分子生物学检验技术-第五章 核酸的分离与纯化
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《核酸的分离纯化》课件
《核酸的分离纯化》课件课程目标：1. 理解核酸分离纯化的意义和重要性。
2. 掌握核酸分离纯化的基本原理和步骤。
3. 学习核酸分离纯化的实验操作技巧。
4. 了解核酸分离纯化在科学研究和临床诊断中的应用。
第一部分：核酸分离纯化的意义和重要性1. 核酸的定义和功能核酸是生物体内携带遗传信息的分子，包括DNA和RNA。
核酸在遗传信息的传递、基因表达调控和疾病发生中起着重要作用。
2. 核酸分离纯化的意义核酸分离纯化是研究核酸结构和功能的基础。
核酸分离纯化有助于研究基因表达调控、基因突变和基因功能。
核酸分离纯化在临床诊断和疾病治疗中具有重要意义，如病原体检测、基因突变筛查和个体化治疗。
第二部分：核酸分离纯化的基本原理和步骤1. 核酸分离纯化的基本原理根据核酸的物理化学性质，如大小、电荷、亲和性和稳定性等，进行分离纯化。
常用的分离纯化方法包括离心、电泳、亲和色谱和质谱等。
2. 核酸分离纯化的基本步骤样品处理：收集含有核酸的样品，如细胞裂解、核提取等。
核酸释放：通过机械或化学方法将核酸从样品中释放出来。
核酸沉淀：通过盐析、酒精沉淀等方法将核酸从溶液中沉淀下来。
核酸洗涤：去除沉淀中的杂质，如蛋白、RNA等。
核酸纯化：通过柱层析、亲和色谱等方法进一步纯化核酸。
核酸鉴定：通过紫外线吸收、琼脂糖凝胶电泳等方法检测核酸的质量和数量。
第三部分：核酸分离纯化的实验操作技巧1. 样品处理技巧细胞裂解：使用酶或化学方法裂解细胞，释放核酸。
核提取：使用盐水或缓冲液提取核酸。
2. 核酸沉淀技巧盐析：加入高盐浓度使核酸沉淀。
酒精沉淀：加入酒精使核酸沉淀。
3. 核酸洗涤技巧离心：使用离心机去除沉淀中的杂质。
洗涤缓冲液：选择适当的洗涤缓冲液去除杂质。
4. 核酸纯化技巧柱层析：使用固定相和流动相进行核酸纯化。
亲和色谱：利用核酸与特定配体之间的亲和力进行纯化。
5. 核酸鉴定技巧紫外线吸收：测量核酸在紫外线波段的吸光度。
琼脂糖凝胶电泳：将核酸样品在琼脂糖凝胶上进行电泳，观察核酸的迁移率和条带形状。
核酸的分离纯化技术
核酸的分离纯化技术从细胞中提取核酸后，仍混杂着蛋白质、多糖和各种大小分子核酸同类物。
除去这些“杂质”的过程，也就是核酸提纯过程。
在核酸的分离纯化时，为防止核酸大分子的变性降解，必须在0～4℃的低温条件下操作。
核酸酶的水解作用，是过去制备具有活性核酸大分子的严重障碍，现普遍采用加入去污剂或加入EDTA、8-羟基喹啉、柠檬酸钠以除去核酸酶的激活剂Mg2+，就可以抑制核酸酶的活性，保证在提纯过程中核酸大分子的完整。
关于核酸分离纯化阶段中除去多糖、蛋白质及不同类型核酸之间分离的一些方法，分别介绍如下：（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化学性质与核酸有许多相似之处，常在提取液中残存下来。
除去的方法常有：①取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大大减少。
②加入淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。
③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中。
④以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离。
（2）蛋白质的除去：由于核酸在细胞内以核蛋白体形式存在，不论采用哪种方法提取核酸，蛋白质都不同程度地存在于体系中。
因此，除去蛋白质是核酸分离纯化不可避免的步骤。
常用方法有下列几种：①加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。
去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用，效果更加理想。
②氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。
此法在分离纯化中也常反复使用。
③苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白质则沉淀于酚层，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA 或DNA，残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。
