核酸的分离提取PPT
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革兰氏阳性细菌主要包含细菌中的厚壁菌门(Firmicutes)（低G+C革兰氏阳性细菌）和放线菌门(Actinobacteria)（高G+C革兰氏阳性细
菌）。
DNA提取方法
磁珠法：生物磁珠是一种新型的功能化固体载体，其表面包被有活性基团，可以与多 种生物活性物质发生偶联，兼具有液体的流动性和固体磁性材料等特点，在外磁场的 作用下可以定向移动和集中，当撤去外磁场后，稍加振荡或抽吸又可均匀分散于液体 中，从而使固液相的分离变的十分快捷方便，通过简单的洗脱可以得到纯度很高的靶 向物质。
➢核酸提取试剂盒
DNA提取试剂盒 RNA提取试剂盒
DNA提取方法
➢DNA提取方法
种子用粉碎机打成粉末状使用，样品为种子时，裂解时间为30min。
磁取珠10法µlD病N毒A（进1D行.碱N0A裂. /R解NA法）：提碱取裂试剂解盒法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的。 如快果速是 质干粒材DN料2A，.提煮适取沸当试法延剂：长盒裂煮解沸时时间将；样品中的DNA通过核酸裂解液的作用释放出来，离心沉淀后将杂质去
蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将
DNA 钠盐沉淀出来。
DNA提取方法
4.苯酚抽提法： 苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液 时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋 白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含 DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物 质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 。
生物化学 第2章Ⅱ 核酸(共86张PPT)
内呈正比
5、电泳缓冲液
DNA的凝胶电泳检测
(ethidiumbromide， 简称EB)是一种核酸染料，可以插入到DNA
或RNA分子的碱基之间，并在300nm波长的
紫外光照射下放射出橘红色的荧光，可用来显现 凝胶中的核酸分子。
在凝胶电泳中，溴化乙锭染料可对核酸分子 染色，在紫外光下便可以十分敏感而方便地检测 出凝胶介质中DNA谱带。
五、变性、复性与杂交
（一）、DNA的变性
1、概念 2、变性因素
3、变性的指标
1、概念
是指核酸双螺旋区的氢键断裂，双螺旋 解开，变成无规则线团的现象。核酸变 性其分子中的共价键并没有破坏，分子 量也不改变，核酸的变性（
denaturation ）
2、DNA的变性的因素
温度升高；
酸碱度改变、 pH（>11.3或<5.0）；
1、核酸分子本身的大小：同分子的摩擦
系数成反比的 Maxam和Gilbert 于1977年发明
Primer1（10uM）
2、琼脂糖的浓度：迁移率与胶浓度成反比 而聚丙烯酰胺凝胶制胶时不能将染料加入，会影响聚合。
第五节 核酸的研究方法 据此特性可以定性和定量检测核酸。
在液氮蒸发去2/3时，用自制研杵迅速磨碎叶片；
RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变 性行为所引起的性质变化没有DNA那样 明显。 天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸
收(260 nm)值增加25－40%.而RNA变性 后，约增加1.1%。
4. DNA变性后的表现
A260值增加
粘度下降
浮力密度增大
分子量不变
（二）、DNA的复性
1、概念：
变性DNA在适当的条件下，两条彼此分 开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构 ，这一过程称为复性；
核酸的分离纯化PPT课件
三、核酸的鉴定与保存
2、纯度鉴定 ⑴ 紫 外 分 光 光 度 法 ： 该 法 主 要 通 过 A260 与 A280
的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升 高与
降低均提示不纯。 在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280
纯RN第A25的页/共A12562页0/A280比值为
三、核酸的鉴定与保存
1. DNA或RNA的定量 OD260相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸
三、核酸的鉴定与保存
• 完整或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带 荧光强度积分应呈特定的比值，沉降系数大的 核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反 之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分 低。
第32页/共152页
三、核酸的鉴定与保存
• 一般而言，28S（23S）RNA的荧光强度约为 18S（16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降 解。若 在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA 的污染。
75%的乙醇洗涤去除
第18页/共152页
三、核酸的鉴定与保存
（一）核酸的鉴定 （二）核酸的保存
第19页/共152页
三、核酸的鉴定与保存
（一）核酸的鉴定 1、浓度鉴定 2、纯度鉴定 3、完整性鉴定
第20页/共152页
三、核酸的鉴定与保存
1、浓度鉴定 ⑴ 紫外分光光度法：该法是基于核酸分子 中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸 收 紫外线，其最大吸收波长为260nm。
第2页/共152页
第五章 核酸的分离纯化
核酸分离纯化的原则 一、 保持核酸一级结构的完整性 二 、尽可能提高核酸制品的纯度
第3页/共152页
提取DNA总的原则
实验五 菜花中核酸的分离
DNA溶液（ml）
－ 1 － －－
RNA溶液（ml）
－－ 1 －－
提取物一（ml）
－－ － 1 －
提取物二（ml）
－－ － － 1
二苯胺试剂10min的现象
• 2. 苔黑酚反应
试管号
6 7 8 9 10
DW（ml）
1
DNA溶液（ml）
1
RNA溶液（ml）
1
提取物一（ml）
• 4. 弃去上清液——沉淀中加入10ml95%的乙醇—— 振荡均匀——离心6min,v=10000
• 5. 弃去上清液——沉淀中加入10ml丙酮— —振荡均匀——离心6min,v=10000.
