核酸提取原理及常见问题

CTAB法流程图
植物材料
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
SDS法
SDS法原理
➢ SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
➢ 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀；
细胞裂解后释放的植物次生代谢产物和多 酚类化合物易于氧化 ,氧化的多酚结合到 DNA 分子上而致 D N A 降解；
多糖的性质与核酸类似，会与核酸一同沉 淀下来，影响植物核酸纯度。
改良方法 1
CTAB提取缓冲液的改进配方
组份
Tris-HCl （pH8.0）
EDTA （pH8.0）
NaCl
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
SDS法DNA提取缓冲液
组份
Tris-HCl
EDTA
（pH8.0） （pH 8.0 ）
终浓度 10 mM
20 mM
NaCl 0.4M
SDS 2%
SDS 法操作简单 , 温和 , 也可提取到较高分 子量 DNA ,但所得产物含糖类杂质较多
CTAB
PVP β-巯基乙醇
终浓度 100 mM
20 mM
1.4M
3%(W/V) 2-5%(W/V)
1-5%（V/V）使 用前加入
❖ PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合
物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合， 有效去除多糖。
❖ 同时向抽提液中加入还原剂β-巯基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二
应的杂质，是目前较为理想的选择。
RNA提取常见问题
RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低 总量偏低
RNA降解
➢ 样品取样以及保存是否得当 ➢ 裂解液的质量 ➢ 外源RNase的污染 ➢ 裂解液的用量不足 ➢ 组织裂解不充分 ➢ 另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等)，很
➢ 溶解于高盐溶液中的 CTA B —核酸复合物 , 加入乙醇可使核酸沉淀 , 而 CT A B 则溶于乙醇.
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
CTAB提取缓冲液的经典配方
组份 终浓度
Tris-HCl （pH8.0）
用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的 阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的 负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力， 而易于聚集沉淀。
DNA提取常见问题
问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
原 因
1. DNA中含有蛋白、多 糖、多酚类杂质
2. DNA在溶解前，有酒 对 精残留，酒精抑制 策 后续酶解反应
4. 外源核酸酶污染
5. 反复冻融
1. 尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融
2. 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液
3. 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量
4. 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 5. 所有试剂用无菌水配制，耗材经高
温灭菌 6. 将DNA分装保存于缓冲液中，避免
3. DNA中残留有金属离 子
1. 重新纯化DNA，去除蛋 白、多糖、多酚等杂 质
2. 重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发
3. 增加70％乙醇洗涤的 次数（2-3次）
问题二：DNA降解。
原 因
1. 材料不新鲜或反复冻
融
2. 未很好抑制内源核酸
酶的活性
对 策
3. 提取过程操作过于剧
烈，DNA被机械打断
核酸提取原理及常见问题
内容
第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、
原因分析及其对策 第三部分：RNA提取方法简介 第四部分：RNA提取常见问题、
原因分析及其对策
DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取
➢ CTAB法 ➢ SDS法 ➢ 酚氯仿法 ➢ 试剂盒法
CTAB法（植物DNA提取经典方法）
4. 低温沉淀，延长沉淀时间 5. 加辅助物，促进沉淀 6. 洗涤时，最好用枪头将洗涤
液吸出，勿倾倒
RNA提取
RNA的提取
➢ 异硫氰酸胍/苯酚法（如Trizol法） ➢ CTAB法 ➢ 试剂盒法
异硫氰酸胍/苯酚法
➢ 原理：
• 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变 性，核酸释放；
• 而多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀 下来；萜类化合物和RNase会分别造成RNA 的化学降解和酶解。
针对多糖多酚植物，可以采用CTAB法和 Trizol法结合的方法，针对性的去除多糖多 酚。
对于富含色素、蛋白和多糖的藻类，可采 取试剂盒方法。
组织量较少的样品，在沉淀时刻加入糖原， 增加终浓度等。
➢ 酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用 ➢ 酚的缺点： 能溶解10-15%的水。
最后用氯仿抽提：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层；去除核酸溶 液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）
