《核酸分离纯化》PPT课件
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《核酸的分离纯化》课件
《核酸的分离纯化》课件课程目标：1. 理解核酸分离纯化的意义和重要性。
2. 掌握核酸分离纯化的基本原理和步骤。
3. 学习核酸分离纯化的实验操作技巧。
4. 了解核酸分离纯化在科学研究和临床诊断中的应用。
第一部分：核酸分离纯化的意义和重要性1. 核酸的定义和功能核酸是生物体内携带遗传信息的分子，包括DNA和RNA。
核酸在遗传信息的传递、基因表达调控和疾病发生中起着重要作用。
2. 核酸分离纯化的意义核酸分离纯化是研究核酸结构和功能的基础。
核酸分离纯化有助于研究基因表达调控、基因突变和基因功能。
核酸分离纯化在临床诊断和疾病治疗中具有重要意义，如病原体检测、基因突变筛查和个体化治疗。
第二部分：核酸分离纯化的基本原理和步骤1. 核酸分离纯化的基本原理根据核酸的物理化学性质，如大小、电荷、亲和性和稳定性等，进行分离纯化。
常用的分离纯化方法包括离心、电泳、亲和色谱和质谱等。
2. 核酸分离纯化的基本步骤样品处理：收集含有核酸的样品，如细胞裂解、核提取等。
核酸释放：通过机械或化学方法将核酸从样品中释放出来。
核酸沉淀：通过盐析、酒精沉淀等方法将核酸从溶液中沉淀下来。
核酸洗涤：去除沉淀中的杂质，如蛋白、RNA等。
核酸纯化：通过柱层析、亲和色谱等方法进一步纯化核酸。
核酸鉴定：通过紫外线吸收、琼脂糖凝胶电泳等方法检测核酸的质量和数量。
第三部分：核酸分离纯化的实验操作技巧1. 样品处理技巧细胞裂解：使用酶或化学方法裂解细胞，释放核酸。
核提取：使用盐水或缓冲液提取核酸。
2. 核酸沉淀技巧盐析：加入高盐浓度使核酸沉淀。
酒精沉淀：加入酒精使核酸沉淀。
3. 核酸洗涤技巧离心：使用离心机去除沉淀中的杂质。
洗涤缓冲液：选择适当的洗涤缓冲液去除杂质。
4. 核酸纯化技巧柱层析：使用固定相和流动相进行核酸纯化。
亲和色谱：利用核酸与特定配体之间的亲和力进行纯化。
5. 核酸鉴定技巧紫外线吸收：测量核酸在紫外线波段的吸光度。
琼脂糖凝胶电泳：将核酸样品在琼脂糖凝胶上进行电泳，观察核酸的迁移率和条带形状。
医学课件-核酸的分离与纯化
技术发展推动
课程背景
化学组成
核酸是由核苷酸构成的，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两种。
结构特征
DNA的双螺旋结构以及RNA的单链结构是核酸的典型结构特征。
核酸简介
获得高纯度核酸
提高核酸检测灵敏度
研究和开发需求
分离与纯化的目的
02
核酸的分离
将生物样品处理成匀浆或细胞裂解液，以便释放其中的核酸。
要点一
要点二
自动化和智能化
未来的核酸分离和纯化技术将更加注重自动化和智能化，能够实现自动化操作、减少人为误差和增加批量化生产的能力。
应用领域的拓展
随着生命科学和医学的不断发展和进步，核酸分离和纯化技术的应用领域也将不断拓展，将会有更多的应用场景和用途被发现和应用。
要点三
谢谢您的观看
THANKS
xx年xx月xx日
医学课件-核酸的分离与纯化
CATALOGUE
目录
引言核酸的分离核酸的纯化核酸的鉴定实验方案设计总结与展望
01
引言
核酸是生物体内的重要遗传物质，对于研究基因组、基因表达、基因功能等生物学核心问题具有重要意义。
生物学研究需求
随着生物学和生物技术学的不断发展，不断有新的核酸分离与纯化方法和技术出现，推动了医学和生物医学领域的发展。
步骤
将细胞裂解后，加入酚氯仿混合液，充分混匀，离心，取上清液，再加入氯仿充分混匀，离心，取上清液，最后加入异戊醇沉淀核酸。
实验方案设计一：酚氯仿抽提法
原理
乙醇沉淀法是一种利用乙醇沉淀核酸的方法。
步骤
将细胞裂解后，加入乙醇，充分混匀，离心，弃去上清液，再加入乙醇洗涤沉淀，离心，弃去上清液，最后干燥沉淀得到核酸。
课程背景
化学组成
核酸是由核苷酸构成的，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两种。
结构特征
DNA的双螺旋结构以及RNA的单链结构是核酸的典型结构特征。
核酸简介
获得高纯度核酸
提高核酸检测灵敏度
研究和开发需求
分离与纯化的目的
02
核酸的分离
将生物样品处理成匀浆或细胞裂解液，以便释放其中的核酸。
要点一
要点二
自动化和智能化
未来的核酸分离和纯化技术将更加注重自动化和智能化，能够实现自动化操作、减少人为误差和增加批量化生产的能力。
应用领域的拓展
随着生命科学和医学的不断发展和进步，核酸分离和纯化技术的应用领域也将不断拓展，将会有更多的应用场景和用途被发现和应用。
要点三
谢谢您的观看
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xx年xx月xx日
医学课件-核酸的分离与纯化
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目录
引言核酸的分离核酸的纯化核酸的鉴定实验方案设计总结与展望
01
引言
核酸是生物体内的重要遗传物质，对于研究基因组、基因表达、基因功能等生物学核心问题具有重要意义。
生物学研究需求
随着生物学和生物技术学的不断发展，不断有新的核酸分离与纯化方法和技术出现，推动了医学和生物医学领域的发展。
步骤
将细胞裂解后，加入酚氯仿混合液，充分混匀，离心，取上清液，再加入氯仿充分混匀，离心，取上清液，最后加入异戊醇沉淀核酸。
实验方案设计一：酚氯仿抽提法
原理
乙醇沉淀法是一种利用乙醇沉淀核酸的方法。
步骤
将细胞裂解后，加入乙醇，充分混匀，离心，弃去上清液，再加入乙醇洗涤沉淀，离心，弃去上清液，最后干燥沉淀得到核酸。
6核酸的分离与纯化剖析PPT课件
2020年9月28日
5
• 3.氯仿能加速有机相与水相分离，去除植物 色素和蔗糖。用氯仿抽提以去除迹量酚。
• 4.用水饱和的乙醚抽提最后一次，彻底去除 迹量酚和氯仿。然后68℃水浴10分钟蒸发迹 量乙醚。
• 5.异戊醇可减少蛋白质变性操作过程中产生 气泡。
• 酚/氯仿抽提法标准程序是：
• 酚抽提一次，酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一 次。
2020年9月28日
10
• 1.CsCl沉降平衡超速离心
• CsCl沉降平衡超速离心是纯化DNA分子的主要方 法：
• ①可分离CC(双链闭合环状)、OC（开环双链）、 L（线性）三种结构的DNA分子。质粒DNA的这三 种结构分子与EB结合能力不同（L>OC>CC），EB 插入DNA分子中可使其浮力密度下降，结合EB越 多、浮力密度越小。。
• 2. 酚的水饱和：饱和酚的pH值接近8.0，可减少离心 后水酚双向的交界面上的DNA滞留；由于在酸性pH值条 件下，DNA分配于有机相，因此使用前必须对酚进行平 衡使其pH值在7.8以上。
制好的饱和酚贮于棕色瓶中4℃可保存1个月。因酚 的氧化随pH值的增高而增加，如所用平衡缓冲液的 pH值＞8及RNA的提取都应使用新鲜饱和的酚。
• 2.蔗糖密度梯度超速离心
• 可用于分离不同大小的DNA片段
2020年9月28日
13
• 五.核酸的沉淀浓缩法
• 原理：核酸与Na、K、Mg等形成的盐在许多种有 机溶剂中不溶解，但也不会被有机溶剂变性。
