核酸提取原理及常见问题-课件PPT
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核酸提取和注意事项ppt课件
使酚容易去除。
基因组DNA提取——CTAB法
• CTAB提取缓冲液的改进配方
组份 终浓度
Tris-HCl （pH 8.0）
EDTA （pH 8.0）
NaCl
CTAB
PVP40 β-巯基乙醇
100 mM
20 mM
0.4 M
3% (W/V)
5% (W/V)
2%（V/V） 使用前加入
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种 不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同 时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
一．核酸简介 二．基因组DNA提取 三．质粒DNA提取 四．真核细胞总RNA提取
基因组DNA提取的几种常用方法： CTAB法 SDS法 其他方法
基因组DNA提取——CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
➢ CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide， 十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂， 可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。
总RNA提取——样本准备
植物/动物组织样本：
新鲜取材或组织离体后液氮速冻，存于液氮或-80℃。 为避免反复冻融，需小份分装（50~100 mg/份）。
细胞样本：
新鲜收集待用或加入TRIzol后 -80℃冻存细胞沉淀。
血液样本：
新鲜血液分离出淋巴细胞，待用或加入TRIzol后 -80℃ 冻存细胞沉淀。
真核细胞总RNA提取——实验步骤
293细胞样品为例
收集细胞
上层溶液
裂解变性
异丙醇沉淀
干燥溶解
RNA溶液
抽提
离心洗涤
RNA提取常见问题
RNA降解 DNA残留 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常
基因组DNA提取——CTAB法
• CTAB提取缓冲液的改进配方
组份 终浓度
Tris-HCl （pH 8.0）
EDTA （pH 8.0）
NaCl
CTAB
PVP40 β-巯基乙醇
100 mM
20 mM
0.4 M
3% (W/V)
5% (W/V)
2%（V/V） 使用前加入
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种 不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同 时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
一．核酸简介 二．基因组DNA提取 三．质粒DNA提取 四．真核细胞总RNA提取
基因组DNA提取的几种常用方法： CTAB法 SDS法 其他方法
基因组DNA提取——CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
➢ CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide， 十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂， 可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。
总RNA提取——样本准备
植物/动物组织样本：
新鲜取材或组织离体后液氮速冻，存于液氮或-80℃。 为避免反复冻融，需小份分装（50~100 mg/份）。
细胞样本：
新鲜收集待用或加入TRIzol后 -80℃冻存细胞沉淀。
血液样本：
新鲜血液分离出淋巴细胞，待用或加入TRIzol后 -80℃ 冻存细胞沉淀。
真核细胞总RNA提取——实验步骤
293细胞样品为例
收集细胞
上层溶液
裂解变性
异丙醇沉淀
干燥溶解
RNA溶液
抽提
离心洗涤
RNA提取常见问题
RNA降解 DNA残留 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常
6核酸的分离与纯化剖析PPT课件
2020年9月28日
5
• 3.氯仿能加速有机相与水相分离，去除植物 色素和蔗糖。用氯仿抽提以去除迹量酚。
• 4.用水饱和的乙醚抽提最后一次，彻底去除 迹量酚和氯仿。然后68℃水浴10分钟蒸发迹 量乙醚。
• 5.异戊醇可减少蛋白质变性操作过程中产生 气泡。
• 酚/氯仿抽提法标准程序是：
• 酚抽提一次，酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一 次。
2020年9月28日
10
• 1.CsCl沉降平衡超速离心
• CsCl沉降平衡超速离心是纯化DNA分子的主要方 法：
• ①可分离CC(双链闭合环状)、OC（开环双链）、 L（线性）三种结构的DNA分子。质粒DNA的这三 种结构分子与EB结合能力不同（L>OC>CC），EB 插入DNA分子中可使其浮力密度下降，结合EB越 多、浮力密度越小。。
• 2. 酚的水饱和：饱和酚的pH值接近8.0，可减少离心 后水酚双向的交界面上的DNA滞留；由于在酸性pH值条 件下，DNA分配于有机相，因此使用前必须对酚进行平 衡使其pH值在7.8以上。