• 6.弃去上清液——沉淀中加入10ml10%的 NaCl溶液——振荡均匀——在沸水浴中加热 15min——冷却——离心5min,v=6000
1
提取物二（ml）
1
FeCl3浓HCl溶液（ml） 2 2 2 2 2
苔黑酚乙醇溶液（ml） 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
沸水中加热10min后的现象
• 根据现象分析提取物一和提取 物二主要含有什么物质？
实验五 菜花中核酸的分离 和鉴定
一、核酸的分离
• 1. 称取10g菜花——剪碎——加入10ml 95％的乙醇 （注意分三次添加）——研磨——倒入离心管—— v=10000,离心6min
• 2. 弃去上清液——沉淀中加入10ml丙酮——振荡均 匀——离心6min,v=10000
• 3. 弃去上清液——沉淀在冰盐浴中加入10ml 5%的 HClO4 ——振荡均匀——离心6min,v=10000
• 7.将上清液倒入试管为提取物一——沉淀中 加入5ml 0.5 mol/L 的HClO4 ——在70℃水 浴中加热20min——冷却离心 5min,v=6000
核酸的分离纯化(1)
Kanamycin resistance gene
Stanley Cohen & Annie Chan
Plasmi d
pSC10 1
Tetracycline resistance gene
E. coli transformed with recombinant plasmid
Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline
（五）核酸的保存
完整版课件ppt
21
前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
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22
一、核酸分离、纯化原整版课件ppt
10
一把特殊的剪刀 —限制性内切酶的发现
阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)， 获1978年诺贝尔生理学和医学奖
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11
Herbert Boyer, Stanley Cohen 1972年获得第一 个重组DNA分子 (实现不同来源 DNA的重组)
1 意义
遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸 的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其 他生物大分子结合的方式。
2 分离核酸原则：
1）温度不要过高；
2）控制一定的pH值范围(pH值5-9);
3）保持一定的离子强度;
4）减少物理因素对核酸降解的机械剪切力.
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23
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（二）防止核酸的生物降解
分别提取动物组织中的DNA和RNA及核酸的定性分析-经典PPT课件
在不同浓度电解质中溶解度有明显差别
0.14M
2. 核酸与蛋白质的分离 DN
氯仿-异丙醇
P
极小
1M 大两倍
3. 核酸的沉淀
RN P
相当大 变化不大
目录
实验原理 （二）核酸的鉴定 1. 核酸的水解
RNA和DNA均可被硫酸水解生成含氮碱 （嘌呤碱与嘧啶碱）、戊糖（RNA中的核糖 与DNA中的脱氧核糖）和磷酸。
CH3
2H2O
核糖
HO
OH
3，5-二羟甲苯
HO
C O
CH3
O OH
H3C 绿色化合物
目录
2. 成分的鉴定
实验原理
（3）脱氧核糖的鉴定原理
CHO
CHO
CH2 浓H2SO4 CH2
CHOH
CH2
CHOH H2O C O
CH2OH
CH2OH
脱氧核糖
ω —羟基—γ —酮基戊醛
NH
二苯胺
蓝色化合物
目录
2. 成分的鉴定
目录
实验操作
2．分离提取 将上述肝匀浆全部倾入一支10ml刻度离心
管中，再用0.14M NaCl溶液分两次将研钵中 肝匀浆洗入离心管中，使离心管内总量不超过 5ml。用玻璃棒充分搅匀，放置10min ，离心 （3500r/min）5min。溶液分为两层。
目录
实验操作
2．分离提取 用滴管吸取上清液于另一离心管中，用于进一
目录
实验操作
2．分离提取 分别在上清液中加入1.5～2倍体积的冰冷
的95%乙醇。在分离提取DNA时，要边加边 用玻璃棒搅拌，此时纤维状的DNA缠绕在玻 璃棒上。当分离提取RNA时，轻轻搅拌，出现 乳白色絮状沉淀。分别离心（3500r/min） 5min，弃去上层乙醇液，沉淀为RNA或DNA
《核酸分离纯化》PPT课件
2.2.2 加入SDS
SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具 有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
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12
2. 2.3 酚/氯仿抽提
酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果， 并对核酸酶有抑制作用。
氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少 残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素 和蔗糖的作用。
1.1.2 分离核酸原则：
1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
Hom精e选课件ppt
4
1.2 防止核酸的生物降解
细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链 中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。
所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓 冲液中需加核酸酶抑制剂。
精选课件ppt
6
1.2.2 RNA酶（RNAase)抑制剂
RNAase分布广泛，极易污染样品，而且 耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ） 作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase， 使其失活。
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7
(2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5)
第二节 核酸的分离纯化
精选课件ppt
1
主要内容
Hale Waihona Puke 前言1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性
1.2. 防止核酸的生物降解
2 分离提取核酸的主要步骤
2.1 细胞的破碎
2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除
2.3 核酸的沉淀
2.4 核酸的浓度测定
2.5 核酸的保存
精选课件ppt
2
前言
SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具 有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
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12
2. 2.3 酚/氯仿抽提
酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果， 并对核酸酶有抑制作用。
氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少 残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素 和蔗糖的作用。
1.1.2 分离核酸原则：
1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
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4
1.2 防止核酸的生物降解
细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链 中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。
所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓 冲液中需加核酸酶抑制剂。
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6
1.2.2 RNA酶（RNAase)抑制剂
RNAase分布广泛，极易污染样品，而且 耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ） 作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase， 使其失活。
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7
(2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5)
第二节 核酸的分离纯化