• （一）核酸沉淀的盐类及浓度
• 1.NaAc：最常用，终浓度为0.3M（pH5.0）
• 2.NaCl：终浓度为0.2M，除去SDS。
2020年9月28日
15052 医学分子生物学4核酸分离纯化课件共59页
细菌的裂解可采用多种方法进行，如SDS裂解法、有机溶 剂法、碱裂解法、煮沸裂解法、溶菌酶法和超声处理等。
细菌裂解方法的选择
取决于３个因素 质粒的大小 菌株种类 裂解后纯化质粒DNA的技术
大于15kb的质粒易受损，应采用温和裂解法，如 SDS裂解法，将细菌悬浮于10％蔗糖溶液中可减轻裂 解时对DNA造成的机械剪切力。
碱裂解法:
利用质粒DNA和染色体DNA的变性与复性的差异达到分离 目的
强碱破坏碱基配对，使线状染色体DNA解链，但闭环
质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条
件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配对，重新形成
完全天然的超螺旋分子。
碱裂解法:
在NaOH（pH12.0－12.6）下，用EDTA 和SDS破坏细胞壁 和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒 DNA。
基因组DNA片段的纯化
DNA粗制品实际上是分子量大小不等 的DNA片段的混合物，难免还混有少 量的RNA、蛋白质和一些小分子杂质。
某些实验，如限制性内切求较高，这就要求对粗制品进一步纯 化。
基因组DNA片段的纯化
质粒载体（plБайду номын сангаасsmid vector）
细菌中提纯质粒DNA的方法
3个步骤：
细菌培养物的生长(质粒扩增） 细菌的收获（离心）和裂解 质粒DNA的纯化
细菌培养
细菌培养至对数生长期（OD600） 时提取质粒DNA。 减少细菌量，降低后续操作中裂解物 的复杂性和粘稠度。
细菌裂解
可采用离心的方法来收集细菌，由于细菌生长中产生了大 量的代谢产物，为提高质粒DNA的纯度，细菌沉淀最好 用STE或生理盐水漂洗1～2次。
纯化方法有透析、层析、电泳及选 择性沉淀等。
细菌裂解方法的选择
取决于３个因素 质粒的大小 菌株种类 裂解后纯化质粒DNA的技术
大于15kb的质粒易受损，应采用温和裂解法，如 SDS裂解法，将细菌悬浮于10％蔗糖溶液中可减轻裂 解时对DNA造成的机械剪切力。
碱裂解法:
利用质粒DNA和染色体DNA的变性与复性的差异达到分离 目的
强碱破坏碱基配对，使线状染色体DNA解链，但闭环
质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条
件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配对，重新形成
完全天然的超螺旋分子。
碱裂解法:
在NaOH（pH12.0－12.6）下，用EDTA 和SDS破坏细胞壁 和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒 DNA。
基因组DNA片段的纯化
DNA粗制品实际上是分子量大小不等 的DNA片段的混合物，难免还混有少 量的RNA、蛋白质和一些小分子杂质。
某些实验，如限制性内切求较高，这就要求对粗制品进一步纯 化。
基因组DNA片段的纯化
质粒载体（plБайду номын сангаасsmid vector）
细菌中提纯质粒DNA的方法
3个步骤：
细菌培养物的生长(质粒扩增） 细菌的收获（离心）和裂解 质粒DNA的纯化
细菌培养
细菌培养至对数生长期（OD600） 时提取质粒DNA。 减少细菌量，降低后续操作中裂解物 的复杂性和粘稠度。
细菌裂解
可采用离心的方法来收集细菌，由于细菌生长中产生了大 量的代谢产物，为提高质粒DNA的纯度，细菌沉淀最好 用STE或生理盐水漂洗1～2次。
纯化方法有透析、层析、电泳及选 择性沉淀等。
核酸的分离纯化优秀课件
前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
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核酸的分离纯化优秀课件
一、核酸分离、纯化原则
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
1 意义
遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸 的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其 他生物大分子结合的方式。
核酸的分离纯化优秀课件
General process of gene engineering
1. 从生物有机体基因组中， 分离出带有目的基因的DNA片 段。
2. 将带有目的基因的外源DNA片段连 接到能够自我复制的并具有选择记号 的载体分子上，形成重组DNA分子。
3. 将重组DNA分子转移到适当的受体 细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增 殖。 4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出 获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛 核酸的分离纯选化出优秀已课件经得到扩增的目的基因。
1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA 侵染细菌实验
核酸的分离纯化优秀课件
2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交 替问题；
Rosalind Franklin拍出 了第一张 能反映DNA美丽双螺旋结构的X
射线照片
X-ray source
（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-
Ribonucleoside Complex, VRC)
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核酸的分离纯化优秀课件
《核酸的分离与纯化》课件
凝胶层析
柱体上填充的凝胶为物质提供 分子筛作用，不同大小的分子 在凝胶中被阻碍的程度不同。
结论与要点
1 核酸是由核苷酸组成的生物高分子。 2 常见的核酸类型有DNA和RNA。
3 分离技术包括盐析、凝胶电泳、超
速离心和柱层析等。
5 超速离心技术包括差速离心和密度
梯度离心。
4 凝胶电泳可分为琼脂糖凝胶、聚丙
差速离心
通过旋转离心管，根据密度差异使分子分层。
密度梯度离心
将不同密度的离子或分子加入离心管，创建密 度梯度，然后离心管使分子按照密度梯度分 层。
柱层析
吸附层析
利用柱体上填充的化学吸附剂 与物质的亲和性差异使其分离。
离子交换层析
利用电荷性质进行分离，负载 离子的功能团能够与物质中带 正电荷的离子相互作用。
《核酸的分离与纯化》 PPT课件
此课件旨在介绍核酸的分离与纯化方法，从而为纯核酸的获得提供帮助。
