核酸分离和纯化

纯化 CsCL-EB法 聚乙二醇沉淀法 柱层析法 回收：与基因组DNA类似

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4.3 RNA的分离和纯化

RNA易被RNase水解，RNase除细胞内还广泛存 在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中

RNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非
常稳定

排除RNase的污染是RNA制备成功与否的关键
注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。
常用的荧光染料还有:golden view, gel red, sybr green…
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3.2.2 荧光光度法鉴定核酸纯度 原理：溴化乙锭(EB)等荧光染料示踪的核酸电
泳结果。
基 因 组 DNA
RNA
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核酸鉴定实际常用操作程序
核酸定量仪测定浓度， OD260/OD280及OD260/OD230比值。
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤： 培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离 质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实 验所需)。
选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、 大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求。
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4.2.1 质粒提取原理
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4.2.2 质粒DNA的纯化与回收
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4.1.4 DNA样品的进一步纯化

透析，沉淀，电泳，选择性沉淀
4.1.5 DNA片段的回收
原则：提高回收率，去除杂质污染 从琼脂糖凝胶中回收：
DEAE纤维素膜插片电泳法， 电泳洗脱法 冷冻挤压法 从聚丙烯酰胺凝胶中回收：压碎与浸泡
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4.2 质粒的提取和纯化


质粒的结构：超螺旋，半开环，线性DNA 理化性质：与一般核酸相似，但抗切割和 抗变性能力更强
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异丙醇
优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的 DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。

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聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量 的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意： PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L 的MgCl2。
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c．测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD 值
小分子杂质
核酸
蛋白质
d．计算浓度。 双链DNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸 稀释倍数× 50/1000； RNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释倍数×40/1000。 e．分析纯度。
核酸定量仪 可直接获得浓度， 不用计算。
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④
减少物理因素对核酸的降解，主要 是机械剪切力，其次是高温。
机械剪切力包括强力高速的振荡、突然暴 露于低渗液、样品反复冻融等。 高温，如长时间的煮沸。


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(2) 核酸纯度的要求：
①
非核酸生物大分子的污染降低到最低程 度，如蛋白质、多糖和脂类分子； 排除其它核酸分子的污染，如制备RNA 时，DNA分子是污染物； 去除对后续实验有影响的物质，如有机 溶剂和过高浓度的金属离子。
常用的试剂盒：Qiagen
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离心柱型 基因组DNA 提取步骤
裂解液+蛋白酶K 裂解细胞
缓冲液GB+乙醇 DNA柱子吸附
缓冲液GD 去除蛋白 漂洗液 漂洗DNA两次 洗脱液TE 洗脱DNA
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4.1.3 其他的基因组DNA提取方法




甲酰胺解聚法：细胞裂解步骤与酚抽提法一致， 但以高浓度甲酰胺裂解液裂解DNA与蛋白质 复合体，再以透析除去杂质 玻璃棒缠绕法：将基因组DNA沉淀缠绕于带 钩玻璃棒上带出，溶于pH8.0的TE 异丙醇沉淀法 玻璃珠吸附法
结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相 当于双链DNA浓度为50 μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
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紫外分光光度计测定核酸浓度 的操作步骤
a．分光光度计先用一定量的水校正零点。 b．吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加入到盛有一 定体积水的石英比色杯中。
DNA 核内染色体 DNA。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA，叶绿体 DNA。 质粒DNA。 RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病 毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。
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主要内容
1. 核酸分离与纯化的原则及要求 2. 核酸制备的基本步骤 3. 核酸的鉴定和保存 4. 核酸提取方法简介
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核酸的紫外吸收光谱
超微量核酸 定量仪 更加方便
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3.1.2 紫外分光光度法分析纯度
A：测DNA：
纯的DNA样品OD260/OD280=1.8 （1.7~1.9） OD260m/OD230>2.0 1) OD260/OD280>1.9, RNA污染。
2) OD260/OD280<1.6，存在蛋白质或酚污染；


去除溶液中某些盐离子与杂质；
改变核酸的溶解缓冲液。
核酸提取（离心柱型） 利用硅胶膜特异吸附核酸
DNA纯化柱
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2.3.1 核酸的有机溶液沉淀法
当核酸溶液的pH值 大于4时，核酸分子呈 多聚阴离子状态。 钾、钠、镁、锂及铵 根等阳离子形成的盐， 通过屏蔽带负电的磷酸 基团使DNA分子聚结在 一起而不溶于许多有机 溶剂。
①
尽量简化步骤，缩短提取时间，减少各种
有害因素对核酸的破坏。
②
减少化学因素对核酸的降解，pH4-10。
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③
防止核酸的生物降解（细胞内或外的 各种核酸酶水解）。
所用器械和一些试剂需高压灭菌，提取缓冲 液中需加核酸酶抑制剂。操作温度为0~4℃。

DNA酶需要金属离子Mg2+、Ca2+的激活，因此 使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等； 阴离子表面活性剂SDS。 RNA酶分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、 耐酸碱、不易失活，生物降解是RNA提取过程中 的主要危害因素。0.1%DEPC浸泡，器械180℃ 干烤8h。
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4.3.1 RNA制备的条件与环境