制好的饱和酚贮于棕色瓶中4℃可保存1个月。因酚 的氧化随pH值的增高而增加，如所用平衡缓冲液的 pH值＞8及RNA的提取都应使用新鲜饱和的酚。
• 2.蔗糖密度梯度超速离心
• 可用于分离不同大小的DNA片段
2020年9月28日
13
• 五.核酸的沉淀浓缩法
• 原理：核酸与Na、K、Mg等形成的盐在许多种有 机溶剂中不溶解，但也不会被有机溶剂变性。
• （一）核酸沉淀的盐类及浓度
• 1.NaAc：最常用，终浓度为0.3M（pH5.0）
• 2.NaCl：终浓度为0.2M，除去SDS。
2020年9月28日
核酸提取原理及方法课件
利用机器学习和深度学习算法，优化提取参数和流程， 提高提取效率。
新技术与新方法的探索
纳米材料在核酸提取中的应用
利用纳米材料的特性和功能，开发新型核酸提取方法 。
微流控技术在核酸提取中的应用
通过微流控芯片技术，实现核酸的快速、高效提取。
THANKS
感谢观看
核酸完整性的检测
琼脂糖凝胶电泳
通过观察DNA在电场中的迁移行为，判断DNA的完整性。
脉冲场凝胶电泳
利用不同的脉冲电场来分离不同大小和结构的DNA片段，以 评估核酸的完整性和大小分布。
核酸纯度的检测
紫外光谱分析
通过测量核酸在260nm和280nm紫外光下的吸光度，判断核酸中蛋白质、酚 和其他杂质的含量。
基因组测序
通过对基因组进行测序，可以深入了 解基因的结构和功能，为疾病诊断、 药物研发和生物进化研究提供重要信 息。
基因表达分析
通过比较不同组织或条件下的基因表 达谱，可以研究基因在生命活动中的 作用，以及基因与疾病的关系。
分子生物学研究
分子克隆
利用核酸提取技术，可以获得目的基因的克隆，为进一步研究基因的功能和表达调控机制提供基础。
吸附法
原理
利用吸附剂（如硅藻土、氧化铝 等）对DNA的吸附作用，将
DNA从细胞或组织中分离出来。
步骤
细胞裂解→加入吸附剂→搅拌→ 洗涤→解吸附→DNA。
注意事项
操作过程中要控制好吸附剂的用 量和洗涤次数，同时要保证解吸
附时的温度和pH值。
其他提取方法
酶法
利用酶（如蛋白酶、核酸酶等）将细 胞或组织中的DNA或RNA释放出来 ，再进行提取。
高效液相色谱
利用色谱柱将核酸中的杂质与核酸分离，并通过检测器检测纯度。
新技术与新方法的探索
纳米材料在核酸提取中的应用
利用纳米材料的特性和功能，开发新型核酸提取方法 。
微流控技术在核酸提取中的应用
通过微流控芯片技术，实现核酸的快速、高效提取。
THANKS
感谢观看
核酸完整性的检测
琼脂糖凝胶电泳
通过观察DNA在电场中的迁移行为，判断DNA的完整性。
脉冲场凝胶电泳
利用不同的脉冲电场来分离不同大小和结构的DNA片段，以 评估核酸的完整性和大小分布。
核酸纯度的检测
紫外光谱分析
通过测量核酸在260nm和280nm紫外光下的吸光度，判断核酸中蛋白质、酚 和其他杂质的含量。
基因组测序
通过对基因组进行测序，可以深入了 解基因的结构和功能，为疾病诊断、 药物研发和生物进化研究提供重要信 息。
基因表达分析
通过比较不同组织或条件下的基因表 达谱，可以研究基因在生命活动中的 作用，以及基因与疾病的关系。
分子生物学研究
分子克隆
利用核酸提取技术，可以获得目的基因的克隆，为进一步研究基因的功能和表达调控机制提供基础。
吸附法
原理
利用吸附剂（如硅藻土、氧化铝 等）对DNA的吸附作用，将
DNA从细胞或组织中分离出来。
步骤
细胞裂解→加入吸附剂→搅拌→ 洗涤→解吸附→DNA。
注意事项
操作过程中要控制好吸附剂的用 量和洗涤次数，同时要保证解吸
附时的温度和pH值。
其他提取方法
酶法
利用酶（如蛋白酶、核酸酶等）将细 胞或组织中的DNA或RNA释放出来 ，再进行提取。
高效液相色谱
利用色谱柱将核酸中的杂质与核酸分离，并通过检测器检测纯度。
自动核酸提取仪原理PCR(新)PPT课件
sample materials quantitative yield, highest purity sample sizes up to 600 µl bar code reading available
CHENLI
5
chemagic MSM I
CHENLI
6
CHENLI
7
chemagic MSM I
Roche
MagNA Pure LC 1.0，2.0
CHENLI
14
BioRobot M48 Workstation
CHENLI
15
Qiagen M48 原理示意图
CHENLI
16
CHENLI
17
Roche MagNA Pure LC原理示意图
CHENLI
18
CHENLI
19
12 rod head for parallel separating and resuspending in 15 ml or 50 ml Falcon tubes
CHENLI
8
Fig. 1 Schematic illustration of the chemagic Magnetic Separation Module I for semi-automated extraction of viral nucleic acids from up to 12 minipools in one batch. (a) Separation head containing 12 metal rods. (b) Plastic disposables. (c) Tubes containing samples. (d) and (eC) HTEuNbeLIs containing wash buffers. (f) Tubes 9 containing elution buffer.
