0.3mol/L NaAc溶液或三蒸水， -700C； RNA酶抑制剂 焦碳酸二乙酯（DEPC） RNase阻抑蛋白（RNasin） 氧钒核糖核苷复合物（VRC） 或70%乙醇或甲酰胺溶液，-200C。
工作液： 小量分装，相同条件储存。
第二节 真核基因组DNA的分离纯化
真核生物基因组DNA的分离纯化
技术路线
核酸的释放
核酸的分离、纯化（包括粗分离和细分离）
核酸的浓缩、沉淀与洗涤 核酸的鉴定与保存
生物体组织细胞 细胞裂解 蛋白质变性沉淀降解 DNA释放 酚抽提法 玻棒缠绕法 基因组 DNA粗品 AGE分离 PFGE分离 PAGE分离 甲酰胺解聚法 粗分离
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的鉴定与保存
《核酸分离纯化》课件
《核酸分离纯化》课件一、课件概述核酸分离纯化是分子生物学和生物技术领域中的一项基本技术，其目的是从复杂的生物样品中提取和纯化出高质量的核酸，以便进行后续的分析和应用。
本课件将介绍核酸分离纯化的基本原理、方法和步骤，帮助学生掌握这一技术。
二、课件内容1. 核酸分离纯化的意义核酸是生物体内重要的遗传物质，其分离纯化对于研究基因表达、基因调控、基因突变等方面具有重要意义。
核酸分离纯化是进行基因克隆、基因测序、PCR等实验的基础步骤。
2. 核酸分离纯化的基本原理核酸的物理化学性质：核酸具有一定的溶解度、吸附性、变性温度等。
核酸与蛋白质、RNA、DNA等分子的差异：通过特定条件下对不同分子的相互作用进行分离。
利用核酸的特异性：通过特定酶的作用，实现对核酸的分离纯化。
3. 核酸分离纯化的方法盐析法：利用核酸在高盐浓度下的溶解度降低，将核酸与其他物质分离。
有机溶剂沉淀法：利用有机溶剂（如酚、氯仿等）与水相不相溶的性质，将核酸与其他物质分离。
吸附法：利用特定吸附剂（如硅胶、纤维素等）对核酸的选择性吸附，将核酸与其他物质分离。
透析法：利用透析袋的选择性透过性，将核酸与其他大分子物质分离。
酶法：利用特定酶（如DNA酶、RNA酶等）对核酸的降解作用，实现对核酸的分离纯化。
4. 核酸分离纯化的步骤样品处理：取适量生物样品，加入适量裂解液，进行充分搅拌，使细胞破碎并释放核酸。
核酸提取：将样品转移至离心管中，进行高速离心，将核酸沉淀与其他物质分离。
核酸纯化：根据核酸的物理化学性质，选择适当的分离方法（如盐析、有机溶剂沉淀等），将核酸与其他物质分离。
核酸洗涤：用适量的洗涤液对核酸沉淀进行洗涤，去除残留的杂质。
核酸重悬：加入适量的溶解液，将核酸沉淀重悬，以便进行后续分析或应用。
5. 实验操作注意事项实验操作应在生物安全柜中进行，避免交叉污染。
实验过程中应使用无RNA酶、无DNA酶的试剂和工具。
实验操作过程中应注意个人防护，避免接触核酸样品。
第五章 核酸的分离纯化
六、 DNA片段的回收
（一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 （二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段
六、 DNA片段的回收
（一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法 2.电泳洗脱法 3.冷冻挤压法 4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法
电泳到DEAE-纤维素膜 ： DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有 负电荷的DNA分子。 在所需条带前插入DEAT-纤维素膜，继续电泳 至条带DNA都到膜上，取出洗下。 500bp-5kb的DNA片段回收率较好，纯度高。但 不适用于分子量超过10kb和单链DNA。
哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线
第二节 真核基因组DNA的分离纯化
一、酚抽提法 二、甲酰胺解聚法 三、玻棒缠绕法 四、其它方法 五、DNA片段的纯化 六、DNA片段的回收
一、酚抽提法
DNA酚抽提法示意图
一、酚抽提法
• 该法于1976年由Stafford及其同事创立，现在使 用的是改进的方法
二、技术路线的设计
（一）核酸的释放 （二）核酸的分离与纯化 （三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤
二、技术路线的设计
（一）核酸的释放
DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因 此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释 放核酸。
表５-１ 各种组织细胞破碎方法
Ⅰ机械法 Ⅱ物理法 Ⅲ化学法
细胞破碎方法
1匀浆法 2捣碎法 3研磨法 1超声法 2反复冻融法 3冷热交替法 4低渗裂解 1有机溶剂 2去垢剂 3酶解法
第五章 核酸的分离纯化
第一节 核酸分离纯化的设计及原则 第二节 基因组DNA的分离纯化 第三节 质粒DNA的提取与纯化 第四节 RNA的分离纯化
第一节 核酸分离纯化的设计及原则
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
二、技术路线的设计
总技术路线： 核酸的释放
核酸的分离、纯化(包括粗分离和细分离)
核酸的浓缩、沉淀与洗涤 核酸的鉴定与保存
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的释放
（一）核酸的释放
分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分 子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出 来，并保持原来的天然状态和生物活性。