核酸是什么
1 分子组成
核酸是由核苷酸组成的生物高分子。每个核苷酸由糖、碱基和磷酸基团三部分组成。
2 功能与作用
核酸参与了生命活动的多个方面，包括传递遗传信息、调控基因表达等。
3 常见类型
常见的核酸有DNA、RNA等多种类型，它们在分子组成和生物功能上存在差异。
核酸的分离方法
1
盐析
通过调节溶液的离子强度，使核酸与溶
凝胶电泳
2
液中的其他物质分离。
利用电场作用使核酸在凝胶中移动，根
据大小和电荷差异分离不同的核酸。
3
超速离心
通过调节离心力和离心时间，使不同重
柱层析
4
量的分子沉淀到不同位置。
利用柱体中填充的吸附剂、离子交换剂、 凝胶等材料，按照不同的物性实现分离。
核酸的分离与纯化讲解PPT教学课件
• ②可分离双链DNA分子的两条互补链。
• ③分离浮力密度不同的DNA分子或其他分子颗粒， 如图1。
2020/10/16
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图1 氯化铯梯度纯化λ噬菌体
噬菌体在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间形成一肉眼可
见的带。在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间可看到一个
由噬菌体颗粒形成的浅蓝色带。
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蛋白杂质
水相（核酸溶液） 有机相
•高速离心后的分层情况（酚/氯仿抽提法）
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7
• 注意事项：
• 1. 一般酚是透明无色的结晶。酚结晶如呈现粉红色或 黄色，表明其中含有酚的氧化产物如醌、二酸等。变 色的酚溶液不能用于实验，因其中的酚氧化物可破坏 核酸的磷酸二酯键，并引起DNA链的交联。
• 二、注意事项
• 1.简化操作步骤，减少对核酸的破坏。 • 2.避免过酸（碱）等化学因素的影响（pH4～10）。 • 3.减少物理因素对核酸的降解。 • 4.防止核酸的生物降解。
2020/10/16
3
• 三. 主要步骤：
• 1.破碎细胞。 • 2.去除与核酸结合的蛋白质，多糖以及脂类等
生物大分子。
• 3.NH4Ac: 去除dNTP，铵盐抑制磷酸化等反应。 • 4.LiCl：高浓度（0.8M）可直接沉淀大分子量RNA。抑
制反转录酶反应和翻译（蛋白合成）实验。
• 5.KAc：与NaAc相似，钾盐形式难溶于含SDS的溶液。
• 6.MgCl2：对于浓度低于0.1μg/ml或长度小于100个核
苷酸的样品，可提高核酸沉淀的回收率。
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第二节 分离制备核酸的常用方法及基本原理
• ③分离浮力密度不同的DNA分子或其他分子颗粒， 如图1。
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图1 氯化铯梯度纯化λ噬菌体
噬菌体在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间形成一肉眼可
见的带。在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间可看到一个
由噬菌体颗粒形成的浅蓝色带。
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蛋白杂质
水相（核酸溶液） 有机相
•高速离心后的分层情况（酚/氯仿抽提法）
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• 注意事项：
• 1. 一般酚是透明无色的结晶。酚结晶如呈现粉红色或 黄色，表明其中含有酚的氧化产物如醌、二酸等。变 色的酚溶液不能用于实验，因其中的酚氧化物可破坏 核酸的磷酸二酯键，并引起DNA链的交联。
• 二、注意事项
• 1.简化操作步骤，减少对核酸的破坏。 • 2.避免过酸（碱）等化学因素的影响（pH4～10）。 • 3.减少物理因素对核酸的降解。 • 4.防止核酸的生物降解。
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• 三. 主要步骤：
• 1.破碎细胞。 • 2.去除与核酸结合的蛋白质，多糖以及脂类等
生物大分子。
• 3.NH4Ac: 去除dNTP，铵盐抑制磷酸化等反应。 • 4.LiCl：高浓度（0.8M）可直接沉淀大分子量RNA。抑
制反转录酶反应和翻译（蛋白合成）实验。
• 5.KAc：与NaAc相似，钾盐形式难溶于含SDS的溶液。
• 6.MgCl2：对于浓度低于0.1μg/ml或长度小于100个核
苷酸的样品，可提高核酸沉淀的回收率。
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第二节 分离制备核酸的常用方法及基本原理
《核酸分离纯化》PPT课件
1.1.2 分离核酸原则：
1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
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4
1.2 防止核酸的生物降解
细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链 中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。
所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓 冲液中需加核酸酶抑制剂。
第二节 核酸的分离纯化
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1
主要内容
前言
1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性
1.2. 防止核酸的生物降解
2 分离提取核酸的主要步骤
2.1 细胞的破碎
2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除
2.3 核酸的沉淀
2.4 核酸的浓度测定
2.5 核酸的保存
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2
前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
Home 精选课件ppt
27
Home
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21
2.4 核酸的浓度测定
2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、 琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml 。 结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度 相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
