核酸分离与纯化
核酸的分离与纯化
核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多 糖、脂肪等生物大分子分开。 在分离核酸时，应遵循两个原则：一是保 证核酸一级结构的完整性；二是尽量排除 其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。
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核酸分离与纯化的过程一般都包括了材料 的选择、核酸的释放、核酸与其它生物大 分子的分离、核酸的纯化与鉴定、核酸的 浓缩、保存等几个主要步骤。 每一步骤又可由多种不同的方法单独或联 合实现。
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5. 质粒DNA的纯化
（1）聚乙二醇沉淀法 质粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子 RNA，并用RNase消化小分子RNA；然 后在高盐条件下，用PEG选择性地沉淀大 的质粒DNA；沉淀的质粒DNA进一步用 酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。
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（2）柱层析法 柱层析法纯化质粒DNA的关键是其填充的树脂。 树脂可分为两类：一类是利用疏水的相互作用来 纯化质粒DNA样品；一类则通过离子交换与吸附 的相互作用进行纯化。 以硅基质作为填充材料的柱层析，其作用原理是 在多盐条件下，依靠DNA与硅基质的可逆性结合 来进行纯化。通过暴露的磷酸盐残基，DNA吸附 到硅基质上，以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖 类等生物大分子，然后加入TE或水溶液使DNA 分子重新水合，并通过离心洗脱出来。
在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以
减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保
持分相的稳定性。
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为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生 自由基，如果直接用于DNA分离，会使磷酸二 酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过 高温重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl饱和酚， 并调节至中性。使用饱和酚可以减少酚吸收更 多的DNA，降低DNA的损失率。
核酸提取经典方法
核酸提取经典方法
核酸提取是分离和纯化生物样本中的核酸分子的过程。
经典的核酸提取方法通常包括以下步骤：
1. 细胞破碎和裂解：将细胞或组织样本破碎和溶解，以释放核酸。
常用的方法包括机械破碎、化学裂解和酶裂解等。
2. 蛋白质去除：将裂解后的样品进行蛋白酶处理，以去除蛋白质等杂质。
可使用蛋白酶K处理、苯酚/氯仿法或硅胶膜法等。
3. 酒精沉淀：通过加入适量的醇类，如乙醇或异丙醇，使核酸沉淀下来。
通常会加入盐类，如氯化钠或乙酸钠，以调节溶液的离子浓度。
4. 洗涤：将核酸沉淀物进行洗涤，以去除沉淀物中的杂质。
常用的洗涤方法包括乙醇洗涤法、酚/氯仿洗涤法或硅胶膜洗涤法。
5. 溶解：将洗涤后的核酸沉淀溶解于适当的缓冲液中，以得到高纯度的核酸。
常用的溶解缓冲液包括Tris-HCl缓冲液或无酶水。
上述方法是常见的经典核酸提取方法，但随着科学技术的发展，现代的核酸提取方法也在不断改进和更新，以提高提取效率和纯度。
如今，还有各种基于磁珠、
膜片、筛膜、电泳和自动化设备等的高通量、高效、自动化的核酸提取方法被广泛应用于科学研究和临床诊断。
核酸分离与纯化的原理及其方法学进展
作者单位:518000深圳市人民医院检验医学部微生物室(唐曙明、何林);524023湛江,广东医学院生化教研室(周克元)・讲座・核酸分离与纯化的原理及其方法学进展唐曙明 何林 周克元 【关键词】 核酸; 分离与纯化; 核酸提取 核酸的分离与纯化技术是生物化学与分子生物学的一项基本技术。
随着分子生物学技术广泛应用于生物学、医学及其相关等领域,核酸的分离与纯化技术也得到进一步发展。
各种新方法、经完善后的传统经典方法以及商品试剂方法的不断出现,极大地推动了分子生物学的发展。
现就核酸分离与纯化的原理及其方法学进展作一综述。
核酸分离与纯化的原则核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。
核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。
在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性;排除其他分子污染。
核酸分离与纯化的步骤大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。
每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。
1.细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。
细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。
(1)机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。
这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。
有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从<500bp ～>20kb之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般<10kb。
(2)化学作用:在一定的p H环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相。
上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X2100、Tween20、N P240、CTAB、sar2 cosyl、Chelex2100等)或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍)而获得。
而p H环境则由加入的强碱(NaO H)或缓冲液(TE、STE等)提供。
核酸的分离与纯化.