（3）不同类型核酸的分离：两种类型核酸的制备过程中，DNA制品中混杂着少量RNA或RNA制品中混杂着少量DNA是经常发生的。
核酸分离纯化
核酸分离纯化
当前你正在浏览到的事第一页PPTT，共六十三页。
概述
• 核酸的分类、分布及意义
• 核酸分离纯化的意义 • 核酸的存在方式：DNP、RNP
• 核酸的结构特征
当前你正在浏览到的事第二页PPTT，共六十三页。
核酸分离的技术路线
ETOH ppt
Phenol
ProtK
SDS
Spin
Chloro
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DNA样品的纯化： 1. 分子大，容易断裂 2.容易污染其它来源的DNA
纯化方法： 1.透析
2.层析
3.选择性沉淀
4.凝胶电泳
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Agarose Gel Electrophoresis
_
+
片段回收
核酸的浓缩、沉淀与洗涤： 1.浓缩：提高样品浓度； 2.沉淀：常用的浓缩方法，如醋酸钠、
醋酸铵等 3.洗涤：除去共沉淀的盐，常用70%-
75%的乙醇。
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三、核酸的鉴定与保存
浓度鉴定： 1. 紫外分光光度法：
原理：紫外吸收特性
粗略定量：1 OD相当于 50g/ml双链DNA， 38g/ml单链 DNA或单链RNA，33g/ml单链寡聚核苷酸；
tissue
Paper Towels
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1
第一节 核酸分离与纯化的原则
• 材料与方法的选择原则 • 技术路线的设计 • 核酸的鉴定与保存
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一、材料与方法的选择
实验要求： 1.质量高:完整性、产量、纯度和浓度符 合实验要求； 2.方法好：简便快速、安全、经济； 3.标本易得:血液、尿液、组织切块、培 养的细胞和细菌等。
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概述
• 核酸的分类、分布及意义
• 核酸分离纯化的意义 • 核酸的存在方式：DNP、RNP
• 核酸的结构特征
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核酸分离的技术路线
ETOH ppt
Phenol
ProtK
SDS
Spin
Chloro
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DNA样品的纯化： 1. 分子大，容易断裂 2.容易污染其它来源的DNA
纯化方法： 1.透析
2.层析
3.选择性沉淀
4.凝胶电泳
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Agarose Gel Electrophoresis
_
+
片段回收
核酸的浓缩、沉淀与洗涤： 1.浓缩：提高样品浓度； 2.沉淀：常用的浓缩方法，如醋酸钠、
醋酸铵等 3.洗涤：除去共沉淀的盐，常用70%-
75%的乙醇。
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三、核酸的鉴定与保存
浓度鉴定： 1. 紫外分光光度法：
原理：紫外吸收特性
粗略定量：1 OD相当于 50g/ml双链DNA， 38g/ml单链 DNA或单链RNA，33g/ml单链寡聚核苷酸；
tissue
Paper Towels
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第一节 核酸分离与纯化的原则
• 材料与方法的选择原则 • 技术路线的设计 • 核酸的鉴定与保存
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一、材料与方法的选择
实验要求： 1.质量高:完整性、产量、纯度和浓度符 合实验要求； 2.方法好：简便快速、安全、经济； 3.标本易得:血液、尿液、组织切块、培 养的细胞和细菌等。
医学课件-核酸的分离与纯化
技术发展推动
课程背景
化学组成
核酸是由核苷酸构成的，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两种。
结构特征
DNA的双螺旋结构以及RNA的单链结构是核酸的典型结构特征。
核酸简介
获得高纯度核酸
提高核酸检测灵敏度
研究和开发需求
分离与纯化的目的
02
核酸的分离