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主要内容
Hale Waihona Puke 前言1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性
1.2. 防止核酸的生物降解
2 分离提取核酸的主要步骤
2.1 细胞的破碎
2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除
2.3 核酸的沉淀
2.4 核酸的浓度测定
2.5 核酸的保存
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2
前言
核酸的提取ppt课件
• 三、操作步骤 • 1、1.5ml菌液（每组两管）4 ℃ 12000rpm离心 30sec，弃去上清，倒置试管于吸水纸上吸干。 • 2、每管加入400µl裂解液，用移液枪枪头反复抽 吸辅助裂解，37 ℃水浴30min。 • 3、每管加入132µl的5M NaCl溶液，颠倒试管， 充分混匀后，13000rpm离心15min。用粗口的枪 头（用剪刀剪去1ml枪头的尖端）小心取出上清液 转倒两支新的eppendorf管中。 • 4、加入等体积的饱和苯酚/氯仿，充分混匀后， 12000rpm离心3min，离心后的水层如混浊则说 明仍含有蛋白质，则需将上清液转入新的试管， 重复上述步骤直到水层透明，水层和酚层之间不 再白色沉淀物为止（约2次）。
DNA提取方法很多，实验采用酚抽 提法。其基本原理是超低温粉碎， 通过蛋白酶K和SDS消化，破碎细胞， 再用酚/氯仿去除蛋白质。
SDS
Proteinase K 酚/氯仿
1）防止和抑制内源 Dnase对DNA的降解； 只需加入一定浓度的 螯合剂如EDTA，因 为几乎所有Dnase 都 需要Mg2+或Mn2+为 辅助因子。
• 5、将上层清液转入新的eppendorf管，加等体积 的氯仿，混匀后13000rpm离心3min，除去苯酚。 • 6、小心吸出上清液转入新的eppendorf管，用预 冷的两倍体积的无水乙醇沉淀，放置－20℃冰箱 30min，然后13000rpm离心15min，可见白色丝 状沉淀物。 • 7、小心吸出液体，弃上清液，用预冷的400µl 70 ％乙醇洗涤2次，室温干燥后，用50µlTE （含 20µg/ml的Rnase）溶解DNA，－20℃冰箱放置 备用。
5.核酸提取的一般过程
I.材料准备 破碎细胞 II.破碎细胞或包膜－内容物释放
核酸自动提取仪ppt课件
AnaPrep的优势
纯化结果标准化 高度再现性 高度一致性 防止交叉污染 风险低 降低曝露于危险样本及化学物品的风险 减少人为的失误 提升纯化效率 节省时间和人力
窗口
紫外光消毒灭菌灯
控制面板
液晶显示屏幕
滑门
条形码读取器
AnaPrep 12
AnaPrep的正面
与众不同的AnaPrep系统
1. 更容易操作和维护设计 2. 更好的纯化结果 3. 更节省人力，时间和成本
核酸自动化提取仪介绍
内容提要
一、产品介绍 二、仪器特点 三、配套试剂 四、市场分析
*
一、产品介绍
*
AnaPrep功能及用途
AnaPrep 12 是一个桌上型的全自动化核酸提取系统，使用磁珠分离技术, 能快速从各种临床样本中提取核酸 具备移液装置（ Liquid handling automation ），使用预先填充的试剂匣 可用于体外诊断和科学研究
二、产品特点
AnaPrep的特点
轻松使用(容易安装、操作和维护) 降低污染风险 优良的纯化效果 具多功能性
1.1 轻巧不占空间, 灵活运用
轻巧 不占空间，节省实验室空间 无需外接计算机 灵活 一次运作可放入1-12个样本，一天可纯化96个样本 使用独立的试剂匣和耗材品，即使操作少量的样本数时, 亦不会产生浪废试剂的情况
Use for AnaPrep Blood DNA Extraction 200
1.3 快速条形码程序设定
LCD屏幕上提供实时操作索引和纯化步骤流程信息 无需繁杂的使用前训练, 没有大型仪器操作经验者, 也能轻松上手
READ PROTOCOL BARCODE “ESC” BACK “ENTER”NEXT
核酸提取原理及方法课件
利用机器学习和深度学习算法，优化提取参数和流程， 提高提取效率。
新技术与新方法的探索
纳米材料在核酸提取中的应用
利用纳米材料的特性和功能，开发新型核酸提取方法 。
微流控技术在核酸提取中的应用
通过微流控芯片技术，实现核酸的快速、高效提取。
THANKS
感谢观看
核酸完整性的检测
琼脂糖凝胶电泳
通过观察DNA在电场中的迁移行为，判断DNA的完整性。
脉冲场凝胶电泳
利用不同的脉冲电场来分离不同大小和结构的DNA片段，以 评估核酸的完整性和大小分布。
核酸纯度的检测
紫外光谱分析
通过测量核酸在260nm和280nm紫外光下的吸光度，判断核酸中蛋白质、酚 和其他杂质的含量。
基因组测序
通过对基因组进行测序，可以深入了 解基因的结构和功能，为疾病诊断、 药物研发和生物进化研究提供重要信 息。
基因表达分析
