核酸分离和纯化
核酸的分离与纯化
核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多 糖、脂肪等生物大分子分开。 在分离核酸时，应遵循两个原则：一是保 证核酸一级结构的完整性；二是尽量排除 其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。
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核酸分离与纯化的过程一般都包括了材料 的选择、核酸的释放、核酸与其它生物大 分子的分离、核酸的纯化与鉴定、核酸的 浓缩、保存等几个主要步骤。 每一步骤又可由多种不同的方法单独或联 合实现。
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5. 质粒DNA的纯化
（1）聚乙二醇沉淀法 质粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子 RNA，并用RNase消化小分子RNA；然 后在高盐条件下，用PEG选择性地沉淀大 的质粒DNA；沉淀的质粒DNA进一步用 酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。
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（2）柱层析法 柱层析法纯化质粒DNA的关键是其填充的树脂。 树脂可分为两类：一类是利用疏水的相互作用来 纯化质粒DNA样品；一类则通过离子交换与吸附 的相互作用进行纯化。 以硅基质作为填充材料的柱层析，其作用原理是 在多盐条件下，依靠DNA与硅基质的可逆性结合 来进行纯化。通过暴露的磷酸盐残基，DNA吸附 到硅基质上，以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖 类等生物大分子，然后加入TE或水溶液使DNA 分子重新水合，并通过离心洗脱出来。
在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以
减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保
持分相的稳定性。
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为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生 自由基，如果直接用于DNA分离，会使磷酸二 酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过 高温重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl饱和酚， 并调节至中性。使用饱和酚可以减少酚吸收更 多的DNA，降低DNA的损失率。
核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述
核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述一、核酸的分离纯化技术1.超声破碎法超声破碎法是一种通过超声波的振动作用破碎细胞膜，释放细胞内的核酸分子的方法。
该方法操作简便，效果较好。
2.酚-氯仿提取法酚-氯仿提取法是一种经典的核酸提取方法，通过酚和氯仿相间重复萃取的方法，将细胞或组织中的核酸分子提取到有机相中，然后用酒精沉淀。
3.离心沉淀法离心沉淀法是利用不同物质在不同离心力下沉降速度的不同，将核酸从其他组分中分离出来的方法。
可通过高速离心使核酸沉淀到底部，将上清液中的其他杂质倒掉，最后用缓冲液重悬核酸。
4.配对离心法配对离心法是利用核酸的碱基配对性质，在特定的条件下使目标DNA 与特异性探针配对，然后通过离心将核酸-探针复合物从其他杂质中分离出来。
这种方法常用于核酸的富集和寡核苷酸修饰位点的分析。
二、核酸的鉴定技术1. 紫外-可见分光光度法（UV-Vis）紫外-可见分光光度法是通过核酸分子在紫外光或可见光波长范围内的吸收特性来确定其存在和浓度的方法。
根据核酸中含有的吸收波长为260 nm处的碱基特征吸光峰，可以判断核酸的纯度和浓度。
2.电泳分析法电泳分析法是通过核酸分子在电场中的迁移速率和特定条件下的尺寸分离效应来分析核酸的方法。
主要包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方法。
核酸经电泳后可以观察到DNA或RNA在凝胶中的特征性带状图案，确定其分子大小、纯度和带电性。
3.PCR（聚合酶链式反应）PCR是一种常用的核酸鉴定技术，通过特定引物和聚合酶的作用，在体外进行核酸的扩增以达到检测目的。
PCR可用于快速检测目标DNA的存在与否，以及定性和定量分析。
4.基因测序技术基因测序技术是指利用测序反应将核酸序列信息转化为比特（通常指二进制），然后通过计算机软件分析的方法对核酸序列进行鉴定。
常用的基因测序技术有dideoxy测序和串联反应测序。
三、应用核酸的分离纯化及鉴定技术广泛应用于生物医学研究、遗传学、分子生物学、基因工程和疾病诊断等领域。
核酸提取纯化方法
核酸提取纯化方法引言核酸提取是分子生物学研究中的一个重要步骤，它主要包括纯化 DNA 和 RNA 两种核酸的过程。
在研究领域，纯化高质量的核酸样品对于准确分析和解读生物信息至关重要。
本文将介绍几种常用的核酸提取纯化方法，包括酚-氯仿法、离心柱法和磁珠法，并对每种方法的优缺点进行评述。
