核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述
核酸的提取与鉴定实验报告
核酸的提取与鉴定实验报告一、实验目的1、掌握从生物样本中提取核酸（DNA 或 RNA）的基本原理和方法。
2、学习使用各种试剂和仪器进行核酸提取的操作步骤。
3、了解核酸鉴定的常用方法及其原理。
4、培养实验操作技能和科学研究的严谨态度。
二、实验原理核酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），是生物体遗传信息的携带者。
核酸提取的基本原理是利用细胞裂解液将细胞破碎，使核酸释放出来，然后通过一系列的物理和化学方法将核酸与其他细胞成分分离，最后得到纯度较高的核酸样品。
DNA 提取常用的方法有酚氯仿抽提法、盐析法等。
酚氯仿抽提法是利用酚和氯仿的混合液去除蛋白质，然后通过乙醇沉淀得到 DNA。
盐析法是利用高浓度的盐使蛋白质变性沉淀，从而分离出 DNA。
RNA 提取常用的方法有异硫氰酸胍法、Trizol 法等。
Trizol 法是基于异硫氰酸胍和酚的作用，能够有效地裂解细胞并抑制 RNA 酶的活性，从而提取出完整的 RNA。
核酸鉴定的方法主要有紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法等。
紫外分光光度法通过测定核酸在 260nm 和 280nm 处的吸光度值（A260 和 A280）来评估核酸的纯度和浓度。
A260/A280 的比值在 18 20 之间表示 DNA 纯度较高，在 19 21 之间表示 RNA 纯度较高。
琼脂糖凝胶电泳法则是根据核酸分子在电场中的迁移率不同来分离和鉴定核酸，DNA 分子在琼脂糖凝胶中迁移距离与分子量大小成反比，RNA 通常会呈现出 28S、18S 和 5S 三条带。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的动物组织（如肝脏、肌肉等）或培养的细胞。
大肠杆菌菌液。
2、实验试剂细胞裂解液（含蛋白酶 K）。
酚氯仿混合液（酚：氯仿＝ 1:1）。
无水乙醇、75%乙醇。
3M 醋酸钠（pH 52）。
Trizol 试剂。
异丙醇。
RNA 酶抑制剂。
琼脂糖。
50×TAE 电泳缓冲液。
核酸染料（如 EB 或 GelRed）。
核酸的分离纯化技术
核酸的分离纯化技术从细胞中提取核酸后，仍混杂着蛋白质、多糖和各种大小分子核酸同类物。
除去这些“杂质”的过程，也就是核酸提纯过程。
在核酸的分离纯化时，为防止核酸大分子的变性降解，必须在0～4℃的低温条件下操作。
核酸酶的水解作用，是过去制备具有活性核酸大分子的严重障碍，现普遍采用加入去污剂或加入EDTA、8-羟基喹啉、柠檬酸钠以除去核酸酶的激活剂Mg2+，就可以抑制核酸酶的活性，保证在提纯过程中核酸大分子的完整。
关于核酸分离纯化阶段中除去多糖、蛋白质及不同类型核酸之间分离的一些方法，分别介绍如下：（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化学性质与核酸有许多相似之处，常在提取液中残存下来。
除去的方法常有：①取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大大减少。
②加入淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。
③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中。
④以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离。
（2）蛋白质的除去：由于核酸在细胞内以核蛋白体形式存在，不论采用哪种方法提取核酸，蛋白质都不同程度地存在于体系中。
因此，除去蛋白质是核酸分离纯化不可避免的步骤。
常用方法有下列几种：①加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。
去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用，效果更加理想。
②氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。
此法在分离纯化中也常反复使用。
③苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白质则沉淀于酚层，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA 或DNA，残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。
（3）不同类型核酸的分离：两种类型核酸的制备过程中，DNA制品中混杂着少量RNA或RNA制品中混杂着少量DNA是经常发生的。
核酸的提取与鉴定实验报告
核酸的提取与鉴定实验报告核酸的提取与鉴定实验报告引言：核酸是生命的基础，它存在于细胞的核内，承载着遗传信息的传递和表达。
在现代生物学研究中，核酸的提取与鉴定是非常重要的实验步骤。
本实验旨在探究核酸提取的方法以及鉴定核酸的质量和纯度。
一、核酸提取方法核酸的提取方法有多种，本实验采用了常用的酚-氯仿法。
首先，将待提取的细胞或组织样品加入细胞裂解液中，通过离心将细胞碎片沉淀下来。
然后，使用酚和氯仿进行提取，酚层中含有核酸和脂质，氯仿层中含有蛋白质。
通过离心将酚层和氯仿层分离，进一步提取纯净的核酸。
二、核酸的鉴定1. 纯度检测核酸的纯度是指核酸溶液中核酸与其他杂质的比例。
常用的纯度检测方法有比色法和光谱法。
本实验中使用了光谱法，即通过测量核酸溶液的吸光度来评估其纯度。
纯度越高，吸光度比值（A260/A280）越接近1.8。
实验结果显示，所提取的核酸样品的纯度在可接受范围内。
2. 浓度测定核酸的浓度是指单位体积核酸溶液中核酸的含量。
浓度测定常用的方法有比色法和荧光法。
本实验中采用了比色法，即通过比较核酸溶液的吸光度与标准曲线的关系来确定核酸的浓度。
实验结果显示，所提取的核酸样品的浓度为Xμg/μl。
3. 碱基组成分析核酸的碱基组成是指核酸中腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）的相对含量。
碱基组成分析可以通过核酸测序技术来完成。
本实验中使用了Sanger测序技术，通过测序结果可以确定所提取核酸的碱基组成。
4. 凝胶电泳分析凝胶电泳是一种常用的核酸分析方法，可以根据核酸的大小和电荷来分离核酸。
本实验中使用琼脂糖凝胶电泳，将提取的核酸样品与DNA分子量标准品一同加载到琼脂糖凝胶槽中，通电分离。
通过观察凝胶上的DNA条带，可以初步判断核酸的大小和纯度。
结论：通过本实验，我们成功提取了核酸样品，并进行了一系列的鉴定实验。
通过纯度检测、浓度测定、碱基组成分析和凝胶电泳分析，我们确定了所提取核酸的质量和纯度。
核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述
核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述一、核酸的分离纯化技术1.超声破碎法超声破碎法是一种通过超声波的振动作用破碎细胞膜，释放细胞内的核酸分子的方法。
该方法操作简便，效果较好。
2.酚-氯仿提取法酚-氯仿提取法是一种经典的核酸提取方法，通过酚和氯仿相间重复萃取的方法，将细胞或组织中的核酸分子提取到有机相中，然后用酒精沉淀。
3.离心沉淀法离心沉淀法是利用不同物质在不同离心力下沉降速度的不同，将核酸从其他组分中分离出来的方法。
可通过高速离心使核酸沉淀到底部，将上清液中的其他杂质倒掉，最后用缓冲液重悬核酸。
4.配对离心法配对离心法是利用核酸的碱基配对性质，在特定的条件下使目标DNA 与特异性探针配对，然后通过离心将核酸-探针复合物从其他杂质中分离出来。
这种方法常用于核酸的富集和寡核苷酸修饰位点的分析。
二、核酸的鉴定技术1. 紫外-可见分光光度法（UV-Vis）紫外-可见分光光度法是通过核酸分子在紫外光或可见光波长范围内的吸收特性来确定其存在和浓度的方法。
根据核酸中含有的吸收波长为260 nm处的碱基特征吸光峰，可以判断核酸的纯度和浓度。
2.电泳分析法电泳分析法是通过核酸分子在电场中的迁移速率和特定条件下的尺寸分离效应来分析核酸的方法。
主要包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方法。
核酸经电泳后可以观察到DNA或RNA在凝胶中的特征性带状图案，确定其分子大小、纯度和带电性。
3.PCR（聚合酶链式反应）PCR是一种常用的核酸鉴定技术，通过特定引物和聚合酶的作用，在体外进行核酸的扩增以达到检测目的。
PCR可用于快速检测目标DNA的存在与否，以及定性和定量分析。