通过比较不同组织或条件下的基因表 达谱，可以研究基因在生命活动中的 作用，以及基因与疾病的关系。
分子生物学研究
分子克隆
利用核酸提取技术，可以获得目的基因的克隆，为进一步研究基因的功能和表达调控机制提供基础。
吸附法
原理
利用吸附剂（如硅藻土、氧化铝 等）对DNA的吸附作用，将
DNA从细胞或组织中分离出来。
步骤
细胞裂解→加入吸附剂→搅拌→ 洗涤→解吸附→DNA。
注意事项
操作过程中要控制好吸附剂的用 量和洗涤次数，同时要保证解吸
附时的温度和pH值。
其他提取方法
酶法
利用酶（如蛋白酶、核酸酶等）将细 胞或组织中的DNA或RNA释放出来 ，再进行提取。
高效液相色谱
利用色谱柱将核酸中的杂质与核酸分离，并通过检测器检测纯度。
新技术与新方法的探索
纳米材料在核酸提取中的应用
利用纳米材料的特性和功能，开发新型核酸提取方法 。
微流控技术在核酸提取中的应用
通过微流控芯片技术，实现核酸的快速、高效提取。
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核酸完整性的检测
琼脂糖凝胶电泳
通过观察DNA在电场中的迁移行为，判断DNA的完整性。
脉冲场凝胶电泳
利用不同的脉冲电场来分离不同大小和结构的DNA片段，以 评估核酸的完整性和大小分布。
核酸纯度的检测
紫外光谱分析
通过测量核酸在260nm和280nm紫外光下的吸光度，判断核酸中蛋白质、酚 和其他杂质的含量。
基因组测序
通过对基因组进行测序，可以深入了 解基因的结构和功能，为疾病诊断、 药物研发和生物进化研究提供重要信 息。
基因表达分析
通过比较不同组织或条件下的基因表 达谱，可以研究基因在生命活动中的 作用，以及基因与疾病的关系。
分子生物学研究
分子克隆
利用核酸提取技术，可以获得目的基因的克隆，为进一步研究基因的功能和表达调控机制提供基础。
吸附法
原理
利用吸附剂（如硅藻土、氧化铝 等）对DNA的吸附作用，将
DNA从细胞或组织中分离出来。
步骤
细胞裂解→加入吸附剂→搅拌→ 洗涤→解吸附→DNA。
注意事项
操作过程中要控制好吸附剂的用 量和洗涤次数，同时要保证解吸
附时的温度和pH值。
其他提取方法
酶法
利用酶（如蛋白酶、核酸酶等）将细 胞或组织中的DNA或RNA释放出来 ，再进行提取。
高效液相色谱
利用色谱柱将核酸中的杂质与核酸分离，并通过检测器检测纯度。
核酸的分离与纯化ppt课件
核酸提取方法——分离与纯化
——盐析法
产量较低，但方法简单，比较酚氯仿方法无化学危害；
同样不适合大规模自动化提取。
提取好的DNA用蛋白酶处理纯度会提高。
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
核酸提取方法——分离与纯化
每一步骤又可由多种不同的方法单独或 联合实现。
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
核酸提取方法——细胞裂解
细胞裂解可通过以下几种方法实现：
物理作用 化学作用 酶作用 （生物作用）
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
碱性pH环境：强碱(NaOH) 或碱性缓冲液 ( TE、
STE 等)
在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋 白质和多糖沉淀,核酸释放到水相；某些缓冲液中的一些金属离 子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子 Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。
核酸提取方法——分离与纯化
——硅胶吸附法
产量较低，纯度很好； 也能造成大片段核酸的损伤； 对极小片段核酸提取不够好； 简单方便，可进行自动化处理。
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
核酸提取方法——分离与纯化
——硅胶吸附法
1、细胞裂解和酶处理同前述；
——盐析法
产量较低，但方法简单，比较酚氯仿方法无化学危害；
同样不适合大规模自动化提取。
提取好的DNA用蛋白酶处理纯度会提高。
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
核酸提取方法——分离与纯化
每一步骤又可由多种不同的方法单独或 联合实现。
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
核酸提取方法——细胞裂解
细胞裂解可通过以下几种方法实现：
物理作用 化学作用 酶作用 （生物作用）
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
碱性pH环境：强碱(NaOH) 或碱性缓冲液 ( TE、
STE 等)