1. 酚-氯仿法酚-氯仿法是一种传统的核酸提取纯化方法，它基于核酸在酚和氯仿两相体系中具有不同溶解度的原理。
具体步骤如下：1.收集待提取的样品，如细菌培养物或组织样品。
2.加入等体积的酚-氯仿溶液，同时加入破碎剂（如玻璃珠或硅胶），彻底混合。
3.离心样品，使得酚相和氯仿相分离。
4.分离上层透明的水相，其中富含 DNA 或 RNA。
5.加入冷异丙醇或乙醇，沉淀核酸。
6.通过离心将沉淀的核酸分离。
7.用缓冲液溶解核酸沉淀，获得纯化后的 DNA 或RNA 样品。
酚-氯仿法提取的核酸样品质量较高，适用于小规模样品的提取。
然而，由于该方法对操作者的技巧要求较高，并且在操作过程中可能存在酚和氯仿对人体的损害风险，所以目前已逐渐被离心柱法和磁珠法取而代之。
2. 离心柱法离心柱法是一种基于硅胶膜和纤维素膜的核酸提取纯化方法，凭借其简单、快速和高效的特点已经成为目前最常用的核酸提取方法之一。
具体步骤如下：1.添加细胞裂解缓冲液到待提取样品中，通过细胞裂解将核酸释放到溶液中。
2.准备离心柱，将离心柱放入收集管中。
3.将样品溶液加到离心柱中，使其通过硅胶膜或纤维素膜。
4.通过洗涤液洗去杂质。
5.加入低盐缓冲液或水，洗脱核酸。
6.将洗脱的核酸收集到新的收集管中。
离心柱法的优点在于简单、快速且对样品的处理量较大，能够同时提取多个样品。
然而，该方法对于某些特殊样品（如富含多酚化合物或多糖的样品）可能会产生一定的干扰。
3. 磁珠法磁珠法是一种新兴的核酸提取纯化方法，它利用了磁珠的磁性和高亲和性，能够快速、高效地提取纯化核酸。
具体步骤如下：1.准备磁珠混悬液，并加入样品。
核酸的分离与纯化.
使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉 红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如 醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验， 因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 (2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时 应戴手套。
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2.3 核酸的沉淀
沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点：
DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
（3）聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
(1） 金属离子螯合剂：
DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因 此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。 如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉； (2） 阴离于型表面活性剂：
如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还 能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷 的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电 吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非 极性的范德华力。
分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合 的蛋白质分开，同时避免核酸降解。
2.2.1 加入浓盐溶液（如NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力， 使氢键破坏，核蛋白解聚；
2.2.2 加入SDS
SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还 具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
核酸的分离与纯化
实验室常见样本核酸提取方法
——痰标本提取方法：
Saccomno液：每50毫升固定液中含50％ 乙醇48 mL，2％聚乙
二醇1 mL、0.3利福平1 mL ；
DTT (二硫苏糖醇)液: 0.1g DTT、0.78g NaCl、0.02g KCl、
核酸提取方法——分离与纯化
——盐析法
产量较低，但方法简单，比较酚氯仿方法无化学危害； 同样不适合大规模自动化提取。 提取好的DNA用蛋白酶处理纯度会提高。
核酸提取方法——分离与纯化
——硅胶吸附法
1、细胞裂解和酶处理同前述；
2、处理好的裂解液转入硅胶离心柱，高速离心，利用硅胶可以吸附核酸 而不能与其它物质如蛋白质，脂类等结合的特点，洗脱这类杂质；
STE 等)
在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋 白质和多糖沉淀,核酸释放到水相；某些缓冲液中的一些金属离 子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子 Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。