使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉 红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如 醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验， 因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 (2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时 应戴手套。
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2.3 核酸的沉淀
沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点：
DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
（3）聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
(1） 金属离子螯合剂：
DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因 此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。 如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉； (2） 阴离于型表面活性剂：
如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还 能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷 的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电 吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非 极性的范德华力。
分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合 的蛋白质分开，同时避免核酸降解。
2.2.1 加入浓盐溶液（如NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力， 使氢键破坏，核蛋白解聚；
2.2.2 加入SDS
SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还 具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
核酸分离与纯化的技术路线与原则
核酸分离与纯化的技术路线与原则核酸包括DNA 、RNA两类分子，在细胞内均与蛋白质结合成核蛋白。
真核生物基因组中，95%DNA 为双链线性分子，存在于细胞核中，5%为双链环状分子，存在于细胞器中；原核生物DNA 及质粒DNA 为双链或单链环状分子；RNA 为单链线性分子，主要存在于细胞质中。
DNA 与RNA 性质的不同导致对其分离与纯化的条件也不相同。
一、核酸分离与纯化的原则(1)保证核酸一级结构的完整性。
生物的遗传信息全部贮存在核酸一级结构中，而且核酸的一级结构还决定其高级结构的形式及和其他大分子结合的方式。
所以，所提取的核酸一级结构的完整性直接影响着后续实验中对其结构与功能研究的质量。
因此，在制备核酸的过程中，要做到：尽量简化操作程序，缩短提取过程；避免过酸、过碱等化学因素对核酸链中磷酸二酯键的破坏，在pH 值4～10条件下进行操作；操作时动作要轻缓，提取的样品小包装保存，以免诸多的物理因素对核酸的降解；避免细胞内及环境中核酶对核酸的生物性降解。
(2)排除其他生物大分子的污染，如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应尽可能降低到最低程度，特别是提取DNA 分子时应除去RNA 分子，反之亦然。
(3)排除核酸样品中有机溶剂和过高浓度的金属离子。
二、分离与纯化的技术路线(一)核酸的释放通常情况下DNA 及RNA 均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是制备单个细胞，再破碎细胞，从而释放核酸。
破碎细胞的方法包括机械法与非机械法两大类。
机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法；非机械法可分为干燥法与溶胞法。
由于溶胞法采用适宜的化学试剂与酶，能有效地裂解细胞，方法温和，能保证较高的核酸获得率，并能较好地保持核酸的完整性，从而得到广泛的应用。
(二)核酸的分离与纯化利用核酸与其他物质性质上的差异，可以分离与纯化核酸。
这种差异包括细胞定位与组织分布上的差异，物理、化学性质上的不同，以及各自独特的生物学特性。
操作过程中，既可以从复杂样品中抽提出核酸分子，也可以将样品中的非核酸成分(非核酸的生物大分子、非需要的核酸分子及在操作过程中加入的溶液与试剂)逐步清除。