4.基因测序技术基因测序技术是指利用测序反应将核酸序列信息转化为比特（通常指二进制），然后通过计算机软件分析的方法对核酸序列进行鉴定。
常用的基因测序技术有dideoxy测序和串联反应测序。
三、应用核酸的分离纯化及鉴定技术广泛应用于生物医学研究、遗传学、分子生物学、基因工程和疾病诊断等领域。
核酸的鉴定实验报告
一、实验目的1. 熟悉核酸提取、纯化及鉴定的基本原理和方法。
2. 掌握使用紫外分光光度计测定核酸浓度和纯度的技术。
3. 了解核酸的组成成分，包括DNA和RNA，并学会区分它们。
4. 鉴定核酸的完整性。
二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，包括DNA和RNA两种。
DNA主要存在于细胞核中，携带遗传信息；RNA则主要存在于细胞质中，参与蛋白质合成等生命活动。
1. 核酸提取：利用细胞破碎、盐析、有机溶剂抽提等方法，将核酸从细胞或其他生物材料中提取出来。
2. 核酸纯化：通过离心、凝胶电泳、柱层析等方法，去除提取过程中混入的杂质，得到纯净的核酸。
3. 核酸鉴定：利用紫外分光光度计测定核酸的浓度和纯度；通过琼脂糖凝胶电泳观察核酸的分子量大小和完整性；通过核酸序列分析确定核酸的种类和碱基序列。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌细胞、质粒DNA、RNA提取试剂盒、琼脂糖、TAE缓冲液、DNA Marker、DNA电泳试剂盒等。
2. 实验仪器：紫外分光光度计、凝胶成像系统、PCR仪、电泳仪、离心机、冰箱等。
四、实验步骤1. 核酸提取：- 将大肠杆菌细胞用超声波破碎。
- 加入RNA提取试剂盒中的试剂，进行细胞裂解和核酸释放。
- 离心分离细胞碎片和核酸。
- 收集上清液，即为提取的核酸。
2. 核酸纯化：- 将提取的核酸用乙醇沉淀。
- 离心收集沉淀，用无菌水洗涤沉淀。
- 离心收集沉淀，即为纯化的核酸。
3. 核酸鉴定：- 浓度和纯度测定：- 将纯化的核酸用紫外分光光度计测定A260/A280值，计算核酸的浓度和纯度。
- 分子量大小和完整性鉴定：- 将纯化的核酸进行琼脂糖凝胶电泳。
- 用DNA Marker作为参照，观察核酸的分子量大小和完整性。
- 核酸种类鉴定：- 对提取的核酸进行PCR扩增，检测DNA和RNA的存在。
五、实验结果与分析1. 浓度和纯度测定：- 核酸A260/A280值为1.8，说明核酸纯度较高。
核酸的分离与纯化
2.DAPI （4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚）染色反应 DAPI 为一种荧光染料，可以穿透扰乱的细胞膜与细胞核中的双链 DNA结合而发挥标记的作用，粘附在DNA双螺旋的小沟区，可以产生 比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要 高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞 标记的效率高(几乎为100 %) ，且对活细胞无毒副作用。DAPI染色常 用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。 DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。 DAPI-DNA复合物的激发和发射波长分别为360nm和460nm
1.核酸的变性
核酸在某些物理或化学因素的作用下，其空
间结构发生改变，从而引起理化性质的改变及生 物活性的降低或丧失。
使氢键断裂，破
坏碱基堆集力，从
而引起核酸二级结 构的破坏。
2.核酸的降解 核酸的降解是指多核苷酸链的磷酸二酯键的断裂 （1）RNA的降解 在稀碱溶液中能降解生成单核苷酸的混合物， 在高温浓碱下可降解生成核苷和磷酸。在低温酸性条件下稳定，在 高温酸性条件下降解成碱基或者嘌呤碱基和嘧啶单核苷酸的混合物。 RNA在Rnase和磷酸二酯酶等的作用下，降解成3 ‘或5 ’-单核 苷酸。 （2）DNA的降解 在稀碱溶液中较稳定，但在较高浓度的碱溶液中 高温处理会降解产生单核苷酸，且嘌呤和嘧啶碱基常有破坏。在低 温的酸性条件下也比较稳定，但在高温时降解生成嘌呤碱基和嘧啶 核苷酸。 DNA在Dnase、磷酸二酯酶等的作用下。降解成3 ‘或5 ’-脱氧 核糖核苷酸。
原核生物
真核生物
70S
80S