将生物样品处理成匀浆或细胞裂解液，以便释放其中的核酸。
要点一
要点二
自动化和智能化
未来的核酸分离和纯化技术将更加注重自动化和智能化，能够实现自动化操作、减少人为误差和增加批量化生产的能力。
应用领域的拓展
随着生命科学和医学的不断发展和进步，核酸分离和纯化技术的应用领域也将不断拓展，将会有更多的应用场景和用途被发现和应用。
要点三
谢谢您的观看
THANKS
xx年xx月xx日
医学课件-核酸的分离与纯化
CATALOGUE
目录
引言核酸的分离核酸的纯化核酸的鉴定实验方案设计总结与展望
01
引言
核酸是生物体内的重要遗传物质，对于研究基因组、基因表达、基因功能等生物学核心问题具有重要意义。
生物学研究需求
随着生物学和生物技术学的不断发展，不断有新的核酸分离与纯化方法和技术出现，推动了医学和生物医学领域的发展。
步骤
将细胞裂解后，加入酚氯仿混合液，充分混匀，离心，取上清液，再加入氯仿充分混匀，离心，取上清液，最后加入异戊醇沉淀核酸。
实验方案设计一：酚氯仿抽提法
原理
乙醇沉淀法是一种利用乙醇沉淀核酸的方法。
步骤
将细胞裂解后，加入乙醇，充分混匀，离心，弃去上清液，再加入乙醇洗涤沉淀，离心，弃去上清液，最后干燥沉淀得到核酸。
课程背景
化学组成
核酸是由核苷酸构成的，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两种。
结构特征
DNA的双螺旋结构以及RNA的单链结构是核酸的典型结构特征。
核酸简介
获得高纯度核酸
提高核酸检测灵敏度
研究和开发需求
分离与纯化的目的
02
核酸的分离
将生物样品处理成匀浆或细胞裂解液，以便释放其中的核酸。
要点一
要点二
自动化和智能化
未来的核酸分离和纯化技术将更加注重自动化和智能化，能够实现自动化操作、减少人为误差和增加批量化生产的能力。
应用领域的拓展
随着生命科学和医学的不断发展和进步，核酸分离和纯化技术的应用领域也将不断拓展，将会有更多的应用场景和用途被发现和应用。
要点三
谢谢您的观看
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医学课件-核酸的分离与纯化
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目录
引言核酸的分离核酸的纯化核酸的鉴定实验方案设计总结与展望
01
引言
核酸是生物体内的重要遗传物质，对于研究基因组、基因表达、基因功能等生物学核心问题具有重要意义。
生物学研究需求
随着生物学和生物技术学的不断发展，不断有新的核酸分离与纯化方法和技术出现，推动了医学和生物医学领域的发展。
步骤
将细胞裂解后，加入酚氯仿混合液，充分混匀，离心，取上清液，再加入氯仿充分混匀，离心，取上清液，最后加入异戊醇沉淀核酸。
实验方案设计一：酚氯仿抽提法
原理
乙醇沉淀法是一种利用乙醇沉淀核酸的方法。
步骤
将细胞裂解后，加入乙醇，充分混匀，离心，弃去上清液，再加入乙醇洗涤沉淀，离心，弃去上清液，最后干燥沉淀得到核酸。
核酸的分离与纯化
3、Saccomno液+DTT
实验室常见样本核酸提取方法
——痰标本提取方法：
Saccomno液：每50毫升固定液中含50％ 乙醇48 mL，2％聚乙
二醇1 mL、0.3利福平1 mL ；
DTT (二硫苏糖醇)液: 0.1g DTT、0.78g NaCl、0.02g KCl、
核酸提取方法——分离与纯化
——盐析法
产量较低，但方法简单，比较酚氯仿方法无化学危害； 同样不适合大规模自动化提取。 提取好的DNA用蛋白酶处理纯度会提高。
核酸提取方法——分离与纯化
——硅胶吸附法
1、细胞裂解和酶处理同前述；
2、处理好的裂解液转入硅胶离心柱，高速离心，利用硅胶可以吸附核酸 而不能与其它物质如蛋白质，脂类等结合的特点，洗脱这类杂质；
STE 等)
在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋 白质和多糖沉淀,核酸释放到水相；某些缓冲液中的一些金属离 子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子 Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。
核酸提取方法——细胞裂解
——酶作用（生物作用）：
实验室常见样本核酸提取方法
——血清样本核酸提取方法：
血清中微生物来源RNA提取方法： 1、 酚氯仿法； 繁琐，手工操作重复性较差
2、磁珠法； 方便，易于自动化，重复性很好，成本较高
实验室常见样本核酸提取方法
——血清样本核酸提取方法：
血清中循环核酸提取方法： 1、酚氯仿法；
2、磁珠法；
人类基因组、发生肿瘤时异常升高；-孕妇的循环核酸亦可来源于 胎儿。