第六章核酸的分离与纯化
三、鉴定、保存与应用
（一）核酸的鉴定
1．浓度鉴定核酸浓度的定量鉴定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。
（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，最大吸收波长在250nm～270nm之间。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收波长不变。由核苷酸组成核酸后，其最大吸收波长为260nm，该物理特性为测定溶液中核酸的浓度奠定了基础。在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度大约相当于50µg/ml的双链DNA，38µg/ml的单链DNA或单链RNA，33µg/ml的单链寡聚核苷酸。如果要精确定量已知序列的单链寡核苷酸分子的浓度，就必须结合其实际分子量与摩尔吸光系数，根据朗伯-比尔定律进行计算。若DNA样品中含有盐，则会使A260的读数偏高，尚需测定A310以扣除背景，并以A260与A310的差值作为定量计算的依据。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25µg/ml的核酸溶液。
2．纯度鉴定紫外分光光度法还是荧光光度法，均可用于核酸的纯度鉴定。
核酸的分离与纯化讲解
• 二.质粒和噬菌体DNA的提取和纯化
• （一）质粒DNA的提取 • 基本步骤 • 1.细菌的培养 • 2.细菌的收集与裂解 • 3.质粒DNA的纯化 • 提取方法
• 煮沸法： • 碱法：最常用的质粒DNA提取方法。 • SDS法：
• （二）噬菌体DNA的提取
• 1.细菌培养 • 2.细菌的感染及裂解 • 3.噬菌体的沉淀及纯化 • 4.噬菌体DNA的提取
• 图1 玻璃砂研磨提取总DNA的电泳结果
• 1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法 • 1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶
• 图2 氧化铝研磨提取总DNA的电泳结果
• 1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法 • 1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶
一、概述
• 核酸分离提取的原则 • 常用方法及基本原理 • DNA的分离纯化 • RNA的分离纯化
第一节 核酸分离提取的原则
• 一、基本原则
• 1.保证核酸一级结构的完整性。 • 2.排除其它分子的污染。
• 二、注意事项
• 1.简化操作步骤，减少对核酸的破坏。 • 2.避免过酸（碱）等化学因素的影响（pH4～10）。 • 3.减少物理因素对核酸的降解。 • 4.防止核酸的生物降解。
• ③分离浮力密度不同的DNA分子或其他分子颗粒， 如图1。
图1 氯化铯梯度纯化λ噬菌体
噬菌体在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间形成一肉眼可 见的带。在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间可看到一个 由噬菌体颗粒形成的浅蓝色带。
• ④纯化DNA分子。在中性CsCl溶液中，DNA的 浮力密度为1.7g/ml，RNA为2.0g/ml，蛋白 质的浮力密度为1.3～1.4g/ml。在起始密度 为1.7g/ml的CsCl溶液中进行超速离心，可 以很好地将三者区分开。蛋白质浮在上层液 面，DNA分子在离心管中间形成区带，RNA沉 于管底，从而达到从DNA样品中去除微量RNA 和蛋白质的目的。
核酸分离纯化方法
核酸分离纯化方法
核酸分离纯化方法包括以下几种常用方法：
1. 酚酸法（Phenol-Chloroform Extraction）：通过酚酸混合液溶解蛋白质，然后进行醚抽提，可分离出核酸。
该方法通常用于大量样品的纯化。
2. 高盐法（Salt Precipitation）：通过加入高浓度盐溶液，如氯化钠，使核酸在低温下形成沉淀，然后离心分离。
3. 硅胶柱法（Silica Column）：将核酸样品通过硅胶柱，利用硅胶对核酸的亲合性，使核酸固定在柱中，通过洗脱剂洗脱纯化的核酸。
4. 钠离子交换柱法（Sodium Ion Exchange Column）：利用柱内载体对核酸的亲合性，在一定的钠离子浓度下，核酸与载体结合，通过洗脱缓冲液洗脱纯化的核酸。
5. 凝胶电泳法（Gel Electrophoresis）：利用电场作用，将核酸样品在凝胶上进行分离和纯化。
根据核酸的大小，可选择琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。
核酸的分离和纯化
琼脂糖凝胶电泳操作注意细节
1） 根据片段大小配制不同浓度的胶（改变分辨率），片段越小， 需要胶浓度越大。 2） 胶要现制先用 3） 选择合适的Marker 4） 配胶的缓冲液与电泳缓冲液要是同一种，且浓度一致（1倍） 5） 点样时要加入loading buffer，并注意，不要将样点到点样 孔之外（飘样），也不要将胶戳漏（漏样） 6） 根据片段大小及电泳检测目的，选择合适的电压及电泳时间 7）EB染色。