CHENLI
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chemagic MSM I
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chemagic MSM I
Roche
MagNA Pure LC 1.0，2.0
CHENLI
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BioRobot M48 Workstation
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Qiagen M48 原理示意图
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Roche MagNA Pure LC原理示意图
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12 rod head for parallel separating and resuspending in 15 ml or 50 ml Falcon tubes
CHENLI
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Fig. 1 Schematic illustration of the chemagic Magnetic Separation Module I for semi-automated extraction of viral nucleic acids from up to 12 minipools in one batch. (a) Separation head containing 12 metal rods. (b) Plastic disposables. (c) Tubes containing samples. (d) and (eC) HTEuNbeLIs containing wash buffers. (f) Tubes 9 containing elution buffer.
核酸提取原理及方法课件
选择提取方法
根据提取方法选择合适的试剂和材料，如缓冲液、裂解液、硅胶膜、磁珠等。
确定试剂和材料
根据所选的提取方法和试剂材料，设计具体的操作流程，包括样本处理、裂解、吸附、洗脱等步骤。
设计操作流程
实验过程中需注意生物安全问题，如使用含有病毒或细菌的样本时，应采取相应的防护措施。
生物安全
实验室安全
操作安全
对记录的数据进行处理，如计算核酸浓度和纯度等。
根据实验目的对数据进行进一步分析，如基因组学和表达谱分析等。
将分析结果以图表或表格的形式展示出来，以便更好地呈现数据变化和规律。
THANKS
感谢您的观看。
03
CHAPTER
核酸纯化方法
步骤
将DNA样品与凝胶介质混合，置于电泳槽中，施加电场。DNA分子在电场作用下通过凝胶介质，迁移至不同位置，根据其大小分离。
原理
凝胶电泳利用DNA分子在电场中的迁移率差异进行分离。不同大小的DNA分子通过凝胶介质时受到的阻力不同，迁移率随之改变，从而实现分离。
应用
凝胶电泳纯化适用于小量DNA分子的分离和纯化，如PCR产物、克隆DNA等。
在临床诊断中，核酸提取也是检测病毒、细菌等病原体感染的重要步骤。
02
CHAPTER
核酸提取方法
酚/氯仿提取法是一种常用的核酸提取方法，利用酚和氯仿对DNA和蛋白质的溶解度不同，将DNA从蛋白质和其他杂质中分离出来。
原理
将细胞裂解液加入酚/氯仿混合液，剧烈振荡后离心，水相和有机相即刻分离，水相中包含DNA。
应用
离子交换色谱纯化适用于大量DNA分子的分离和纯化，如基因组DNA、质粒DNA等。
04
CHAPTER
核酸定量方法
根据提取方法选择合适的试剂和材料，如缓冲液、裂解液、硅胶膜、磁珠等。
确定试剂和材料
根据所选的提取方法和试剂材料，设计具体的操作流程，包括样本处理、裂解、吸附、洗脱等步骤。
设计操作流程
实验过程中需注意生物安全问题，如使用含有病毒或细菌的样本时，应采取相应的防护措施。
生物安全
实验室安全
操作安全
对记录的数据进行处理，如计算核酸浓度和纯度等。
根据实验目的对数据进行进一步分析，如基因组学和表达谱分析等。
将分析结果以图表或表格的形式展示出来，以便更好地呈现数据变化和规律。
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03
CHAPTER
核酸纯化方法
步骤
将DNA样品与凝胶介质混合，置于电泳槽中，施加电场。DNA分子在电场作用下通过凝胶介质，迁移至不同位置，根据其大小分离。
原理
凝胶电泳利用DNA分子在电场中的迁移率差异进行分离。不同大小的DNA分子通过凝胶介质时受到的阻力不同，迁移率随之改变，从而实现分离。
应用
凝胶电泳纯化适用于小量DNA分子的分离和纯化，如PCR产物、克隆DNA等。
在临床诊断中，核酸提取也是检测病毒、细菌等病原体感染的重要步骤。
02
CHAPTER
核酸提取方法
酚/氯仿提取法是一种常用的核酸提取方法，利用酚和氯仿对DNA和蛋白质的溶解度不同，将DNA从蛋白质和其他杂质中分离出来。
原理
将细胞裂解液加入酚/氯仿混合液，剧烈振荡后离心，水相和有机相即刻分离，水相中包含DNA。
应用
离子交换色谱纯化适用于大量DNA分子的分离和纯化，如基因组DNA、质粒DNA等。
04
CHAPTER
核酸定量方法
核酸提取和鉴定PPT讲稿
纯化：使核酸与其它杂质彻底分离，如 蛋白质、盐等
总原则：①应保证核酸一级结构的完整性；
②排除其它分子的污染。
鉴定：浓度、纯度、分子量、测序 （技术：分光光度技术、凝胶电泳技术等）
当前你正在浏览到的事第三页PPTT，共五十三页。
（一）样品预处理（获取分散细胞） 1、植物样品
新鲜组织先用无菌生理盐水洗； 干药材除去霉点，无菌水浸洗；
14）加入50μl DEPC处理水溶解（可以根据管底的白色沉淀判断RNA量的
多少加DEPC处理水）
15）-80℃冰箱保存。
当前你正在浏览到的事第三十四页PPTT，共五十三页。
组织匀浆
当前你正在浏览到的事第三十五页PPTT，共五十三页。