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6
1.2.2 RNA酶（RNAase)抑制剂
RNAase分布广泛，极易污染样品，而且 耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ） 作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase， 使其失活。
1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
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4
1.2 防止核酸的生物降解
细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链 中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。
所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓 冲液中需加核酸酶抑制剂。
第二节 核酸的分离纯化
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1
主要内容
前言
1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性
1.2. 防止核酸的生物降解
2 分离提取核酸的主要步骤
2.1 细胞的破碎
2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除
2.3 核酸的沉淀
2.4 核酸的浓度测定
2.5 核酸的保存
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2
前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
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21
2.4 核酸的浓度测定
2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、 琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml 。 结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度 相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
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6
1.2.2 RNA酶（RNAase)抑制剂
RNAase分布广泛，极易污染样品，而且 耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ） 作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase， 使其失活。
《核酸分离纯化》课件
《核酸分离纯化》课件一、课件概述核酸分离纯化是分子生物学和生物技术领域中的一项基本技术，其目的是从复杂的生物样品中提取和纯化出高质量的核酸，以便进行后续的分析和应用。
本课件将介绍核酸分离纯化的基本原理、方法和步骤，帮助学生掌握这一技术。
二、课件内容1. 核酸分离纯化的意义核酸是生物体内重要的遗传物质，其分离纯化对于研究基因表达、基因调控、基因突变等方面具有重要意义。
核酸分离纯化是进行基因克隆、基因测序、PCR等实验的基础步骤。
2. 核酸分离纯化的基本原理核酸的物理化学性质：核酸具有一定的溶解度、吸附性、变性温度等。
核酸与蛋白质、RNA、DNA等分子的差异：通过特定条件下对不同分子的相互作用进行分离。
利用核酸的特异性：通过特定酶的作用，实现对核酸的分离纯化。
3. 核酸分离纯化的方法盐析法：利用核酸在高盐浓度下的溶解度降低，将核酸与其他物质分离。
有机溶剂沉淀法：利用有机溶剂（如酚、氯仿等）与水相不相溶的性质，将核酸与其他物质分离。
吸附法：利用特定吸附剂（如硅胶、纤维素等）对核酸的选择性吸附，将核酸与其他物质分离。
透析法：利用透析袋的选择性透过性，将核酸与其他大分子物质分离。
酶法：利用特定酶（如DNA酶、RNA酶等）对核酸的降解作用，实现对核酸的分离纯化。
4. 核酸分离纯化的步骤样品处理：取适量生物样品，加入适量裂解液，进行充分搅拌，使细胞破碎并释放核酸。
核酸提取：将样品转移至离心管中，进行高速离心，将核酸沉淀与其他物质分离。
核酸纯化：根据核酸的物理化学性质，选择适当的分离方法（如盐析、有机溶剂沉淀等），将核酸与其他物质分离。
核酸洗涤：用适量的洗涤液对核酸沉淀进行洗涤，去除残留的杂质。
核酸重悬：加入适量的溶解液，将核酸沉淀重悬，以便进行后续分析或应用。
5. 实验操作注意事项实验操作应在生物安全柜中进行，避免交叉污染。
实验过程中应使用无RNA酶、无DNA酶的试剂和工具。
实验操作过程中应注意个人防护，避免接触核酸样品。
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2.2.2 加入SDS
SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具 有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
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12
2. 2.3 酚/氯仿抽提
酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果， 并对核酸酶有抑制作用。
氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少 残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素 和蔗糖的作用。
1.1.2 分离核酸原则：
1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
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1.2 防止核酸的生物降解
细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链 中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。
所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓 冲液中需加核酸酶抑制剂。