检测原理：
溴化乙锭（EB）可插入双链DNA分子中， 在紫外光照射下，发射荧光。
EB: 先染与后染
核酸凝胶电泳技术
溴化乙锭染料的化学结构及 其 对 DNA 分 子 的 插 入 作 用 。 由于插入了溴化乙锭分子， 在紫外光照射下，琼脂糖凝 胶 电 泳 中 DNA 的 条 带 便 呈 现 出荧光，易于鉴定。
琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的 能力
凝胶类型及浓度 （bp）
分离DNA的大小范围
0.3%琼脂糖
50 000~1 000
0.7%琼脂糖
20 000~1 000
1.4%琼脂糖
6 000~300
4.0%聚丙烯酰胺
1 000~100
10.0%聚~1
琼脂糖凝胶电泳的原理
rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列， 特别是28S和18S特征性条带是电泳鉴定总 RNA纯度和完整性的重要参数。
3、 琼脂糖凝胶电泳
• 3. 1 原理： • 3. 2 用途：
琼脂糖凝胶电泳的原理
DNA电泳迁移：电荷效应＋分子筛效益
（1）DNA带负电，电场中，向正极移动； （2）决定移动速度三因素：DNA大小，电荷数，构 型（超螺旋 > 线性 > 开环）； （3） 线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成 反比（分子量越大，跑得越慢）；
核酸分离纯化的技术原理
核酸分离纯化的技术原理核酸提取是核酸检测实验的第一步，也是最关键的一步。
核酸提取的纯度、产量和质量是影响下游实验的关键。
核酸提取主要有两个步骤，分别是裂解和纯化，其中，裂解的目的是通过各种方法裂解细胞，将核酸释放到溶液中，纯化的目的则是将核酸分子从裂解液中特异性地分离出，从而避免裂解液中原有的蛋白分子、脂类、糖类、多肽、其他有机或无机分子对后续核酸检测实验的干扰。
在核酸提取过程中还应遵循以下原则：保证核酸分子一级结构的完整性；去除其他污染分子。
一、液相核酸分离纯化技术（一）胍硫氰酸酚-氯仿提取法盐类通常是核酸样本中最常见的杂质成分，因此，在将核酸样本进行下游处理和分析前，通常需要去除盐类成分。
因此，通常需一或多个分离和（或）纯化步骤来使样本脱盐。
核酸纯化的常规步骤包括细胞裂解，该步骤通过破坏细胞结构而形成细胞裂解液，同时灭活包括DNA酶和RNA酶在内的细胞内源性核酶，并最终从细胞碎片中获得纯净的核酸样本。
有机溶剂-苯酚-氯仿提取法正是基于上述原理最常见的核酸经典提取方法之一。
苯酚-氯仿-异丙醇按照一定比例混合后（即：25∶24∶1）可抵制RNA酶活性，从而克服单用苯酚无法抑制RNA酶活性的不足。
蛋白、脂质、碳水化合物和细胞碎片可通过提取苯酚和氯仿有机试剂混合物的水相而去除。
含有DNA样本的水相可通过加入2∶1或1∶1比例的乙醇或异丙醇沉淀，最后，沉淀下来的DNA用70%乙醇洗涤并最后溶解于TE缓冲液或无菌去离子水中。
异硫氰酸胍（guanidinium isothiocyanate）用于RNA提取的方法最早见于1977年，但是，由于该方法比较繁琐，后来逐步被称之为胍硫氰酸酚-氯仿提取法（guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction）代替，该方法可一步完成RNA提取。
其基本原理是：硫氰酸胍是蛋白质强变性剂，能裂解组织细胞，释放RNA，抑制RNA酶的活性，同时与RNA形成可溶性复合物，经过酚-氯仿抽提，使RNA 与组织中的DNA和蛋白质分离开，达到分离提取总RNA的目的。
简述核酸分离纯化的主要步骤。
简述核酸分离纯化的主要步骤。
大家好，今天我们来聊聊核酸分离纯化这件事。
说到这个话题，很多人可能会觉得这就像是从泥巴里找金子，难得不得了，但其实只要掌握了步骤，简直就像是在玩一场化学版的捉迷藏。
核酸分离纯化是为了从各种样本中提取出我们的DNA或RNA，并且把它们从其他杂质中清理出来。
要做到这一点，我们得一步步来，每一步都不容马虎。
接下来，就让我带大家一起走进这个过程，看看如何让这些细小的分子从一堆混乱中脱颖而出。
2. 主要步骤详解2.1 样本准备首先，咱们得从头开始，准备好样本。
想象一下，我们要从一杯混合果汁中找出果肉，首先就得把这杯果汁倒进一个干净的容器里。
具体来说，我们通常会从细胞中提取核酸，所以需要将细胞破碎以释放出核酸。
这个过程就像是在打开一罐罐头，一切都要小心翼翼。
为了让细胞破裂，我们会用到一些化学试剂或者物理方法，比如用研磨机或者超声波处理。
就像是把一个充满秘密的小盒子打开，里面的核酸就这样被释放了出来。
2.2 核酸提取一旦细胞被破坏，释放出的核酸就是我们接下来要处理的对象。
这时候我们需要把这些核酸从其他杂质中分离出来。
这个步骤就像是在海滩上捡贝壳，我们需要把那些不起眼的沙子和海藻去掉，剩下的才是我们真正想要的。
核酸提取的方法有很多，比如利用试剂盒或者化学溶液。
常见的有酚氯仿提取法和柱纯化法。
酚氯仿法就像是用一招老派的武功，把核酸和蛋白质分开，而柱纯化法则像是用现代化的设备，让核酸在特定的柱子上游刃有余地被吸附下来。