（二）mRNA的提取
从总RNA中分离mRNA， 用Oligo（dT）层析柱。 mRNA含polyA，在高盐浓度条件
化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复 合物。
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机
溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸 分离出来。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
当前你正在浏览到的事第七页PPTT，共五十三页。
（二）提取用具预处理
1、DNA提取用具的处理
要求无菌；试剂、器材高压干燥等进行无DNA酶 处理。
2、RNA提取用具的处理
要求无菌，防止二次污染。
RNA易被RNase水解，RNase无处不在且耐高温
，提取条件要求严格。
当前你正在浏览到的事第八页PPTT，共五十三页。
（3）培养细胞： 离心，弃细胞培养液；
总原则：①应保证核酸一级结构的完整性；
②排除其它分子的污染。
鉴定：浓度、纯度、分子量、测序 （技术：分光光度技术、凝胶电泳技术等）
当前你正在浏览到的事第三页PPTT，共五十三页。
（一）样品预处理（获取分散细胞） 1、植物样品
新鲜组织先用无菌生理盐水洗； 干药材除去霉点，无菌水浸洗；
14）加入50μl DEPC处理水溶解（可以根据管底的白色沉淀判断RNA量的
多少加DEPC处理水）
15）-80℃冰箱保存。
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组织匀浆
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（二）mRNA的提取
从总RNA中分离mRNA， 用Oligo（dT）层析柱。 mRNA含polyA，在高盐浓度条件
化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复 合物。
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机
溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸 分离出来。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
当前你正在浏览到的事第七页PPTT，共五十三页。
（二）提取用具预处理
1、DNA提取用具的处理
要求无菌；试剂、器材高压干燥等进行无DNA酶 处理。
2、RNA提取用具的处理
要求无菌，防止二次污染。
RNA易被RNase水解，RNase无处不在且耐高温
，提取条件要求严格。
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（3）培养细胞： 离心，弃细胞培养液；
实验一核酸的提取ppt课件
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
如何创造一个无RNase的环境 ？
RNA分离的关键因素是： ➢ 尽量减少RNA酶的污染！ ➢极力避免外源RNase的污染：主要来源于
开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状 结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA， 蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
而RNA酶，不但分布广泛、极易污染样品， 而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活，所以生 物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
二、真核细胞染色体DNA的制备
1. 真核细胞的破碎 （1）物理方式:超声波法、匀浆法、液氮
破碎法、Al2O3粉研磨法等。这些物理操作均可 导致DNA链的断裂。
（2）为了获得大分子量的DNA，一般采用 蛋白酶K和去污剂温和处理法。
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
核酸提取经验及原理总结-PPT文档资料
核酸的理化性质
• RNA的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA 则为白色类似石棉样的纤维状物。 DNA、 RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都 溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂， 它们的钠盐比游离核酸易溶于水，RNA 钠盐在水中溶解度可达40g/L，DNA钠盐 在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。
细胞裂解
细胞裂解-细胞的裂解方法
• • • •
机械方法 化学试剂法 反复冻融法 酶解法
细胞裂解-裂解方法的评价
• 含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组 DNA 的首选 。 • 高浓度蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂 解方法，是抽提 RNA 的首选 。 • 含 CTAB 的裂解液，几乎成为富含多糖的样品， 如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解 方法。 • SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具 有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的 特点。
细胞裂解-样品与裂解液的比例