用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇， 减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力， 从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
肌肉或者动物脏器需要加入裂解液后进行湿磨，以充分研磨。
• 为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量
纯化：
➢ 在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速； ➢ 经典的沉淀方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，
易造成 RNA 降解； ➢ 异丙醇沉淀，用时短，但所获得的RNA杂质较多； ➢ 柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反
CTAB法原理
➢ CTAB，是一种阳离子去污剂，可破碎细胞壁和细胞膜，并与核酸形 成复合物。
➢ 在高盐溶液中 ( 1.4 mol / L NaCl ) 是可溶的 ,当降低溶液盐浓度到一定 程度( <0.7 mol /L NaCl )时 ,从溶液中沉淀 。通过离心 , 可将 CT A B — 核酸复合物同蛋白质 、 中性多糖类物质分开 。
硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除。
改良方法 2
加入核酸分离缓冲液，利用高温加热裂解细胞， 去除部分杂质，离心得到细胞核；
针对多糖组织，得到细胞核之后可加入1XPBS 清洗2-3次，去除多糖；
后续使用CTAB裂解液裂解细胞核。
核酸分离缓冲液：200mM Tris-HCl 50mM EDTA 250mM NaCl 2%PVP
难避免 RNA 的降解。
OD260 /OD280 比值偏低
蛋白质污染：
➢ 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分 层的离心力和时间要足够。
➢ 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底
➢ 苯酚残留：
➢ 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分 层的离心力和时间要足够。
抽提试剂残留：
• 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体 系中的中间相和水相，从而得以分离；
• 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。
Trizol法适用于普通的植物组织、动物组织 以及真菌和细菌等。
• 酚类化合物被氧化后会与RNA不可逆地结合， 导致RNA活性丧失及在用苯酚、氯仿抽提时 RNA的丢失，或形成不溶性复合物；
影响RNA提取的因素
材料：
➢ 新鲜，切忌使用反复冻融的材料 ➢ 如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料
贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－80℃保存 ➢ 液氮长期保存，－80℃短期保存
样品破碎及裂解：
➢ 根据不同材料选择不同的处理方法：
• 培养细胞：通常可直接加裂解液裂解 • 酵母和细菌：直接液氮研磨，之后用Trizol裂解 • 动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。有些样品如
CTAB法的最大优点是能较好地去除糖类杂 质
SDS法流程图
动物组织
抽提
组织匀浆
上层溶液
细胞裂解
酒精沉淀
离心洗涤 干燥溶解
DNA溶液
酚氯仿裂解法
苯酚抽提原理：
➢ 使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液 时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性 基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
反复冻融
问题三：DNA提取量少。
原 因
1. 实验材料不佳或量少 2. 破壁或裂解不充分 对
策
3. 沉淀不完全 4. 洗涤时DNA丢失
1. 尽量选用新鲜（幼嫩）的材 料
2. 动植物要匀浆研磨充分；G＋ 菌、酵母裂解前先用生物酶 或机械方式破壁
3. 高温裂解时，时间适当延长 （对于动物细胞、细菌可增 加PK的用量）
解决方案：加入糖原，帮助RNA沉淀 多提几管，最后合并溶解。
常见的几种RNA条带
正常条带
植物叶片
水生生物和昆虫等 “ 隐裂”现象
真菌和细菌等
动物组织
➢ 确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。
➢ 设备限制：
➢ 测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在 0.10 - 0.50 之间。此范围线性最好。
用源自文库稀释样品：
➢ 测 OD 时，用水作为稀释液将导致比值的降低。
总量偏低
跟组织本身的RNA丰度有关，一般代谢旺盛 的组织RNA得率会比较高。
EDTA （pH8.0）
NaCl
CTAB
β-巯基乙醇
100 mM
20 mM
1.4M
2%(W/V)
0.1%（V/V） 使用前加入
➢ Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ➢ EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ➢ NaCl 提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白）易于溶解。 ➢ CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； ➢ β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除