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1.2.2 RNA酶（RNAase)抑制剂
RNAase分布广泛，极易污染样品，而且 耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ） 作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase， 使其失活。
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(2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5)
第二节 核酸的分离纯化
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1
主要内容
Hale Waihona Puke 前言1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性
1.2. 防止核酸的生物降解
2 分离提取核酸的主要步骤
2.1 细胞的破碎
2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除
2.3 核酸的沉淀
2.4 核酸的浓度测定
2.5 核酸的保存
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2
前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为 防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一 定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。
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使用酚时应注意
(1）使用注意
酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉 红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如 醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验， 因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L 的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。
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（4）精胺
精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。
原理是： 精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝
缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质 杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。
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2.3.3 核酸沉淀的温度和时间
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。 低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀， 影响以后的实验。一般使用0℃冰水，1015min， DNA样品足可达到实验要求。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
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3
1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.1.1 意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，
核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及 和其他生物大分子结合的方式。
（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-
Ribonucleoside Complex, VRC)
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2.1 细胞的破碎
(1) 高速组织捣碎机捣碎
(2) 玻璃匀浆器匀浆 (3) 超声波处理法 (4) 液氮研磨法 (5) 化学处理法(SDS、LDS，吐温80等） (6) 生化法（溶菌酶、纤维素酶等）
挥发除去，不影响以后实验。 缺点：
需要量大，一般要求低温操作。
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（2）异丙醇
优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的
DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
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（3）聚乙二醇（PEG）
粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。
作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。
使用注意：
1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。 但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。
2）容易降解，保存在4 ℃或液氮中； 3）提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h。
4）剧毒。
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8
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5
1.2.1 DNA酶抑制剂
(1） 金属离子螯合剂： DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因
此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。 如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉； (2） 阴离于型表面活性剂：