主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、 植物蛋白酶或链酶蛋白酶) 以使细胞破裂,核 酸释放。
实验室常见样本核酸提取方法
——痰标本提取方法：
Saccomno液：每50毫升固定液中含50％ 乙醇48 mL，2％聚乙
二醇1 mL、0.3利福平1 mL ；
DTT (二硫苏糖醇)液: 0.1g DTT、0.78g NaCl、0.02g KCl、
核酸提取方法——分离与纯化
——盐析法
产量较低，但方法简单，比较酚氯仿方法无化学危害； 同样不适合大规模自动化提取。 提取好的DNA用蛋白酶处理纯度会提高。
核酸提取方法——分离与纯化
——硅胶吸附法
1、细胞裂解和酶处理同前述；
2、处理好的裂解液转入硅胶离心柱，高速离心，利用硅胶可以吸附核酸 而不能与其它物质如蛋白质，脂类等结合的特点，洗脱这类杂质；
STE 等)
在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋 白质和多糖沉淀,核酸释放到水相；某些缓冲液中的一些金属离 子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子 Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。
核酸提取方法——细胞裂解
——酶作用（生物作用）：
实验室常见样本核酸提取方法
——血清样本核酸提取方法：
血清中微生物来源RNA提取方法： 1、 酚氯仿法； 繁琐，手工操作重复性较差
2、磁珠法； 方便，易于自动化，重复性很好，成本较高
实验室常见样本核酸提取方法
——血清样本核酸提取方法：
血清中循环核酸提取方法： 1、酚氯仿法；
2、磁珠法；
人类基因组、发生肿瘤时异常升高；-孕妇的循环核酸亦可来源于 胎儿。
主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、 植物蛋白酶或链酶蛋白酶) 以使细胞破裂,核 酸释放。
核酸的分离与纯化
紫外分光光度法： 原理：核酸分子成分中的碱基具有一定的紫外线吸收特性。核酸的最大吸收波长为 260nm，溶液中核酸的浓度与溶液在260nm紫外线下的吸光度（修正参数：A260－A310）成 正比。 灵敏度：0.25ug/ml
荧光光度法： 原理：核酸的荧光染料溴化乙锭（EB）嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线 激发下发出检红色的荧光，且荧光强度积分与核酸含量呈正比。 灵敏度：1-5ng
核酸的分离与纯化
基本知识回顾
核酸(nucleic acid)：以核苷酸为基本组成单位 的生物 核酸 信息大分子
具有复杂的结构
DNA 天然存在的核酸 RNA
重要的功能 信息的载体 信息的储存、传递与表达
基本知识回顾
DNP-脱氧核糖核蛋白 RNP-核糖核蛋白 真核生物-染色体DNA和细胞器DNA 原核生物-双链环装质粒DNA
三、鉴定与保存
2.纯度鉴定： 2.纯度鉴定： 纯度鉴定
紫外分光光度法
DNA：在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280比值为1.8 蛋白质（280nm）与酚（270nm）使比值下降 RNA（260nm）使比值升高
RNA：在TE缓冲液中，纯RNA的A260/A280比值为2.0，但由于RNA二级 结构不同，其读数可能在1.8-2.1之间波动。 鉴定RNA纯度所用溶液的pH会影响A260/A280读数。
1.DEAE纤维素膜插片电泳法：阴离子交换；500bp－5kb 2.电泳洗脱法：切胶纯化 3.冷冻挤压法：液氮冷冻挤压；<5kb 4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法：切胶纯化；PFGE高分子量DNA
从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA 从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段 DNA片段
压碎与浸泡法：能较好回收<1kb的DNA，回收率依分子量不同为30-90％， DNA纯度高，无酶抑制剂，是小片断DNA回收的较好方法。
荧光光度法： 原理：核酸的荧光染料溴化乙锭（EB）嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线 激发下发出检红色的荧光，且荧光强度积分与核酸含量呈正比。 灵敏度：1-5ng
核酸的分离与纯化
基本知识回顾
核酸(nucleic acid)：以核苷酸为基本组成单位 的生物 核酸 信息大分子