• 裂解液的用量原则是：确保能彻底裂解 样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适 中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影 响得率；浓度过高，去除杂质的过程复 杂且不彻底，导致纯度下降。另外，裂 解液的用量是以样品中蛋白质的含量为 基准的，而不是以核酸含量为基准，这 一点务必牢记。
核酸提取经验及原理总结
主办单位：螺旋网 主讲人：wsuquan 时 间：2019.4.21
Байду номын сангаас
主要内容
• 一、核酸的发现 、核酸的分类和功能 、 核酸的理化性质 • 二、细胞裂解 • 三、核酸提取 • 四、核酸纯化 • 五、核酸检测 • 六、核酸除杂质
核酸的发现 核酸是1869年米 歇尔(F.Miescher)在脓液 的白细胞中发现的，他 当时称之为核素。阿尔 特曼(R.Altmann)于1889年 认识其酸性后，定名为核 酸。核酸分为核糖核酸 (RNA)和脱氧核糖核酸 (DNA)两大类。
核酸的提取
肝素 复合硅酸盐（Macaloid) RNase阻抑蛋白（RNasin） 氧钒核糖核苷复合物 (VanadylRibonucleoside Complex, VRC)
DNA提取的基本步骤
I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放 III.核酸分离、纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
最重要、最基本的操作 。
核酸的分类及分布
脱氧核糖核酸
(deoxyribonucleic acid, DNA) 90%以上分布于细胞核，其余分布于 核外如线粒体，叶绿体，质粒等。 携带遗传信息，决定细胞和个 体的基因型(genotype)。
核糖核酸
分布于胞核、胞液。 (ribonucleic acid, RNA) 参与细胞内DNA遗传信息的表达。
用多糖水解酶将多糖降解。
在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可 以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μL DNA液中加入 200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。
核酸分离、纯化
多酚的去除：
裂解液的用量原则 确保彻底裂解样品 使裂解体系中核酸浓度适中 以样品中蛋白质的含量为基准
细胞裂解
基因组DNA的提取
材料应适量，过多会影响裂解， 导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂 解预处理方式： 植物材料－－液氮研磨 动物组织－－匀浆或液氮研磨 组培细胞－－蛋白酶K 细菌－－溶菌酶破壁 酵母－－破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡 螯合剂
核酸沉淀的温度和时间
低温沉淀能提高沉淀的效率
低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀。 一般使用0℃冰水，10-15min， DNA样品足 可达到实验要求。 如果核酸抽提的起始样品是杂质比较多时， 原则上不要使用低温沉淀
相关主题
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13
用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的 阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的 负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力， 而易于聚集沉淀。
14
DNA提取常见问题
问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
原 因
1. DNA中含有蛋白、多 糖、多酚类杂质
2. DNA在溶解前，有酒 对 精残留，酒精抑制 策 后续酶解反应
4. 外源核酸酶污染
5. 反复冻融
1. 尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融
2. 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液
3. 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量
4. 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 5. 所有试剂用无菌水配制，耗材经高
温灭菌 6. 将DNA分装保存于缓冲液中，避免
➢ 酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用 ➢ 酚的缺点： 能溶解10-15%的水。
最后用氯仿抽提：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层；去除核酸溶 液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）
用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇， 减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力， 从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
CTAB法的最大优点是能较好地去除糖类杂 质
11
SDS法流程图
动物组织
抽提
组织匀浆
上层溶液
细胞裂解
酒精沉淀
12
离心洗涤 干燥溶解
DNA溶液
酚氯仿裂解法
苯酚抽提原理：