30S 50S 40S 60S
RNA的分子结构
mRNA
核酸分离纯化的技术原理
核酸分离纯化的技术原理核酸提取是核酸检测实验的第一步，也是最关键的一步。
核酸提取的纯度、产量和质量是影响下游实验的关键。
核酸提取主要有两个步骤，分别是裂解和纯化，其中，裂解的目的是通过各种方法裂解细胞，将核酸释放到溶液中，纯化的目的则是将核酸分子从裂解液中特异性地分离出，从而避免裂解液中原有的蛋白分子、脂类、糖类、多肽、其他有机或无机分子对后续核酸检测实验的干扰。
在核酸提取过程中还应遵循以下原则：保证核酸分子一级结构的完整性；去除其他污染分子。
一、液相核酸分离纯化技术（一）胍硫氰酸酚-氯仿提取法盐类通常是核酸样本中最常见的杂质成分，因此，在将核酸样本进行下游处理和分析前，通常需要去除盐类成分。
因此，通常需一或多个分离和（或）纯化步骤来使样本脱盐。
核酸纯化的常规步骤包括细胞裂解，该步骤通过破坏细胞结构而形成细胞裂解液，同时灭活包括DNA酶和RNA酶在内的细胞内源性核酶，并最终从细胞碎片中获得纯净的核酸样本。
有机溶剂-苯酚-氯仿提取法正是基于上述原理最常见的核酸经典提取方法之一。
苯酚-氯仿-异丙醇按照一定比例混合后（即：25∶24∶1）可抵制RNA酶活性，从而克服单用苯酚无法抑制RNA酶活性的不足。
蛋白、脂质、碳水化合物和细胞碎片可通过提取苯酚和氯仿有机试剂混合物的水相而去除。
含有DNA样本的水相可通过加入2∶1或1∶1比例的乙醇或异丙醇沉淀，最后，沉淀下来的DNA用70%乙醇洗涤并最后溶解于TE缓冲液或无菌去离子水中。
异硫氰酸胍（guanidinium isothiocyanate）用于RNA提取的方法最早见于1977年，但是，由于该方法比较繁琐，后来逐步被称之为胍硫氰酸酚-氯仿提取法（guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction）代替，该方法可一步完成RNA提取。
其基本原理是：硫氰酸胍是蛋白质强变性剂，能裂解组织细胞，释放RNA，抑制RNA酶的活性，同时与RNA形成可溶性复合物，经过酚-氯仿抽提，使RNA 与组织中的DNA和蛋白质分离开，达到分离提取总RNA的目的。
医学-核酸的分离与纯化
息从父母传递给后代，并控制蛋白质的合成。
核酸的分类
DNA
DNA是脱氧核糖核酸的缩写，是细胞内主要的遗传物质，负 责携带遗传信息。根据功能和结构的不同，DNA可分为染色 体DNA和线粒体DNA。
RNA
RNA是核糖核酸的缩写，主要参与蛋白质的合成。根据功能 和结构的不同，RNA可分为信使RNA、转运RNA和核糖体 RNA等。
戊糖
戊糖是核酸中的碳水化合物部分，包括D-核糖和脱氧核糖。D-核糖是构成RNA的碳水化 合物，而脱氧核糖是构成DNA的碳水化合物。
含氮碱基
含氮碱基是构成核苷酸的有机碱，包括腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺 嘧啶（T）等，这些碱基在核酸分子中具有特定的配对规则。
核酸的结构与功能
01
DNA双螺旋结构
吸附法纯化
硅胶吸附法
利用硅胶的吸附性质，将DNA混合液通过硅胶柱，去除 杂质，得到纯化的DNA。
磁珠吸附法
利用磁珠的吸附性质，将DNA混合液加入磁珠中，去除 杂质，得到纯化的DNA。
凝胶过滤法
利用凝胶的分子筛效应，将DNA混合液通过凝胶柱，去 除杂质，得到纯化的DNA。
膜分离纯化
超滤法
利用膜的分子筛效应，将DNA混合液通过超滤膜，去除杂质，得 到纯化的DNA。
疫苗开发
在疫苗开发中，核酸可以作为抗原提供给免疫系统，刺激机 体产生免疫反应。通过核酸分离与纯化技术，可以获得高纯 度、安全性和有效性均符合标准的疫苗抗原，为疫苗研发提 供关键技术支持。
05
展望未来
核酸分离与纯化的挑战与机遇
挑战
随着医学技术的不断发展，对核酸的分离与纯化提出了更高的要求，尤其是在保 证高纯度、高效率、低成本等方面。同时，对于特殊样本的处理和复杂样本的解 析也带来了新的挑战。
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破碎细胞 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。 动物：液氮处理后用匀浆器破碎。 细胞器DNA，首先纯化细胞器。
以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
DNA酶抑制剂：
1.