2.3 核酸纯化好啦，提取出核酸之后，接下来就是纯化了。
纯化这一步，就像是用细网筛选掉杂质，只留下最珍贵的部分。
我们通常会使用一些化学试剂来清洗掉剩余的杂质，比如盐、酒精等。
这个过程有点像给你的衣服做干洗，把那些不干净的部分都清理干净。
纯化的目的是为了确保你得到的核酸足够干净，以便后续的实验能顺利进行。
3. 检测与保存3.1 检测最后一步，我们得检测一下核酸的质量，看看它是不是达到了要求。
核酸提取的原则
核酸提取的原则核酸提取是生物学实验中常用的一项技术，它是从生物样本中分离纯化核酸的过程。
核酸提取的原则主要包括细胞破碎、蛋白质去除、核酸纯化等步骤。
在进行核酸提取前，需要确保生物样本的质量良好。
样本可以是细胞、组织或体液等，其中细胞和组织需要经过机械方法或化学方法进行破碎，以释放细胞内的核酸。
而体液样本则需要离心等方法去除杂质，以得到纯净的核酸。
核酸提取的过程中需要去除蛋白质等杂质。
蛋白质是核酸提取中的主要干扰物质之一，如果不去除，会对后续实验产生干扰。
一般可以通过蛋白酶的作用或有机溶剂的加入，使蛋白质发生沉淀或溶解，从而去除蛋白质。
在蛋白质去除后，就需要对核酸进行纯化。
核酸纯化的方法有很多种，常用的包括酚/氯仿提取法、硅胶柱层析法、离心管柱纯化法等。
其中，酚/氯仿提取法是一种常用的经典方法，通过酚酸和氯仿的相分离原理，将核酸从其他杂质中分离出来。
硅胶柱层析法则是利用硅胶对核酸的亲和性，通过样品在硅胶柱上的吸附、洗脱等步骤，实现对核酸的纯化。
离心管柱纯化法则是通过离心管柱中的膜过滤器，将核酸分离和纯化。
在核酸提取的过程中，还需要注意一些细节。
首先，实验操作要严格无菌，以避免外源性DNA或RNA的污染。
其次，在纯化过程中，要避免核酸的降解。
核酸容易受到核酸酶的降解，因此需要在提取过程中加入核酸酶抑制剂，保护核酸的完整性。
此外，还需要对提取的核酸进行定量和质量检测，以确保提取得到的核酸质量优良，适合后续实验的需求。
总结一下，核酸提取的原则主要包括细胞破碎、蛋白质去除和核酸纯化等步骤。
在实验中需要注意无菌操作、核酸降解的保护和核酸质量的检测。
通过遵循这些原则，可以获得高质量的核酸样品，为后续的实验提供可靠的基础。
核酸提取与纯化
核酸提取与纯化引言核酸提取与纯化是生物学研究中常用的操作步骤之一。
核酸提取是指从生物样本中分离出DNA或RNA分子，纯化则是指将提取得到的核酸分子除去杂质，获得纯净的核酸样品。
本文将介绍核酸提取与纯化的基本原理、常用方法以及注意事项。
核酸提取原理核酸提取的基本原理是利用生物样本中DNA和RNA分子与其他组分（如蛋白质、细胞壁等）之间的化学或物理性质的差异，将核酸分子从样本中分离出来。
常见的提取方法有有机溶剂法、盐析法和离心法等。
有机溶剂法有机溶剂法是一种常用的核酸提取方法。
其原理是利用有机溶剂（如酚-氯仿混合液）与生物样本中的其他组分之间的亲和性差异，将核酸分子从样本中提取出来。
这种方法操作简单，适用于提取DNA和RNA。
具体操作步骤如下：1.准备生物样本，如细胞培养物或组织样本。
2.加入细胞裂解缓冲液，破坏细胞膜、核膜等结构，释放核酸分子。
3.加入酚-氯仿混合液，与细胞裂解液混合，形成两相体系。
4.离心分离两相，核酸分子会在有机相中分配到有机相中，而其他杂质会在水相中。
5.取出有机相，加入异丙醇或乙醇等沉淀剂，沉淀核酸分子。
6.离心沉淀，弃去上清液。
7.用乙醇洗涤沉淀，去除残留的盐和有机溶剂。
8.干燥沉淀，加入适量的去离子水溶解核酸。
盐析法盐析法是利用核酸分子与盐溶液中的离子交互作用的原理进行分离。
该方法适用于高含量的核酸样本（如DNA或RNA）。
其操作步骤如下：1.准备生物样本，如细胞裂解液。
2.加入适量的盐溶液，使盐浓度达到一定程度。
3.离心分离沉淀，核酸分子会与高浓度盐溶液结合形成沉淀，而其他杂质会在上清液中。
4.取出沉淀，用盐溶液洗涤核酸，去除杂质。
5.干燥沉淀，加入适量的去离子水溶解核酸。
离心法离心法是一种快速分离核酸的方法。
其原理是利用离心力将核酸分子从样本中沉淀下来。
离心法适用于小样本量和快速提取的情况。
具体步骤如下：1.准备生物样本，如细胞裂解液。
2.加入高盐缓冲液，增加核酸与其他组分之间的亲和性差异。
核酸与蛋白质的分离与纯化
沉淀是浓缩核酸最常用且高效的方法。 沉淀的特点 1.易将核酸溶液调至所需浓度 2.改变溶解核酸的缓冲液种类 3.去除部分杂质与某些盐离子 可选择有机溶剂沉淀核酸 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后可用有机溶剂（如乙醇、 异丙醇等）沉淀核酸，少量共沉淀的盐，可使用70~75%的乙醇洗涤。
质粒DNA (双链环状)
核酸分离与纯化的基本原则
1 保持核酸结构的完整性
控制缓冲液酸碱度：pH 4~10 注意机械剪切力 提取温度：0~4度 注意核酸酶
2 尽量排除其他分子的污染
蛋白质、多糖和脂质这类生物大分子杂质 对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子 其他核酸分子
1 核酸分离与纯化的基本原则及技术路线
核酸分离与纯化的技术路线
5 核酸的保存
（1）DNA的保存