在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋 白质和多糖沉淀,核酸释放到水相；某些缓冲液中的一些金属离 子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子 Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。
核酸提取方法——分离与纯化
——硅胶吸附法
产量较低，纯度很好； 也能造成大片段核酸的损伤； 对极小片段核酸提取不够好； 简单方便，可进行自动化处理。
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
核酸提取方法——分离与纯化
——硅胶吸附法
1、细胞裂解和酶处理同前述；
实验一核酸的提取ppt课件
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
如何创造一个无RNase的环境 ？
RNA分离的关键因素是： ➢ 尽量减少RNA酶的污染！ ➢极力避免外源RNase的污染：主要来源于
开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状 结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA， 蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
而RNA酶，不但分布广泛、极易污染样品， 而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活，所以生 物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
二、真核细胞染色体DNA的制备
1. 真核细胞的破碎 （1）物理方式:超声波法、匀浆法、液氮
破碎法、Al2O3粉研磨法等。这些物理操作均可 导致DNA链的断裂。
（2）为了获得大分子量的DNA，一般采用 蛋白酶K和去污剂温和处理法。
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
酵母核糖核酸的分离及组分鉴定改课件PPT
嘌呤碱+过量浓氨水+AgNO3
絮状嘌呤银化合物
将所有提取物转移到小三角瓶中，加硫酸进行水解，再分别鉴定组份。
在滤纸上凉干，称量。（差减法称量，滤纸应提 上清液慢慢倾入10 ml 酸性乙醇中，边加边搅，沉淀RNA静置5min， 3000转离心10min，弃上清，取沉淀。
H3PO4+12H2MoO4
H3P(Mo3O10)4+12H2O+12H2O
2
4
42 4
将所有提取物转移到小三角瓶中，加硫酸进行水解，再分别鉴定组份。
H3P(Mo3O10)4
Mo2O3MoO3(钼蓝）
H PO +12H MoO 酸性乙醇溶液, 95%乙醇
离三心氯前 化玻铁璃浓3 离盐心溶管液4（,苔套黑上酚塑乙料醇2管；套）放4在天平上平衡好；
H3P(Mo3O10)4+12H2O+12H2O
去表面杂质。第一次将沉淀捣散后再离心5min； 上清液慢慢倾入10 ml 酸性乙醇中，边加边搅，沉淀RNA静置5min， 3000转离心10min，弃上清，取沉淀。
H3P(Mo3O10)4
Mo2O3MoO3(钼蓝）
第二次将沉淀捣散过滤，旨在将沉淀誊出来，放 H3P(Mo3O10)4
Mo2O3MoO3(钼蓝）
磷酸
碱基 戊糖
酵母菌
酵母中主要成分是RNA（2.67～10.0%)，DNA很少 (0.03～0.516%)。
总RNA的提取: 采用稀碱裂解法，乙醇沉淀RNA, 洗涤除
杂质；
RNA组分鉴定:硫酸可使RNA水解，再分别鉴定
1. 核糖的鉴定——苔黑酚(3,5—二羟基甲苯)法
CHO
HC OH 浓酸
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15
6. DNA提取过程中杂质去除
多糖类杂质
植物组织中富含多糖, 其许多理化性质与DNA 很相似, 因此很难将它们分开。常 用方法是根据溶解性先沉淀多糖 （1）在氯仿处理后的上清液中，加2 %CTAB 分离缓冲液 （2）在 DNA 未溶出之前，先用一些缓冲液洗去多糖
如100 mmol/LTris-HCl, pH 8.0; 5mm EDTA; 0.35 mol/L Sorbitol (山梨醇)洗几次 （3）提高NaCl 浓度至2.5 mol/L或加 NH4COOH 使终浓度为 10 mmol/L或 0.5 mL DNA 液中加 0.12 5 mL 4 mol/L NaCl 和 0.625 mL 13% PEG 8000（冰浴 1 h）或用 水饱和乙醚，1.2-1.5 mol/L NaCl 溶液将大部分多糖去除, 再用2 倍乙醇沉淀DNA 可大大提高效率 （4）高浓度 KCH3COOH 有利于除去多糖
16
6. DNA提取过程中杂质去除