➢ 使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液 时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性 基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
CTAB
PVP β-巯基乙醇
终浓度 100 mM
20 mM
1.4M
3%(W/V) 2-5%(W/V)
1-5%（V/V）使 用前加入
❖ PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合
物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合， 有效去除多糖。
❖ 同时向抽提液中加入还原剂β-巯基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二
核酸提取原理及常见问题
1
内容
第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、
原因分析及其对策 第三部分：RNA提取方法简介 第四部分：RNA提取常见问题、
原因分析及其对策
2
DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取
➢ CTAB法 ➢ SDS法 ➢ 酚氯仿法 ➢ 试剂盒法
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CTAB法（植物DNA提取经典方法）
CTAB法原理
➢ CTAB，是一种阳离子去污剂，可破碎细胞壁和细胞膜，并与核酸形 成复合物。
➢ 在高盐溶液中 ( 1.4 mol / L NaCl ) 是可溶的 ,当降低溶液盐浓度到一定 程度( <0.7 mol /L NaCl )时 ,从溶液中沉淀 。通过离心 , 可将 CT A B — 核酸复合物同蛋白质 、 中性多糖类物质分开 。
反复冻融
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问题三：DNA提取量少。
原 因
1. 实验材料不佳或量少 2. 破壁或裂解不充分 对
策
3. 沉淀不完全 4. 洗涤时DNA丢失
EDTA （pH8.0）
NaCl
CTAB
β-巯基乙醇
100 mM
20 mM
1.4M
2%(W/V)
0.1%（V/V） 使用前加入
➢ Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ➢ EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ➢ NaCl 提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白）易于溶解。 ➢ CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； ➢ β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
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细胞裂解后释放的植物次生代谢产物和多 酚类化合物易于氧化 ,氧化的多酚结合到 DNA 分子上而致 D N A 降解；
多糖的性质与核酸类似，会与核酸一同沉 淀下来，影响植物核酸纯度。
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改良方法 1
CTAB提取缓冲液的改进配方
组份
Tris-HCl （pH8.0）
EDTA （pH8.0）
NaCl
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CTAB法流程图
植物材料
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
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干燥溶解
SDS法
SDS法原理
➢ SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
➢ 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀；
3. DNA中残留有金属离 子
1. 重新纯化DNA，去除蛋 白、多糖、多酚等杂 质
2. 重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发
3. 增加70％乙醇洗涤的 次数（2-3次）
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问题二：DNA降解。
原 因
1. 材料不新鲜或反复冻
融
2. 未很好抑制内源核酸
酶的活性
对 策
3. 提取过程操作过于剧
烈，DNA被机械打断
硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除。
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改良方法 2
加入核酸分离缓冲液，利用高温加热裂解细胞， 去除部分杂质，离心得到细胞核；
针对多糖组织，得到细胞核之后可加入1XPBS 清洗2-3次，去除多糖；
后续使用CTAB裂解液裂解细胞核。
核酸分离缓冲液：200mM Tris-HCl 50mM EDTA 250mM NaCl 2%PVP
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
SDS法DNA提取缓冲液
组份
Tris- ）
终浓度 10 mM
20 mM
NaCl 0.4M
SDS 2%
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SDS 法操作简单 , 温和 , 也可提取到较高分 子量 DNA ,但所得产物含糖类杂质较多
➢ 溶解于高盐溶液中的 CTA B —核酸复合物 , 加入乙醇可使核酸沉淀 , 而 CT A B 则溶于乙醇.