TE缓冲液中-70℃保存数年 TE缓冲液的 pH与DNA 贮存有关，pH为8.0时，可减少
DNA脱氨反应，pH低于7.0时DNA容易变性。 在DNA溶液中加少量氯仿可有效防止细菌和核酸的污染
（2）RNA的保存
可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液，-70℃保存 可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，-20 ℃保存。 以焦碳酸二乙酯水溶解可抑制RNA酶对RNA的降解。
核酸分离与纯化的技术路线
3 核酸的浓缩、沉淀与洗涤
（1）核酸的浓缩
核酸浓缩常选用有机溶剂沉淀法 ①固体聚乙二醇（PEG）浓缩 将DNA溶液装入透析袋，包埋于PEG使DNA脱水。 ②丁醇抽提浓缩 正丁醇或仲丁醇具有吸水能力，但DNA不溶于丁醇，振荡 混合后离心，去除有机相，可显著减少DNA体积。
核酸分离与纯化的技术路线
只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液
核酸的分离和纯化
RNA制备前的准备
玻璃器皿 在使用前应180℃烤至少4小时 塑料器皿 用0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）或用氯仿洗涤 电泳槽 用去污剂洗涤，水冲洗，乙醇干燥，再浸泡于
3%H2O2 液中10分钟，然后0.1%DEPC处理水彻 底冲洗。 配制的溶液应用0.1% DEPC在37℃处理12小时以上，再高 压灭菌去除 DEPC。 不能高压灭菌的溶液用
EDTA/0.1 SDS的试管收集洗脱的RNA溶液。
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6）按步骤2重新平衡柱子，重复步骤2-4的poly(A)选 择吸附和洗脱过程。
7）调整收集的RNA溶液的乙酸钠浓度至 0.3mol/L, 加2.5倍体积乙醇，移至2个硅化的SW-55离心管 中，-20℃放置过夜 。
8）4℃离心, 30, 000g 30分钟沉淀RNA（极稀浓 度 ）。弃去乙醇，晾干沉淀，重溶于150微升无 RNA酶的TE缓冲液，合并样品。取5微升在70℃ 加热5分钟后，在1%琼脂糖凝胶电泳中检查RNA 的质量。
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方法 一、异硫氰酸胍法制备总RNA
二、TRIzol试剂提取细胞总RNA
步骤：
1） 组织标本需在预冷的碾钵中捣碎，收获1x106-5x106细
胞, 移入1.5 ml管中。
2） 加TRIzol试剂1 ml，混匀，冰浴5 mins。
3） 加氯仿0.2毫升，混匀，冰浴10 mins。
4） 4℃,10, 000g离心5 mins。
288 kb
痘病毒
196 kb
质体 几~100以上kb
线粒体
藻类 线状
15kb
酵母 环状
19~78 kb
植物 环状 100~150 kb
动物(扁虫到人)环状 15~18 kb
锥虫 网状
第五章 核酸的分离纯化
六、 DNA片段的回收
（一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 （二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段
六、 DNA片段的回收
（一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法 2.电泳洗脱法 3.冷冻挤压法 4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法
电泳到DEAE-纤维素膜 ： DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有 负电荷的DNA分子。 在所需条带前插入DEAT-纤维素膜，继续电泳 至条带DNA都到膜上，取出洗下。 500bp-5kb的DNA片段回收率较好，纯度高。但 不适用于分子量超过10kb和单链DNA。
哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线
第二节 真核基因组DNA的分离纯化
一、酚抽提法 二、甲酰胺解聚法 三、玻棒缠绕法 四、其它方法 五、DNA片段的纯化 六、DNA片段的回收
一、酚抽提法
DNA酚抽提法示意图
一、酚抽提法
• 该法于1976年由Stafford及其同事创立，现在使 用的是改进的方法
二、技术路线的设计
（一）核酸的释放 （二）核酸的分离与纯化 （三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤
二、技术路线的设计
（一）核酸的释放
DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因 此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释 放核酸。
表５-１ 各种组织细胞破碎方法
Ⅰ机械法 Ⅱ物理法 Ⅲ化学法
细胞破碎方法