如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能 使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的 复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
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2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电 吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非 极性的范德华力。
分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合 的蛋白质分开，同时避免核酸降解。
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11
2.2.1 加入浓盐溶液（如NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力， 使氢键破坏，核蛋白解聚；
(2）安全操作
酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时 应戴手套。
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14
2.3 核酸的沉淀
沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点：
①改变核酸的溶解缓冲液； ②重新调整核酸的浓度； ③去除溶液中某些盐离子与杂质。
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15
2.3.1 核酸沉淀的盐类及浓度
当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子 状态，它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中 不溶解，也不会被有机溶课剂变性。
盐
MgCl2 NaAc KAc NH4Ac NaCl LiCl
贮存液浓度（mol/L)
1 3 (pH5.2) 3 (pH5.2)
10 5 8
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终浓度(mol/L)
0.01 0.3 0.3 2.5 0.2 0.8
16
2.3.2 有机沉淀剂
（1）乙醇
优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易
SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具 有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
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2. 2.3 酚/氯仿抽提
酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果， 并对核酸酶有抑制作用。
氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少 残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素 和蔗糖的作用。
1.1.2 分离核酸原则：
1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
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4
1.2 防止核酸的生物降解
细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链 中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。
所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓 冲液中需加核酸酶抑制剂。
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6
1.2.2 RNA酶（RNAase)抑制剂
RNAase分布广泛，极易污染样品，而且 耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ） 作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase， 使其失活。
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7
(2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5)
第二节 核酸的分离纯化
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1
主要内容
Hale Waihona Puke 前言1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性
1.2. 防止核酸的生物降解
2 分离提取核酸的主要步骤
2.1 细胞的破碎
2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除
2.3 核酸的沉淀
2.4 核酸的浓度测定
2.5 核酸的保存
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前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为 防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一 定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。
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使用酚时应注意
(1）使用注意
酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉 红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如 醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验， 因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L 的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。