具有复杂的结构
DNA 天然存在的核酸 RNA
重要的功能 信息的载体 信息的储存、传递与表达
基本知识回顾
DNP-脱氧核糖核蛋白 RNP-核糖核蛋白 真核生物-染色体DNA和细胞器DNA 原核生物-双链环装质粒DNA
三、鉴定与保存
2.纯度鉴定： 2.纯度鉴定： 纯度鉴定
紫外分光光度法
DNA：在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280比值为1.8 蛋白质（280nm）与酚（270nm）使比值下降 RNA（260nm）使比值升高
RNA：在TE缓冲液中，纯RNA的A260/A280比值为2.0，但由于RNA二级 结构不同，其读数可能在1.8-2.1之间波动。 鉴定RNA纯度所用溶液的pH会影响A260/A280读数。
1.DEAE纤维素膜插片电泳法：阴离子交换；500bp－5kb 2.电泳洗脱法：切胶纯化 3.冷冻挤压法：液氮冷冻挤压；<5kb 4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法：切胶纯化；PFGE高分子量DNA
从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA 从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段 DNA片段
压碎与浸泡法：能较好回收<1kb的DNA，回收率依分子量不同为30-90％， DNA纯度高，无酶抑制剂，是小片断DNA回收的较好方法。
医学课件-核酸的分离与纯化
医学课件-核酸的分离与纯化
xx年xx月xx日
目 录
• 核酸的分离与纯化概述 • 核酸的分离与纯化技术 • 核酸的分离与纯化步骤 • 核酸的分离与纯化挑战及解决方案 • 核酸的分离与纯化展望
01
核酸的分离与纯化概述
核酸的分离与纯化的定义和重要性
定义
核酸的分离与纯化是生物学和医学研究中的一项基本技术， 主要是通过一系列的离心、过滤、萃取等步骤将样品中的核 酸与其他大分子物质、小分子物质、细胞结构等进行分离， 同时进一步纯化核酸的过程。
核酸的鉴定和检测
核酸鉴定
利用紫外吸收光谱、分子量测定、凝胶电泳等方法，对纯化的核酸进行鉴定 ，确认其是否为目标核酸。
核酸检测
利用特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，检测目标核酸的存在和含量 。
04
核酸的分离与纯化挑战及解决方案
样品中核酸的降解和损失问题
稳定性差
核酸在体内易被核酸酶降解，影响分离效果。
鉴定方法选择
采用多种鉴定方法，如琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，以确保鉴 定结果的准确性。
标准化操作
通过使用标准化的操作流程和试剂盒，减少操作误差。
05
核酸的分离与纯化展望
核酸的分离与纯化技术的发展趋势
高效分离方法
在核酸分离方面，开发高效、快速、安全的分离方法将是未来的发展趋势，例如 ，改进离心技术、色谱技术等，提高分离效率和纯度。
生物技术应用
核酸的分离与纯化在生物技术领域也具有很大的应用潜力， 例如，用于基因工程、细胞工程和蛋白质工程等领域。通过 核酸分离，可以获得特定基因序列，用于基因克隆、基因敲 除和蛋白质表达等研究。
核酸的分离与纯化技术的未来研究方向
新技术的研发
xx年xx月xx日
目 录
• 核酸的分离与纯化概述 • 核酸的分离与纯化技术 • 核酸的分离与纯化步骤 • 核酸的分离与纯化挑战及解决方案 • 核酸的分离与纯化展望
01
核酸的分离与纯化概述
核酸的分离与纯化的定义和重要性
定义
核酸的分离与纯化是生物学和医学研究中的一项基本技术， 主要是通过一系列的离心、过滤、萃取等步骤将样品中的核 酸与其他大分子物质、小分子物质、细胞结构等进行分离， 同时进一步纯化核酸的过程。
核酸的鉴定和检测
核酸鉴定
利用紫外吸收光谱、分子量测定、凝胶电泳等方法，对纯化的核酸进行鉴定 ，确认其是否为目标核酸。
核酸检测
利用特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，检测目标核酸的存在和含量 。
04
核酸的分离与纯化挑战及解决方案
样品中核酸的降解和损失问题
稳定性差
核酸在体内易被核酸酶降解，影响分离效果。
鉴定方法选择
采用多种鉴定方法，如琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，以确保鉴 定结果的准确性。
标准化操作
通过使用标准化的操作流程和试剂盒，减少操作误差。
05
核酸的分离与纯化展望
核酸的分离与纯化技术的发展趋势