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的鉴定与保存
浓度测定方法： 10ul DNA+990ul双蒸水，测A260值。 记录A值，通过计算确定DNA浓度， 公式如下: dsDNAg/ml=50×A260 × 稀释倍数
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的鉴定与保存
第五章 核酸的分离与纯化
生物大分子分离纯化设计总原则
应遵循的总原则： 一是保持生物大分子序列的完整性 二是保证生物大分子制品的纯度
核酸分离纯化的设计及原则
第一节 核酸分离纯化的设计及原则
应遵循的原则： 一是保持核酸序列的完整性 这是是结构 研究和基因诊断的基本要求。通常要求得 到的片段的长度不小于100-200kb。 二是保证核酸制品的纯度 尽量排除其它 分子对后续研究的干扰。
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的鉴定与保存
（四）核酸的鉴定与保存
核酸的鉴定： 浓度鉴定 纯度鉴定 完整性鉴定
核酸分离纯化的设计及原则—技术度法： 由于嘌呤碱和嘧啶碱具 有共轭双键结构，具有 独特的紫外线吸收光谱， 一般在260nm左右有最大 吸收峰，可以作为核酸 及其组份定性和定量测 定的依据。检测灵敏度 0.25ug/ml（250ng/ml）。
核酸分离纯化的设计及原则—材料与方法选择
一、材料与方法的选择
（一）材料与方法的选择 可选择的生物标本：体液（血液、尿液、唾液、痰 液、胸腹水）、组织块、培养细胞等。
可选择的分离方法：酚抽提法、甲酰胺解聚法；异 硫氰酸胍-酚-氯仿法等。 方法选择原则：在满足研究或检测对核酸完整性和 纯度要求前提下，尽可能考虑核酸制备的时间、成 本、实验室安全性。
分离对象的基本情况
核酸存在形式 核蛋白(nucleoprotein) DNA + 蛋白质（deoxyribonucleoprotein, DNP ） RNA + 蛋白质（ribonucleoprotein, RNP ） 核酸的细胞定位、结构 真核生物核酸的分布： 核内染色体DNA、细胞器DNA；细胞质RNA 原核生物核酸的分布： “染色体”DNA、质粒DNA 病毒核酸： DNA、RNA病毒 单、双链（环或线状） 核酸的理化性质 基因组大小：病毒、原核、真核生物基因组 化学性质：在一定pH范围内 DNA对碱相对稳定 RNA对酸相对稳定
分离纯化核酸的第一步 的过程。
裂解细胞、释放核酸
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的释放
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的释放
裂解细胞的方法
机械法裂解细胞： 机械 电动捣碎机 匀浆器破碎 石英砂研磨 高压挤压 物理 超声波破碎 液氮冷冻研磨 可用于植物细胞和细菌细胞的裂解。 由于机械法损坏高分子量的线性DNA分子，一般不 提倡。
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的浓缩与洗涤
（三）核酸的沉淀浓缩与洗涤
浓缩提取液中核酸 ，同时进一步除去杂质和无机离 子的过程。
浓缩方法： 有机溶剂沉淀 是浓缩核酸和进一步去除杂质的最 好方法，是必不可少过程。 常用：盐类（醋酸铵） + 有机溶剂（乙醇）沉淀法。
洗涤 70-75%乙醇洗涤是同时沉淀核酸和去除盐类 的方法。
核酸分离纯化的设计及原则—保持核酸完整性和纯度
（二）保持核酸的完整性和纯度
影响完整性的因素： 物理 机械力、高温、辐射等 化学 强酸、强碱、有机溶剂 生物学 DNA酶(DNase) 、RNA酶(RNase)
核酸分离纯化的设计及原则—保持核酸完整性和纯度
措施： 为了得到完整的大分子核酸，一般要注意3点 : 1．保持低温（0º ～4℃），避免剧烈搅拌，避免辐射。 2．防止过酸、过碱。 缓冲液pH 4-10（DNA的pH8.3，RNA的pH4.5-5.5） 3．防止核酸酶的作用。 DNase抑制剂-- EDTA络合 Ca++,Mg++二价阳离子; Rnase抑制剂— 异硫氰酸胍等。
核酸分离纯化的设计及原则—保持核酸完整性和纯度
影响纯度的因素： 核酸污染 如外源核酸 蛋白质、多糖、脂类物质的污染 化学试剂污染…… 措施： 在建立和选择有效的分离纯化方法基础 上，避免污染：所有器皿清洁消毒、无 菌操作；用于分离不同核酸的器材应分 开，尽量采用一次性用品；增加纯化步 骤。
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的鉴定与保存
吸光度换算为浓度： 1.000A260=50ug/ml ds-DNA（双链DNA） 1.000A260=33ug/ml ss-DNA （单链DNA） 1.000A260=40ug/ml ss-RNA （单链RNA）
背景扣除： A260- A310(盐吸光度)
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的释放
非机械法裂解细胞： 干燥法 溶胞法 化学试剂与蛋白水解酶裂解细 胞，方法温和，有较高得率和较好核酸 完整性，普遍采用，如SDS-PK裂解细胞。
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的释放
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的分离与纯化
（二）核酸的分离与纯化
分离与纯化：利用一个或多个理化性质上的区别从 复杂的细胞裂解物中提取核酸或除去污染物的过程。 应去除的三类污染物： 1、非核酸的大分子污染物 蛋白质、多糖、脂类； 2、非需要的核酸分子； 3、对后续研究与诊断有影响的溶液与试剂。
步骤越多，纯度越高；步骤越少，结构完整性越好。