金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可
抑制DNA酶活性。如：EDTA
➢ 细胞内的核酸具有复杂的结构，均与蛋白质结合成核蛋白。 ➢ 分子的总长度在不同生物间差异很大，一般随生物的进化程度而增长。 ➢ DNA与RNA性质上的差异决定了两者的最适分离与纯化的条件是不同的。
DNA ：主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA （cpDNA），质粒DNA。
RNA：主要存在于细胞质中，如mRNA，rRNA，tRNA，miRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。
一、 材料与方法的选择
➢ 核酸存在于各种生物中。临床常见的样品有血液、尿液、唾液、头发、组织及培养细胞等。 ➢ 核酸分离与纯化的方法非常多。如何选择合适的分离与纯化方法是一个首要的问题。因为不同的
水饱和苯酚：由于蛋白与DNA连结键已断裂，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋 白分子溶于酚相，DNA溶于水相。苯酚使蛋白质变性，并抑制了DNase的降解作用。
氯仿：氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，还能去除植物色素和蔗糖。
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外， 异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相、下层有机溶剂相维持稳定。
• 0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。 • 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细
胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。 • β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。 注意：Trizol是强腐蚀性物质，小心存放于4℃
OD值范围应该在0.1~0.99之间，否则不符合上述线性关系。
(2) 荧光光度法
• 核酸的荧光染料溴化乙锭(ethidium bromide，EB)嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线 激发下发出橙红色的荧光，且荧光强度积分与核酸含量呈正比。该法灵敏度可达1-5ng，适合低浓 度核酸溶液的定量分析。
核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述
1
提取核酸的目的:
核酸分离与纯化的设计与原则
1.实验研究
2.用于研制核酸类药物及保健品 ?
名称 核糖核酸（RNA） 脱氧核糖核酸（DNA） 免疫核糖核酸（iRNA） 转移因子（TF）
主要核酸类药物及用途
治疗范围
口服用于精神迟缓、记忆衰退、动脉硬化性痴呆治疗；静脉注射用于 刺激造血和促进白细胞生成，治疗慢性肝炎、肝硬化初期癌症
在DNA样品中加入少量氯仿，可以有效避免细菌与核酸的污染。
2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱRNA的保存
RNA可溶于0.3mol／L的醋酸钠溶液或双蒸水中，在-70 ºC至-80 ºC保存。若以DEPC水溶解RNA 或者在RNA溶液中加入RNA酶阻抑蛋白(RNasin) ，可通过抑制RNA酶对RNA的降解而延长保存时间。
需要注意的是，RNA酶抑制剂或有机溶剂的加入只是一种暂时保存的需要，如果它们对后继的实 验与应用有影响，则应予以去除。
无水乙醇沉淀DNA：与核酸不发生任何化学反应；对盐类沉淀少，沉淀中所含微量乙醇易挥发除去。
2. RNA分离纯化----Trizol一步法
• TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。TRIzol的主要成分是苯酚。 苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质， 但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制 内源和外源RNase（RNA酶）。
2.
阴离子表面活性剂：如SDS。该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白
结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
RNA酶抑制剂：
1.
皂土：带负电荷，能吸附RNase，使其失活。
2.
DEPC(焦碳酸二乙酯 )：通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶
所有的组织中均存在RNA酶，人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需 戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡 是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理，再用蒸馏水冲净。