核酸提取方法——细胞裂解
——酶作用（生物作用）：
实验室常见样本核酸提取方法
——血清样本核酸提取方法：
血清中微生物来源RNA提取方法： 1、 酚氯仿法； 繁琐，手工操作重复性较差
2、磁珠法； 方便，易于自动化，重复性很好，成本较高
实验室常见样本核酸提取方法
——血清样本核酸提取方法：
血清中循环核酸提取方法： 1、酚氯仿法；
2、磁珠法；
人类基因组、发生肿瘤时异常升高；-孕妇的循环核酸亦可来源于 胎儿。
主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、 植物蛋白酶或链酶蛋白酶) 以使细胞破裂,核 酸释放。
核酸分离与纯化的技术路线与原则
核酸分离与纯化的技术路线与原则核酸包括DNA 、RNA两类分子，在细胞内均与蛋白质结合成核蛋白。
真核生物基因组中，95%DNA 为双链线性分子，存在于细胞核中，5%为双链环状分子，存在于细胞器中；原核生物DNA 及质粒DNA 为双链或单链环状分子；RNA 为单链线性分子，主要存在于细胞质中。
DNA 与RNA 性质的不同导致对其分离与纯化的条件也不相同。
一、核酸分离与纯化的原则(1)保证核酸一级结构的完整性。
生物的遗传信息全部贮存在核酸一级结构中，而且核酸的一级结构还决定其高级结构的形式及和其他大分子结合的方式。
所以，所提取的核酸一级结构的完整性直接影响着后续实验中对其结构与功能研究的质量。
因此，在制备核酸的过程中，要做到：尽量简化操作程序，缩短提取过程；避免过酸、过碱等化学因素对核酸链中磷酸二酯键的破坏，在pH 值4～10条件下进行操作；操作时动作要轻缓，提取的样品小包装保存，以免诸多的物理因素对核酸的降解；避免细胞内及环境中核酶对核酸的生物性降解。
(2)排除其他生物大分子的污染，如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应尽可能降低到最低程度，特别是提取DNA 分子时应除去RNA 分子，反之亦然。
(3)排除核酸样品中有机溶剂和过高浓度的金属离子。
二、分离与纯化的技术路线(一)核酸的释放通常情况下DNA 及RNA 均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是制备单个细胞，再破碎细胞，从而释放核酸。
破碎细胞的方法包括机械法与非机械法两大类。
机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法；非机械法可分为干燥法与溶胞法。
由于溶胞法采用适宜的化学试剂与酶，能有效地裂解细胞，方法温和，能保证较高的核酸获得率，并能较好地保持核酸的完整性，从而得到广泛的应用。
(二)核酸的分离与纯化利用核酸与其他物质性质上的差异，可以分离与纯化核酸。
这种差异包括细胞定位与组织分布上的差异，物理、化学性质上的不同，以及各自独特的生物学特性。
操作过程中，既可以从复杂样品中抽提出核酸分子，也可以将样品中的非核酸成分(非核酸的生物大分子、非需要的核酸分子及在操作过程中加入的溶液与试剂)逐步清除。
核酸的分离与纯化
2.DAPI （4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚）染色反应 DAPI 为一种荧光染料，可以穿透扰乱的细胞膜与细胞核中的双链 DNA结合而发挥标记的作用，粘附在DNA双螺旋的小沟区，可以产生 比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要 高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞 标记的效率高(几乎为100 %) ，且对活细胞无毒副作用。DAPI染色常 用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。 DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。 DAPI-DNA复合物的激发和发射波长分别为360nm和460nm
1.核酸的变性
核酸在某些物理或化学因素的作用下，其空
间结构发生改变，从而引起理化性质的改变及生 物活性的降低或丧失。
使氢键断裂，破
坏碱基堆集力，从
而引起核酸二级结 构的破坏。
2.核酸的降解 核酸的降解是指多核苷酸链的磷酸二酯键的断裂 （1）RNA的降解 在稀碱溶液中能降解生成单核苷酸的混合物， 在高温浓碱下可降解生成核苷和磷酸。在低温酸性条件下稳定，在 高温酸性条件下降解成碱基或者嘌呤碱基和嘧啶单核苷酸的混合物。 RNA在Rnase和磷酸二酯酶等的作用下，降解成3 ‘或5 ’-单核 苷酸。 （2）DNA的降解 在稀碱溶液中较稳定，但在较高浓度的碱溶液中 高温处理会降解产生单核苷酸，且嘌呤和嘧啶碱基常有破坏。在低 温的酸性条件下也比较稳定，但在高温时降解生成嘌呤碱基和嘧啶 核苷酸。 DNA在Dnase、磷酸二酯酶等的作用下。降解成3 ‘或5 ’-脱氧 核糖核苷酸。
原核生物
真核生物
70S
80S
30S 50S 40S 60S
RNA的分子结构
mRNA
第六章核酸的分离与纯化
三、鉴定、保存与应用
（一）核酸的鉴定
1．浓度鉴定核酸浓度的定量鉴定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。