1匀浆法 2捣碎法 3研磨法 1超声法 2反复冻融法 3冷热交替法 4低渗裂解 1有机溶剂 2去垢剂 3酶解法
第五章 核酸的分离纯化
第一节 核酸分离纯化的设计及原则 第二节 基因组DNA的分离纯化 第三节 质粒DNA的提取与纯化 第四节 RNA的分离纯化
第一节 核酸分离纯化的设计及原则
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核酸的分离和纯化
6
1.2 核酸分离与纯化的要求
(1) 为保证核酸的完整性，
化学因素？ 生物因素？ 物理因素？
（防止降解），在实验中应注意：
① 尽量简化步骤，缩短提取时间，减少各种 有害因素对核酸的破坏。
② 减少化学因素对核酸的降解，pH4-10。
核酸的分离和纯化
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③ 防止核酸的生物降解（细胞内或外的 各种核酸酶水解）。
优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除 去，不影响以后实验。
缺点： 需要量大，一般要求低温操作。
核酸的分离和纯化
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异丙醇
优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA 样品沉淀。一般不需低温长时间放置。
缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥
发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
核酸的分离和纯化
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使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈
现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物， 例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提 实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。
(2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操
作时应戴手套。
核酸的分离和纯化
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③ 去除对后续实验有影响的物质，如有机 溶剂和过高浓度的金属离子。
核酸的分离和纯化
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2. 核酸制备的基本步骤
I.材料准备
破碎细胞
II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，纯化并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
核酸的分离和纯化
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2.1 破碎细胞
(1)玻璃匀浆器匀浆
2.3 沉淀核酸
重新调整核酸的浓度，起到浓缩核酸的作用； 去除溶液中某些盐离子与杂质； 改变核酸的溶解缓冲液。
DNA纯化柱
核酸提取（离心柱型） 利用硅胶膜特异吸附核酸
核酸的分离和纯化
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2.3.1 核酸的有机溶液沉淀法
当核酸溶液的pH值 大于4时，核酸分子呈 多聚阴离子状态。
钾、钠、镁、锂及铵 根等阳离子形成的盐， 通过屏蔽带负电的磷酸 基团使DNA分子聚结在 一起而不溶于许多有机 溶剂。
Na+ Mg2+ Li+
核酸的分离和纯化
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① 核酸沉淀的盐类及浓度
盐 贮存液浓度（mol/L) 终浓度(mol/L)
MgCl2
1
0.01
NaAc
3 (pH5.2)
0.3
KAc
3 (pH5.2)
0.3
NH4Ac
10
2.5
NaCl
5
0.2
LiCl
8
0.8
核酸的分离和纯化
20
② 常用的有机沉淀剂
乙醇
核酸的分离和纯化
22
聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L 的MgCl2。
核酸的分离Leabharlann 纯化23核酸的分离和纯化
3
核酸的分类：
DNA 核内染色体 DNA。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA，叶绿体 DNA。 质粒DNA。
RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病 毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。