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
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CTAB提取缓冲液的经典配方
组份 终浓度
Tris-HCl （pH8.0）
用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的 阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的 负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力， 而易于聚集沉淀。
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DNA提取常见问题
问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
原 因
1. DNA中含有蛋白、多 糖、多酚类杂质
2. DNA在溶解前，有酒 对 精残留，酒精抑制 策 后续酶解反应
4. 外源核酸酶污染
5. 反复冻融
1. 尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融
2. 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液
3. 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量
4. 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 5. 所有试剂用无菌水配制，耗材经高
温灭菌 6. 将DNA分装保存于缓冲液中，避免
➢ 酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用 ➢ 酚的缺点： 能溶解10-15%的水。
最后用氯仿抽提：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层；去除核酸溶 液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）
用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇， 减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力， 从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
CTAB法的最大优点是能较好地去除糖类杂 质
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SDS法流程图
动物组织
抽提
组织匀浆
上层溶液
细胞裂解
酒精沉淀
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离心洗涤 干燥溶解
DNA溶液
酚氯仿裂解法
苯酚抽提原理：
➢ 使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液 时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性 基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
CTAB
PVP β-巯基乙醇
终浓度 100 mM
20 mM
1.4M
3%(W/V) 2-5%(W/V)
1-5%（V/V）使 用前加入
❖ PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合
物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合， 有效去除多糖。
❖ 同时向抽提液中加入还原剂β-巯基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二
核酸提取原理及常见问题
1
内容
第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、
原因分析及其对策 第三部分：RNA提取方法简介 第四部分：RNA提取常见问题、
原因分析及其对策
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DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取
➢ CTAB法 ➢ SDS法 ➢ 酚氯仿法 ➢ 试剂盒法
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CTAB法（植物DNA提取经典方法）
CTAB法原理
➢ CTAB，是一种阳离子去污剂，可破碎细胞壁和细胞膜，并与核酸形 成复合物。
➢ 在高盐溶液中 ( 1.4 mol / L NaCl ) 是可溶的 ,当降低溶液盐浓度到一定 程度( <0.7 mol /L NaCl )时 ,从溶液中沉淀 。通过离心 , 可将 CT A B — 核酸复合物同蛋白质 、 中性多糖类物质分开 。
反复冻融
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问题三：DNA提取量少。
原 因
1. 实验材料不佳或量少 2. 破壁或裂解不充分 对
策
3. 沉淀不完全 4. 洗涤时DNA丢失
EDTA （pH8.0）
NaCl
CTAB
β-巯基乙醇
100 mM
20 mM
1.4M
2%(W/V)
0.1%（V/V） 使用前加入
➢ Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ➢ EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ➢ NaCl 提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白）易于溶解。 ➢ CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； ➢ β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
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细胞裂解后释放的植物次生代谢产物和多 酚类化合物易于氧化 ,氧化的多酚结合到 DNA 分子上而致 D N A 降解；
多糖的性质与核酸类似，会与核酸一同沉 淀下来，影响植物核酸纯度。
6
改良方法 1
CTAB提取缓冲液的改进配方
组份
Tris-HCl （pH8.0）
EDTA （pH8.0）
NaCl
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CTAB法流程图
植物材料
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
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干燥溶解
SDS法
SDS法原理
➢ SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
➢ 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀；
3. DNA中残留有金属离 子
1. 重新纯化DNA，去除蛋 白、多糖、多酚等杂 质
2. 重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发
3. 增加70％乙醇洗涤的 次数（2-3次）
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问题二：DNA降解。
原 因
1. 材料不新鲜或反复冻
融
2. 未很好抑制内源核酸
酶的活性
对 策
3. 提取过程操作过于剧
烈，DNA被机械打断
硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除。
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改良方法 2
加入核酸分离缓冲液，利用高温加热裂解细胞， 去除部分杂质，离心得到细胞核；
针对多糖组织，得到细胞核之后可加入1XPBS 清洗2-3次，去除多糖；
后续使用CTAB裂解液裂解细胞核。
核酸分离缓冲液：200mM Tris-HCl 50mM EDTA 250mM NaCl 2%PVP
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
SDS法DNA提取缓冲液
组份
Tris- ）
终浓度 10 mM
20 mM
NaCl 0.4M
SDS 2%
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SDS 法操作简单 , 温和 , 也可提取到较高分 子量 DNA ,但所得产物含糖类杂质较多
➢ 溶解于高盐溶液中的 CTA B —核酸复合物 , 加入乙醇可使核酸沉淀 , 而 CT A B 则溶于乙醇.
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
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CTAB提取缓冲液的经典配方
组份 终浓度
Tris-HCl （pH8.0）