（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，最大吸收波长在250nm～270nm之间。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收波长不变。由核苷酸组成核酸后，其最大吸收波长为260nm，该物理特性为测定溶液中核酸的浓度奠定了基础。在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度大约相当于50µg/ml的双链DNA，38µg/ml的单链DNA或单链RNA，33µg/ml的单链寡聚核苷酸。如果要精确定量已知序列的单链寡核苷酸分子的浓度，就必须结合其实际分子量与摩尔吸光系数，根据朗伯-比尔定律进行计算。若DNA样品中含有盐，则会使A260的读数偏高，尚需测定A310以扣除背景，并以A260与A310的差值作为定量计算的依据。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25µg/ml的核酸溶液。
2．纯度鉴定紫外分光光度法还是荧光光度法，均可用于核酸的纯度鉴定。
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（1）加入SDS
SDS除有破膜和抑制核酸酶的作用外，还具有 使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
（2） 加入浓盐溶液（如NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使
氢键破坏，核蛋白解聚；
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（3）酚/氯仿抽提
酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑 制作用。
氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中 的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使 水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异 戊醇=25：24：1）。
以含EDTA、SDS及RNase的裂解缓冲液裂解细胞， 经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提。
（DNA）
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4.1.2 基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）
原理： 在正常情况下，核酸表面覆盖了一层由水分子组 成的亲水薄膜，以维持其水溶性。高浓度盐离子 的加入破坏了核酸表面亲水薄膜的相对有序排列， 形成了疏水环境。在此环境中，核酸与硅胶膜能 有效结合，而蛋白质、代谢产物和其他污染物则 不能结合。 特点： 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉 淀等步骤。 快速，简捷。
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4.1.4 DNA样品的进一步纯化
透析，沉淀，电泳，选择性沉淀
4.1.5 DNA片段的回收
原则：提高回收率，去除杂质污染 从琼脂糖凝胶中回收：
DEAE纤维素膜插片电泳法， 电泳洗脱法 冷冻挤压法 从聚丙烯酰胺凝胶中回收：压碎与浸泡
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4.2 质粒的提取和纯化
质粒的结构：超螺旋，半开环，线性DNA 理化性质：与一般核酸相似，但抗切割和 抗变性能力更强
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②
③
2. 核酸制备的基本步骤
I.材料准备 破碎细胞
II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，纯化并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
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2.1 破碎细胞
(1)玻璃匀浆器匀浆
(2)液氮研磨法
富含DNA酶的胰、脾、胸腺、淋巴； 富含胶原蛋白的皮肤、肌腱； 坚硬的组织如骨骼。
DNA 核内染色体 DNA。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA，叶绿体 DNA。 质粒DNA。 RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病 毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。
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主要内容
1. 核酸分离与纯化的原则及要求 2. 核酸制备的基本步骤 3. 核酸的鉴定和保存 4. 核酸提取方法简介
后的实验。一般使用0℃冰水，10-15min，
DNA样品足可达到实验要求。
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3.