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（4）精胺
精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。
原理是： 精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝
缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质 杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。
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2.3.3 核酸沉淀的温度和时间
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。 低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀， 影响以后的实验。一般使用0℃冰水，1015min， DNA样品足可达到实验要求。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
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1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.1.1 意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，
核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及 和其他生物大分子结合的方式。
（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-
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2.1 细胞的破碎
(1) 高速组织捣碎机捣碎
(2) 玻璃匀浆器匀浆 (3) 超声波处理法 (4) 液氮研磨法 (5) 化学处理法(SDS、LDS，吐温80等） (6) 生化法（溶菌酶、纤维素酶等）
挥发除去，不影响以后实验。 缺点：
需要量大，一般要求低温操作。
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（2）异丙醇
优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的
DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
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（3）聚乙二醇（PEG）
粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。
作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。
使用注意：
1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。 但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。
2）容易降解，保存在4 ℃或液氮中； 3）提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h。
4）剧毒。
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1.2.1 DNA酶抑制剂
(1） 金属离子螯合剂： DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因
此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。 如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉； (2） 阴离于型表面活性剂：
如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能 使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的 复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
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2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电 吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非 极性的范德华力。
分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合 的蛋白质分开，同时避免核酸降解。
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2.2.1 加入浓盐溶液（如NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力， 使氢键破坏，核蛋白解聚；
(2）安全操作
酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时 应戴手套。
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2.3 核酸的沉淀
沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点：
①改变核酸的溶解缓冲液； ②重新调整核酸的浓度； ③去除溶液中某些盐离子与杂质。
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2.3.1 核酸沉淀的盐类及浓度
当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子 状态，它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中 不溶解，也不会被有机溶课剂变性。
盐
MgCl2 NaAc KAc NH4Ac NaCl LiCl
贮存液浓度（mol/L)
1 3 (pH5.2) 3 (pH5.2)
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终浓度(mol/L)
0.01 0.3 0.3 2.5 0.2 0.8
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2.3.2 有机沉淀剂
（1）乙醇
优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易