核酸分离与纯化

③ 去除对后续实验有影响的物质，如有机 溶剂和过高浓度的金属离子。
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2. 核酸制备的基本步骤
I.材料准备
破碎细胞
II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，纯化并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
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2.1 破碎细胞
(1)玻璃匀浆器匀浆
优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除 去，不影响以后实验。
缺点： 需要量大，一般要求低温操作。
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异丙醇
优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA 样品沉淀。一般不需低温长时间放置。
缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥
发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
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1.2 核酸分离与纯化的要求
(1) 为保证核酸的完整性，
化学因素？ 生物因素？ 物理因素？
（防止降解），在实验中应注意：
① 尽量简化步骤，缩短提取时间，减少各种 有害因素对核酸的破坏。
② 减少化学因素对核酸的降解，pH4-10。
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③ 防止核酸的生物降解（细胞内或外的 各种核酸酶水解）。
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主要内容
1. 核酸分离与纯化的原则及要求 2. 核酸制备的基本步骤 3. 核酸的鉴定和保存 4. 核酸提取方法简介
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1. 核酸分离与纯化的原则及要求
1.1 核酸分离与纯化的一般原则
(1) 保持核酸分子一级结构的完整性，是核酸结 构和功能研究的最基本要求。
(2) 排除其他分子的污染，保证核酸的纯度。
(2)液氮研磨法
富含DNA酶的胰、脾、胸腺、淋巴； 富含胶原蛋白的皮肤、肌腱； 坚硬的组织如骨骼。
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(3)高速组织捣碎机捣碎 (4)超声波处理法
(5)化学处理法(SDS、吐温80等）
(6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等）
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2.2 核酸分离，去除蛋白
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核 酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。
精胺
精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。
原理是： 精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩
Na+ Mg2+ Li+
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① 核酸沉淀的盐类及浓度
盐 贮存液浓来自百度文库（mol/L) 终浓度(mol/L)
MgCl2
1
0.01
NaAc
3 (pH5.2)
0.3
KAc
3 (pH5.2)
0.3
NH4Ac
10
2.5
NaCl
5
0.2
LiCl
8
0.8
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② 常用的有机沉淀剂
乙醇
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使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈
现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物， 例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提 实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。
(2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操
作时应戴手套。
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找答案？
➢ 核酸分离纯化的原则是什么？为防止 核酸降解需要注意什么？
➢ 核酸制备基本步骤？ ➢ 如何鉴定核酸浓度和纯度？ ➢ 核酸的保存方法有哪些？
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前言
核酸（nucleic acid）是以核苷酸为基本组成单位 的生物信息大分子。是遗传信息的携带者，是基 因表达的物质基础。
2.3 沉淀核酸
重新调整核酸的浓度，起到浓缩核酸的作用； 去除溶液中某些盐离子与杂质； 改变核酸的溶解缓冲液。
DNA纯化柱
核酸提取（离心柱型） 利用硅胶膜特异吸附核酸
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2.3.1 核酸的有机溶液沉淀法
当核酸溶液的pH值 大于4时，核酸分子呈 多聚阴离子状态。
钾、钠、镁、锂及铵 根等阳离子形成的盐， 通过屏蔽带负电的磷酸 基团使DNA分子聚结在 一起而不溶于许多有机 溶剂。
④
所用器械和一些试剂需高压灭菌，提取缓
冲液中需加核酸酶抑制剂。操作温度为0~4℃。
DNA酶需要金属离子Mg2+、Ca2+的激活，因此 使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等； 阴离子表面活性剂SDS。
RNA酶分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、 耐酸碱、不易失活，生物降解是RNA提取过程中 的主要危害因素。0.1%DEPC浸泡，器械180℃ 干烤8h。
分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白 质分开，同时避免核酸降解。
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（1）加入SDS
SDS除有破膜和抑制核酸酶的作用外，还具有 使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
（2） 加入浓盐溶液（如NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使 氢键破坏，核蛋白解聚；
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（3）酚/氯仿抽提
酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑 制作用。
氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中 的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。
在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使 水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异 戊醇=25：24：1）。
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聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L 的MgCl2。
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④ 减少物理因素对核酸的降解，主要 是机械剪切力，其次是高温。
机械剪切力包括强力高速的振荡、突然暴 露于低渗液、样品反复冻融等。
高温，如长时间的煮沸。
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(2) 核酸纯度的要求：
① 非核酸生物大分子的污染降低到最低程 度，如蛋白质、多糖和脂类分子；
② 排除其它核酸分子的污染，如制备RNA 时，DNA分子是污染物；
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核酸的分类：
DNA 核内染色体 DNA。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA，叶绿体 DNA。 质粒DNA。
RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病 毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。
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