核酸的浓度和纯度的测定
3.1 紫外分光光度法鉴定核酸 3.2 荧光光度法鉴定核酸
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3.1 紫外分光光度法鉴定核酸
3.1.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂 糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml 。
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精胺
精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。
原理是： 精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩 而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质 与DNA分开，达到纯化DNA的目的。
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2.3.2 核酸沉淀的温度和时间
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。
但时间过长，易导致盐与DNA共沉淀，影响以
常用的试剂盒：Qiagen
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离心柱型 基因组DNA 提取步骤
裂解液+蛋白酶K 裂解细胞
缓冲液GB+乙醇 DNA柱子吸附
缓冲液GD 去除蛋白 漂洗液 漂洗DNA两次 洗脱液TE 洗脱DNA
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4.1.3 其他的基因组DNA提取方法
甲酰胺解聚法：细胞裂解步骤与酚抽提法一致， 但以高浓度甲酰胺裂解液裂解DNA与蛋白质 复合体，再以透析除去杂质 玻璃棒缠绕法：将基因组DNA沉淀缠绕于带 钩玻璃棒上带出，溶于pH8.0的TE 异丙醇沉淀法 玻璃珠吸附法
去除溶液中某些盐离子与杂质；
改变核酸的溶解缓冲液。
核酸提取（离心柱型） 利用硅胶膜特异吸附核酸
DNA纯化柱
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2.3.1 核酸的有机溶液沉淀法
当核酸溶液的pH值 大于4时，核酸分子呈 多聚阴离子状态。 钾、钠、镁、锂及铵 根等阳离子形成的盐， 通过屏蔽带负电的磷酸 基团使DNA分子聚结在 一起而不溶于许多有机 溶剂。
纯化 CsCL-EB法 聚乙二醇沉淀法 柱层析法 回收：与基因组DNA类似
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4.3 RNA的分离和纯化
RNA易被RNase水解，RNase除细胞内还广泛存 在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中
RNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非
常稳定
排除RNase的污染是RNA制备成功与否的关键
1. 核酸分离与纯化的原则及要求
1.1 核酸分离与纯化的一般原则
(1) 保持核酸分子一级结构的完整性，是核酸结 构和功能研究的最基本要求。
(2) 排除其他分子的污染，保证核酸的纯度。
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1.2 核酸分离与纯化的要求
(1) 为保证核酸的完整性，
化学因素？ 生物因素？ 物理因素？
（防止降解），在实验中应注意：
结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相 当于双链DNA浓度为50 μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
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紫外分光光度计测定核酸浓度 的操作步骤
a．分光光度计先用一定量的水校正零点。 b．吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加入到盛有一 定体积水的石英比色杯中。
3) OD260/OD230<2.0，溶液中有残存的盐和小分子杂质， 如核苷酸、氨基酸等。 注： 可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8 的情况。
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B：测RNA
纯的RNA样品OD260／OD280=2.0(1.7~2.0)
OD260/OD230>2.0
1）OD260/OD280比值太小，蛋白质或酚的污染；
注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。
常用的荧光染料还有:golden view, gel red, sybr green…
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3.2.2 荧光光度法鉴定核酸纯度 原理：溴化乙锭(EB)等荧光染料示踪的核酸电
泳结果。
基 因 组 DNA
RNA
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核酸鉴定实际常用操作程序
核酸定量仪测定浓度， OD260/OD280及OD260/OD230比值。
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④
减少物理因素对核酸的降解，主要 是机械剪切力，其次是高温。
机械剪切力包括强力高速的振荡、突然暴 露于低渗液、样品反复冻融等。 高温，如长时间的煮沸。
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(2) 核酸纯度的要求：
①
非核酸生物大分子的污染降低到最低程 度，如蛋白质、多糖和脂类分子； 排除其它核酸分子的污染，如制备RNA 时，DNA分子是污染物； 去除对后续实验有影响的物质，如有机 溶剂和过高浓度的金属离子。
② 可以沉淀形式贮于乙醇，可在-20 ℃中长期保存;
③ 最常用无Rnase水或高压后的DEPC水溶解RNA，冻贮于70~-80 ℃。
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4、核酸提取方法简单介绍
4.1 基因组DNA的提取方法 4.2 质粒的提取和纯化 4.3 Trizol法提取总RNA
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4.1 基因组DNA的提取方法
4.1.1 酚抽提法
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异丙醇
优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的 DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
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聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量 的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意： PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L 的MgCl2。
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤： 培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离 质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实 验所需)。
选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、 大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求。
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4.2.1 质粒提取原理
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4.2.2 质粒DNA的纯化与回收
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核酸的紫外吸收光谱
超微量核酸 定量仪 更加方便
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3.1.2 紫外分光光度法分析纯度
A：测DNA：
纯的DNA样品OD260/OD280=1.8 （1.7~1.9） OD260m/OD230>2.0 1) OD260/OD280>1.9, RNA污染。
2) OD260/OD280<1.6，存在蛋白质或酚污染；
琼脂糖电泳，UV下观察 验证纯度及判断是否降解
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3.3
(1) 对DNA
核酸的保存
TE：Tris-Cl, EDTA
① DNA样品溶于pH8.0的TE，4 ℃或-20 ℃保存； ② 长期保存样品中可加入1滴氯仿。
(2)
对RNA
① RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中， -70 ℃保存;
2）OD260/OD280 >2.0，可能被异硫氰酸胍等污染；
3）OD260/OD230<2.0，表明有小分子及盐存在。