核酸的分离和纯化
核酸的分离和纯化
核酸的分离和纯化
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找答案？
➢ 核酸分离纯化的原则是什么？为防止 核酸降解需要注意什么？
➢ 核酸制备基本步骤？ ➢ 如何鉴定核酸浓度和纯度？ ➢ 核酸的保存方法有哪些？
核酸的分离和纯化
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前言
核酸（nucleic acid）是以核苷酸为基本组成单位 的生物信息大分子。是遗传信息的携带者，是基 因表达的物质基础。
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主要内容
1. 核酸分离与纯化的原则及要求 2. 核酸制备的基本步骤 3. 核酸的鉴定和保存 4. 核酸提取方法简介
核酸的分离和纯化
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1. 核酸分离与纯化的原则及要求
1.1 核酸分离与纯化的一般原则
(1) 保持核酸分子一级结构的完整性，是核酸结 构和功能研究的最基本要求。
(2) 排除其他分子的污染，保证核酸的纯度。
分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白 质分开，同时避免核酸降解。
核酸的分离和纯化
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（1）加入SDS
SDS除有破膜和抑制核酸酶的作用外，还具有 使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
（2） 加入浓盐溶液（如NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使 氢键破坏，核蛋白解聚；
核酸的分离和纯化
(2)液氮研磨法
富含DNA酶的胰、脾、胸腺、淋巴； 富含胶原蛋白的皮肤、肌腱； 坚硬的组织如骨骼。
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(3)高速组织捣碎机捣碎 (4)超声波处理法
(5)化学处理法(SDS、吐温80等）
(6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等）
核酸的分离和纯化
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2.2 核酸分离，去除蛋白
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核 酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。
精胺
精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。
原理是： 精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩
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（3）酚/氯仿抽提
酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑 制作用。
氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中 的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。
在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使 水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异 戊醇=25：24：1）。
④
所用器械和一些试剂需高压灭菌，提取缓
冲液中需加核酸酶抑制剂。操作温度为0~4℃。
DNA酶需要金属离子Mg2+、Ca2+的激活，因此 使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等； 阴离子表面活性剂SDS。
RNA酶分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、 耐酸碱、不易失活，生物降解是RNA提取过程中 的主要危害因素。0.1%DEPC浸泡，器械180℃ 干烤8h。
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④ 减少物理因素对核酸的降解，主要 是机械剪切力，其次是高温。
机械剪切力包括强力高速的振荡、突然暴 露于低渗液、样品反复冻融等。
高温，如长时间的煮沸。
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(2) 核酸纯度的要求：
① 非核酸生物大分子的污染降低到最低程 度，如蛋白质、多糖和脂类分子；
② 排除其它核酸分子的污染，如制备RNA 时，DNA分子是污染物；