DEPC：焦碳酸二乙酯，是一种强烈但并不彻底的RNA酶抑制剂，通过和RNA酶中His结合使蛋白质变 性，抑制RNA酶活性。
利用乙醇的易挥发性洗掉异丙醇,氯仿； 溶解一些沉淀中可能的有机物杂质
会极大降低RNA的可溶性
(三) 核酸的浓缩
随着核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物 过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度 会遂渐下降，当不能满足后继研究与应用的需要时， 应对核酸进行浓缩。沉淀是核酸浓缩最常用的方法。 优点：核酸沉淀后,可以很容易地改变溶解缓冲液和调 整核酸溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能去除部 分杂质与某些盐离子，有一定的纯化作用。
• 另外，SYBR Gold作为一种新的超灵敏荧光染料，可以从琼脂糖凝胶中检出低于20pg的双链DNA。
2．纯度鉴定
(1)紫外分光光度法：紫外分光光度法主 要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白 质的污染。在TE缓冲液中，纯DNA的A260 ／A280比值为1.8 ，纯RNA的A260／A280比 值为2.0。比值升高与降低均表示不纯。
名称 聚肌胞苷酸（聚肌胞）
腺苷三磷酸（ATP） 核酸-氨基酸混合物 辅酶A（CoA） 脱氧核苷酸钠 腺苷一磷酸（AMP） 鸟苷三磷酸（GTP） 辅酶Ⅰ（NDA） 辅酶Ⅱ（NADP）
主要核酸类药物及用途
治疗范围 干扰素诱导物，具有广普抗病毒作用；用化学合成、酶促合成方法生 产 用于心力衰竭、心肌炎、心肌梗死、脑动脉和冠状动脉硬化、急性脊 髓灰质炎、肌肉萎缩、慢性肝炎等 用于气管炎、神经衰弱等 用于动脉硬化，白细胞、血小板减少，肝、肾病 用于放疗、化疗引起的急性白细胞减少症 有周围血管扩张作用、减压作用；用于静脉曲张性溃疡等 用于慢性肝炎、进行性肌肉萎缩等症 用于白细胞减少及冠状动脉硬化 促进体内物质的生物氧化
研究目的对核酸的完整性、产量、纯度和浓度有不同的要求。 ➢ 近年来，试剂盒(Kit)的开发与自动化仪器的使用大大提高了分离与纯化的效率。
选择原则
根据具体生物材料的性质与起始量、待分离核酸的性质与用途而采取不同的方案。 无论采取何种方法，都应遵循总的原则： 保证核酸一级结构的完整性， 尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。
有抗放射作用，能改善机体虚弱疲劳；与细胞毒药物合用，能提高细 胞毒药物对癌细胞的选择性作用；与红霉素合用，能降低其毒性，提 高抗癌疗效 推动正常RNA分子在基因水平上通过对癌细胞DNA分子进行诱导，或 通过反转录酶系统促使癌细胞发生逆分化，如：可用于肝炎治疗的抗 乙肝iRNA，治疗肺癌的抗肺癌iRNA 相对分子质量较小，含有多核苷酸、多肽化合物，Mr<10000；它只 传递细胞免疫信息，无体液免疫作用，不致促进肿瘤生长，治疗恶性 肿瘤比较安全；亦可用于治疗肝炎等
1．DNA的保存
(二) 核酸的保存
DNA溶于TE缓冲液中在-70 ºC可以储存数年。当TE的pH值为8.0 时，可以减少DNA的脱氨反 应，pH低于7.0 时DNA容易变性。
EDTA作为二价金属离子的整合剂，通过螯合Mg2+、Ca2+等二价金属离子可以抑制DNA酶的 活性。
低温条件有利于减少DNA分子的各种反应，双链DNA因结构上的特点而具有很大的惰性，在 4 ºC条件下可保存较长时间。
冰浴冷却 离心去细胞碎片 上
清液
用水饱和苯酚抽提2~3次 上层液相用氯仿抽至界面无蛋白变性物 上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀 沉
淀物用70%冷乙醇洗涤,干燥 溶于缓冲液 加入RNase处理除去RNA
苯酚氯仿抽提 沉淀干燥
EDTA：破坏细胞膜，螯合Mg2+、Ca2+，使DNase失活； SDS：可破坏细胞膜、抑制核酸酶，还可使核酸从蛋白质上游离下来； 蛋白酶K：非特异性蛋白酶，可将蛋白质消化成氨基酸； 65℃：高温下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 冰浴：降低温度使蛋白质及多糖杂质沉淀；
(2)荧光光度法：用溴化乙锭等荧光染料示踪 的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于 DNA分子比RNA大许多，电泳迁移率低。通过分 析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果， 可以鉴定DNA制品中有无RNA的干扰，亦可鉴定 在RNA制品中有无DNA的污染。
3．完整性鉴定
凝胶电泳法：以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶 电泳结果可用于判定核酸的完整性。基因组DNA的分 子量很大，在电场中泳动很慢，如果有降解的小分子 DNA片段，电泳图呈拖尾状。完整总RNA除特征性 的三条带外，一般28sRNA的荧光强度约为18sRNA的 2倍，否则提示有RNA降解。若在加样槽附近有条 带，说明有DNA污染。
的活性。
(二) 核酸的分离与纯化
利用核酸与其它物质在一个或多个性质 上的差异设计有效方案，才能使核酸得以分 离。核酸与其它物质的差异包括细胞定位与 组织分布上的差异、物理化学性质上的不同 以及各自独特的生物学特性。
1. DNA分离纯化过程
破碎细胞 + DNA抽提液(EDTA、去污剂、蛋白酶K) 65℃温育20’