高效分离方法
在核酸分离方面，开发高效、快速、安全的分离方法将是未来的发展趋势，例如 ，改进离心技术、色谱技术等，提高分离效率和纯度。
生物技术应用
核酸的分离与纯化在生物技术领域也具有很大的应用潜力， 例如，用于基因工程、细胞工程和蛋白质工程等领域。通过 核酸分离，可以获得特定基因序列，用于基因克隆、基因敲 除和蛋白质表达等研究。
核酸的分离与纯化技术的未来研究方向
新技术的研发
核酸的分离与纯化讲解
• 二.质粒和噬菌体DNA的提取和纯化
• （一）质粒DNA的提取 • 基本步骤 • 1.细菌的培养 • 2.细菌的收集与裂解 • 3.质粒DNA的纯化 • 提取方法
• 煮沸法： • 碱法：最常用的质粒DNA提取方法。 • SDS法：
• （二）噬菌体DNA的提取
• 1.细菌培养 • 2.细菌的感染及裂解 • 3.噬菌体的沉淀及纯化 • 4.噬菌体DNA的提取
• 图1 玻璃砂研磨提取总DNA的电泳结果
• 1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法 • 1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶
• 图2 氧化铝研磨提取总DNA的电泳结果
• 1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法 • 1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶
一、概述
• 核酸分离提取的原则 • 常用方法及基本原理 • DNA的分离纯化 • RNA的分离纯化
第一节 核酸分离提取的原则
• 一、基本原则
• 1.保证核酸一级结构的完整性。 • 2.排除其它分子的污染。
• 二、注意事项
• 1.简化操作步骤，减少对核酸的破坏。 • 2.避免过酸（碱）等化学因素的影响（pH4～10）。 • 3.减少物理因素对核酸的降解。 • 4.防止核酸的生物降解。
• ③分离浮力密度不同的DNA分子或其他分子颗粒， 如图1。
图1 氯化铯梯度纯化λ噬菌体
噬菌体在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间形成一肉眼可 见的带。在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间可看到一个 由噬菌体颗粒形成的浅蓝色带。
• ④纯化DNA分子。在中性CsCl溶液中，DNA的 浮力密度为1.7g/ml，RNA为2.0g/ml，蛋白 质的浮力密度为1.3～1.4g/ml。在起始密度 为1.7g/ml的CsCl溶液中进行超速离心，可 以很好地将三者区分开。蛋白质浮在上层液 面，DNA分子在离心管中间形成区带，RNA沉 于管底，从而达到从DNA样品中去除微量RNA 和蛋白质的目的。
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二、技术路线的设计
总技术路线： 核酸的释放
核酸的分离、纯化(包括粗分离和细分离)
核酸的浓缩、沉淀与洗涤 核酸的鉴定与保存
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的释放
（一）核酸的释放
分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分 子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出 来，并保持原来的天然状态和生物活性。
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的鉴定与保存
浓度测定方法： 10ul DNA+990ul双蒸水，测A260值。 记录A值，通过计算确定DNA浓度， 公式如下: dsDNAg/ml=50×A260 × 稀释倍数
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的鉴定与保存
第五章 核酸的分离与纯化
生物大分子分离纯化设计总原则
应遵循的总原则： 一是保持生物大分子序列的完整性 二是保证生物大分子制品的纯度
核酸分离纯化的设计及原则
第一节 核酸分离纯化的设计及原则
应遵循的原则： 一是保持核酸序列的完整性 这是是结构 研究和基因诊断的基本要求。通常要求得 到的片段的长度不小于100-200kb。 二是保证核酸制品的纯度 尽量排除其它 分子对后续研究的干扰。
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的鉴定与保存
（四）核酸的鉴定与保存