(5) DNA 沉淀重悬于30 %乙醇,4 ℃过夜先沉淀多糖,离心取上清加乙醇至80 %重新沉淀DNA (6) 常温25oC异丙醇过夜沉淀DNA 可减少杂质污染 (7) 在提取缓冲液中1/2体积的氯苯，氯苯与多糖的羟基作用而去除多糖 (8) 如果材料较少或要求较高，则可考虑用柱层析方法，使用对 DNA 具有 特异性吸附的树脂来纯化 DNA 曾有文献提到选用 Wizard Purification Kit， PRC-5 柱 ，Sephacryl S-1000 或 S-500，Qiagen Genomic tip 500/G ，或者 CsCl 梯度离心纯化 DNA (9) 调节取样时期可减少粗提产品中多糖含量，生长幼苗暗室暗化处理，黄化 叶提取DNA可有效地防止多糖污染
12
5. 提取缓冲液对植物总DNA提取的影响与作用
表面表面活性剂： 十二烷基磺酸钠(SDS)： 是一种阳离子强表面活性剂, 通常与蛋白酶K和抗氧化剂、 螯合剂一起使用 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) ：是一种在高盐下能与核酸结合形成可溶、稳定的 复合物, 低盐浓度下可沉淀的表面活性剂
酶抑制剂 乙二胺四乙酸 (EDTA)： 可用于抑制金属离子依赖性的酶 (螯合Mg2+ 、Ca2+ ) 的活 性 牛血清白蛋白(BSA) ：可使一些降解酶的表面变性 精胺及其他多胺: 降低核酸酶的影响 氰化物: 降低重金属氧化酶的影响
17
6. DNA提取过程中杂质去除
植物色素成分去除
植物色素分布：在植物中广泛存在 种类：脂溶性和水溶性色素两类
脂溶性色素多为四萜类衍生物 不溶于水，难溶于甲醇，易溶于乙醇、乙醚和氯仿等 叶绿素、叶黄素、胡萝卜素、番红花素和辣椒红素等 其中胡萝卜素不溶于乙醇。
水溶性色素：主要为花色甙类，又称花青素，普遍存在于花中 可溶于水与乙醇，不溶于乙醚与氯仿等有机溶剂，色泽随pH改变
5
2. 提取DNA应满足的基本原则
不同的研究对DNA的要求不一致，但一般应满足: (1) 排除蛋白、糖类和脂类等物质的污染，DNA纯度应满足下游操作需要 用于RFLP、AFLP应满足酶切要求 用于PCR的不含PCR的干扰甚至抑制物 (2) 所得DNA应当完整 电泳检测得到清晰、完整、可重复、无降解的条带 保证DNA一级结构的完整 (3) 足够量的DNA 有的实验要求量多（标记）
19
7. DNA提取过程中各试剂的主要作用
β巯基乙醇和抗坏血酸钠：抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变， 使酚类物质容易从基因组DNA去除 蛋白酶K:是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，切割脂族和芳香族氨基酸 的羧基端肽键，用于生物样品中蛋白质的一般降解。将蛋白质降解成小肽 或氨基酸，使DNA分子分离出来 NaCl: 提供一个高盐环境, 使DNA充分溶解于液相中 异戊醇：（1）在抽提DNA时，为了混合均匀，必须振荡混匀数次，这时在 混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低 分子表面张力，减少泡沫产生。一般采用氯仿：异戊酵=24：1或酚：氯仿： 异戊醇=25: 24: 1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与 异戊醇即成） （2） 同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及 下层有机溶剂相维持稳定
现代分子生物学的发展导致DNA 分离技术层出不穷, DNA 已经可以 从诸如化石、标本、木乃伊等极端材料中分离出来, 也可以从痕量材料获 得DNA
无论什么材料, 针对不同来源和特点, 调整设计相应的提取缓冲液及 不同的技术方案是十分重要和必需的
在实际应用中可针对不同情况对具体实验方案的各个部分进行不同 组合。缓冲液的成分应根据分离对象的不同而变化，缓冲液的pH值、保 护剂和表面活性剂都要根据不同样品进行优化
植物分子生物学实验技术
颜泽洪
1
主要内容
第一部分 核酸的分离制备 第二部分 PCR技术 第三部分 主要分子标记 第四部分 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ因克隆
2
参考书目：
（美）Dveksler GS and Dieffenbach CW. 黄培堂 俞炜源 陈添弥等译 现代生物技术译从 PCR技术实验指南 科学出版社
（英） Clark MS 主编 顾红雅 瞿礼佳 主译 植物分子生物学实验手册 高等教育出版社 施普林格出版社 郑成木 主编 植物分子标记原理与方法 湖南科学技术出版社 Brown TA. 魏群等译 国外优秀生命科学教材译从 基因克隆和DNA分析 高等教育出版社
8
4. 基本步骤
（2）组织（细胞）破碎 物理方法 溶涨和自溶; 化学方法 生物酶降解 液氮快速冷冻处理后研磨（推荐）或在提取缓冲液中研磨（不推荐）
（3）释放DNA 释放DNA到CTAB或SDS类去污剂中、65oC保温处理