洁净的实验室 操作人员带口罩，勤换手套 玻璃器皿（如匀浆器）、镊子180℃干烤8 h或更长时间 枪头、EP管0.1%DEPC水浸泡过夜，再高 压；或直接购买无Rnase的枪头和EP管 冰上匀浆，4 ℃离心
后的实验。一般使用0℃冰水，10-15min，
DNA样品足可达到实验要求。
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3.
核酸的浓度和纯度的测定
3.1 紫外分光光度法鉴定核酸 3.2 荧光光度法鉴定核酸
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3.1 紫外分光光度法鉴定核酸
3.1.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂 糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml 。


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使用酚时应注意
(1）使用注意
酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈 现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物， 例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提 实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 (2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操 作时应戴手套。
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2.3 沉淀核酸

重新调整核酸的浓度，起到浓缩核酸的作用；
以含EDTA、SDS及RNase的裂解缓冲液裂解细胞， 经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提。
（DNA）
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4.1.2 基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）
原理： 在正常情况下，核酸表面覆盖了一层由水分子组 成的亲水薄膜，以维持其水溶性。高浓度盐离子 的加入破坏了核酸表面亲水薄膜的相对有序排列， 形成了疏水环境。在此环境中，核酸与硅胶膜能 有效结合，而蛋白质、代谢产物和其他污染物则 不能结合。 特点： 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉 淀等步骤。 快速，简捷。
琼脂糖电泳，UV下观察 验证纯度及判断是否降解
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3.3
(1) 对DNA
核酸的保存
TE：Tris-Cl, EDTA
① DNA样品溶于pH8.0的TE，4 ℃或-20 ℃保存； ② 长期保存样品中可加入1滴氯仿。
(2)
对RNA
① RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中， -70 ℃保存;
② 可以沉淀形式贮于乙醇，可在-20 ℃中长期保存;
③ 最常用无Rnase水或高压后的DEPC水溶解RNA，冻贮于70~-80 ℃。
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4、核酸提取方法简单介绍
4.1 基因组DNA的提取方法 4.2 质粒的提取和纯化 4.3 Trizol法提取总RNA
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4.1 基因组DNA的提取方法
4.1.1 酚抽提法
2）OD260/OD280 >2.0，可能被异硫氰酸胍等污染；
3）OD260/OD230<2.0，表明有小分子及盐存在。
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3.2 荧光光度法鉴定核酸
3.2.1 测定核酸含量：
原理：DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面 之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可发出红 色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列 已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测 DNA溶液浓度。
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精胺
精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。
原理是： 精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩 而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质 与DNA分开，达到纯化DNA的目的。
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2.3.2 核酸沉淀的温度和时间
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。
但时间过长，易导致盐与DNA共沉淀，影响以
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1. 核酸分离与纯化的原则及要求
1.1 核酸分离与纯化的一般原则
(1) 保持核酸分子一级结构的完整性，是核酸结 构和功能研究的最基本要求。
(2) 排除其他分子的污染，保证核酸的纯度。
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1.2 核酸分离与纯化的要求
(1) 为保证核酸的完整性，
化学因素？ 生物因素？ 物理因素？
（防止降解），在实验中应注意：
核酸的分离和纯化
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找答案？

核酸分离纯化的原则是什么？为防止 核酸降解需要注意什么？ 核酸制备基本步骤？

如何鉴定核酸浓度和纯度？ 核酸的保存方法有哪些？
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前言
核酸（nucleic acid）是以核苷酸为基本组成单位 的生物信息大分子。是遗传信息的携带者，是基 因表达的物质基础。
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核酸的分类：
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(3)高速组织捣碎机捣碎 (4)超声波处理法
(5)化学处理法(SDS、吐温80等）
(6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等）
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2.2 核酸分离，去除蛋白
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核 酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。
分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白 质分开，同时避免核酸降解。
3) OD260/OD230<2.0，溶液中有残存的盐和小分子杂质， 如核苷酸、氨基酸等。 注： 可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8 的情况。
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B：测RNA
纯的RNA样品OD260／OD280=2.0(1.7~2.0)
OD260/OD230>2.0
1）OD260/OD280比值太小，蛋白质或酚的污染；
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（1）加入SDS
SDS除有破膜和抑制核酸酶的作用外，还具有 使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
（2） 加入浓盐溶液（如NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使
氢键破坏，核蛋白解聚；
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（3）酚/氯仿抽提

酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑 制作用。
氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中 的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使 水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异 戊醇=25：24：1）。
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②
③
2. 核酸制备的基本步骤
I.材料准备 破碎细胞
II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，纯化并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
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2.1 破碎细胞
(1)玻璃匀浆器匀浆
(2)液氮研磨法
富含DNA酶的胰、脾、胸腺、淋巴； 富含胶原蛋白的皮肤、肌腱； 坚硬的组织如骨骼。
Na+
Mg2+
Li+
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① 核酸沉淀的盐类及浓度
盐 贮存液浓度（mol/L) 终浓度(mol/L)
MgCl2 NaAc KAc NH4Ac NaCl LiCl
1 3 (pH5.2) 3 (pH5.2) 10 5 8
0.01 0.3 0.3 2.5 0.2 0.8
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② 常用的有机沉淀剂
乙醇


优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除 去，不影响以后实验。 缺点： 需要量大，一般要求低温操作。