核酸的鉴定： 浓度鉴定 纯度鉴定 完整性鉴定
核酸分离纯化的设计及原则—技术度法： 由于嘌呤碱和嘧啶碱具 有共轭双键结构，具有 独特的紫外线吸收光谱， 一般在260nm左右有最大 吸收峰，可以作为核酸 及其组份定性和定量测 定的依据。检测灵敏度 0.25ug/ml（250ng/ml）。
核酸分离纯化的设计及原则—材料与方法选择
一、材料与方法的选择
（一）材料与方法的选择 可选择的生物标本：体液（血液、尿液、唾液、痰 液、胸腹水）、组织块、培养细胞等。
可选择的分离方法：酚抽提法、甲酰胺解聚法；异 硫氰酸胍-酚-氯仿法等。 方法选择原则：在满足研究或检测对核酸完整性和 纯度要求前提下，尽可能考虑核酸制备的时间、成 本、实验室安全性。
分离对象的基本情况
核酸存在形式 核蛋白(nucleoprotein) DNA + 蛋白质（deoxyribonucleoprotein, DNP ） RNA + 蛋白质（ribonucleoprotein, RNP ） 核酸的细胞定位、结构 真核生物核酸的分布： 核内染色体DNA、细胞器DNA；细胞质RNA 原核生物核酸的分布： “染色体”DNA、质粒DNA 病毒核酸： DNA、RNA病毒 单、双链（环或线状） 核酸的理化性质 基因组大小：病毒、原核、真核生物基因组 化学性质：在一定pH范围内 DNA对碱相对稳定 RNA对酸相对稳定
分离纯化核酸的第一步 的过程。
裂解细胞、释放核酸
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的释放
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的释放
裂解细胞的方法
机械法裂解细胞： 机械 电动捣碎机 匀浆器破碎 石英砂研磨 高压挤压 物理 超声波破碎 液氮冷冻研磨 可用于植物细胞和细菌细胞的裂解。 由于机械法损坏高分子量的线性DNA分子，一般不 提倡。
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的浓缩与洗涤
（三）核酸的沉淀浓缩与洗涤
浓缩提取液中核酸 ，同时进一步除去杂质和无机离 子的过程。
浓缩方法： 有机溶剂沉淀 是浓缩核酸和进一步去除杂质的最 好方法，是必不可少过程。 常用：盐类（醋酸铵） + 有机溶剂（乙醇）沉淀法。
洗涤 70-75%乙醇洗涤是同时沉淀核酸和去除盐类 的方法。
核酸分离纯化的设计及原则—保持核酸完整性和纯度
（二）保持核酸的完整性和纯度
影响完整性的因素： 物理 机械力、高温、辐射等 化学 强酸、强碱、有机溶剂 生物学 DNA酶(DNase) 、RNA酶(RNase)
核酸分离纯化的设计及原则—保持核酸完整性和纯度
措施： 为了得到完整的大分子核酸，一般要注意3点 : 1．保持低温（0º ～4℃），避免剧烈搅拌，避免辐射。 2．防止过酸、过碱。 缓冲液pH 4-10（DNA的pH8.3，RNA的pH4.5-5.5） 3．防止核酸酶的作用。 DNase抑制剂-- EDTA络合 Ca++,Mg++二价阳离子; Rnase抑制剂— 异硫氰酸胍等。
核酸分离纯化的设计及原则—保持核酸完整性和纯度
影响纯度的因素： 核酸污染 如外源核酸 蛋白质、多糖、脂类物质的污染 化学试剂污染…… 措施： 在建立和选择有效的分离纯化方法基础 上，避免污染：所有器皿清洁消毒、无 菌操作；用于分离不同核酸的器材应分 开，尽量采用一次性用品；增加纯化步 骤。
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的鉴定与保存
吸光度换算为浓度： 1.000A260=50ug/ml ds-DNA（双链DNA） 1.000A260=33ug/ml ss-DNA （单链DNA） 1.000A260=40ug/ml ss-RNA （单链RNA）
背景扣除： A260- A310(盐吸光度)
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的释放
非机械法裂解细胞： 干燥法 溶胞法 化学试剂与蛋白水解酶裂解细 胞，方法温和，有较高得率和较好核酸 完整性，普遍采用，如SDS-PK裂解细胞。
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的释放
核酸分离纯化的设计及原则—技术路线的设计—核酸的分离与纯化
（二）核酸的分离与纯化
分离与纯化：利用一个或多个理化性质上的区别从 复杂的细胞裂解物中提取核酸或除去污染物的过程。 应去除的三类污染物： 1、非核酸的大分子污染物 蛋白质、多糖、脂类； 2、非需要的核酸分子； 3、对后续研究与诊断有影响的溶液与试剂。
步骤越多，纯度越高；步骤越少，结构完整性越好。