（4）纯化和浓缩：去除残渣、沉淀DNA 释放出的DNA中含有大量的RNA、蛋白质、多糖、丹宁和色素等杂质 需用氯仿、苯酚处理后变性、沉淀除去，RNA可用RNase除去。 通常采用4oC离心的方法，产生分层，去掉植物残渣、留上清液部分 沉淀通常采用异丙醇（1 volume)、酒精（2 volume) 等
可以采用非可溶性PVP（polyvinylpyrrolidone）研磨样品， PVP能络合多酚类物 质，不但能较彻底防止氧化作用，而且能有效的去除多糖和色素
在DNA浓缩之前，再用CTAB处理1-2次；或采用乙醇等有机溶剂洗涤 加入抗氧化剂，防止酚类物质褐化
18
7. DNA提取过程中各试剂的主要作用
7
4. 基本步骤
（1）植物材料的采集及前处理 尽可能使组织材料保持水分而保鲜（用湿纱布包裹,放置于密闭的冰盒等） 野外远距离采集样本时，尽可能采用冷冻保存(如放置于液氮中) 不具备冷冻条件时 无水CaSO4 的瓶子分别保存使其迅速干燥，可将材料 保存数月，返回后尽快提取DNA 对具有大量次生代谢物(如丹宁、酚类、醌类等) 的植物材料,尽可能采集幼嫩组织， 冷冻保存、短时间内提取DNA 植物组织化学保存法 乙醇、丙二醇处理法 导致DNA剧烈降解（不推荐） 样品长期保存 液氮处理后贮存在- 80℃冰箱或直接储放于液氮中 在与提取缓冲液接触前防止冰冻样品在空气中融化导致酚类易被氧化 实验室发苗、田间取叶片（清洗去除灰尘、泥土以及菌孢子等） 饥饿处理减少淀粉含量、遮光处理产生黄化苗
10
4. 基本步骤
（7）DNA保存备用 通常用pH 8.0的TE（Tris-EDTA）缓冲液（推荐）或超纯水 于4℃或-20 ℃（推荐）冰箱保存、避免反复冻融，1-2年一般没问题 也可短时保存于100%无水乙醇中（几天） 较长期保存可放置于-70 ℃超低温冰箱，可保存5年以上
11
5. 提取缓冲液对植物总DNA提取的影响与作用
（5）洗涤 去掉部分色素和盐等，通常采用70%酒精和100%无水乙醇
9
4. 基本步骤
（6） DNA纯度和浓度检测 0.8%琼脂糖凝胶电泳或紫外分光光度计检测 琼脂糖凝胶电泳法(常用） DNA样品在紫外线照射下发出的红色荧光强度与DNA的含量成正比 使用标准浓度的DNA样品作对照，可以估计出被测DNA的浓度 紫外分光光度计检测 DNA在260nm处有一个明显的吸收峰估计浓度 在A260 1OD相当于双链DNA浓度50 µg/mL 根据A260/A280比值估计DNA纯度 纯DNA 的A260/A280=1.8±0.1， RNA的比值为2.0左右。 >1.8 可能有RNA未除去 <1.8 可能有酚和蛋白质之类的杂质
防止多酚类物质氧化 聚乙烯吡咯烷酮(PVP) :
减少酚类、醌类及丹宁类物质的影响
14
6. DNA提取过程中杂质去除
酚类杂质
对植物中次生产物酚类物质的去除，普遍是在提取液中加入适量的抗氧化剂 和螯合剂,防止多酚氧化褐变
在提取DNA过程中加入巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇、谷胱甘肽及抗坏 血酸等巯基试剂,抑制氧化反应，避免褐化
在样品液氮研磨及提取缓冲液中加入高分子螯合剂PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 或 PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮) 等能络合多酚和萜类物质离心或氯仿抽提出去,有效的 防止多酚物质氧化成醌类,避免溶液变褐而具有抗氧化作用
在提取液中加入适量的PVP 或PVPP 能提高DNA 的纯度，其用量视杂质的多 少而定(1-6 %)，PVP 同时能有效去除多糖。因此将PVP 和巯基乙醇配合使用并调 整用量,能够有效地防止多酚污染
液氮：组织破碎、裂解细胞 EDTA，Tris/HCl: 缓冲体系使溶液pH不会变化太大，DNA在这一体系中呈稳定 态，EDTA螯合Mg 2+或Mn 2+离子，抑制DNase的活性，防止DNA被DNase降解 异丙醇/酒精：沉淀DNA；DNA溶于水，不溶于酒精，在用乙醇沉淀DNA时常加 入分单子价之的间阳的离同子性电Na荷Cl相或斥N力aC，H而3C易OO于H聚，集N沉a+中淀和DNA分子上的负电荷，减少DNA RNase: 消化RNA。 PVP （polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮): 抗氧化作用，络合酚类物质和萜 类物质, 防止酚类物质氧化而发生褐变, 也可有效的去除多糖和色素，色素是PCR 反应中的强抑制剂，一定要除掉
6. DNA提取过程中杂质去除
多糖类杂质
植物组织中富含多糖, 其许多理化性质与DNA 很相似, 因此很难将它们分开。常 用方法是根据溶解性先沉淀多糖 （1）在氯仿处理后的上清液中，加2 %CTAB 分离缓冲液 （2）在 DNA 未溶出之前，先用一些缓冲液洗去多糖
如100 mmol/LTris-HCl, pH 8.0; 5mm EDTA; 0.35 mol/L Sorbitol (山梨醇)洗几次 （3）提高NaCl 浓度至2.5 mol/L或加 NH4COOH 使终浓度为 10 mmol/L或 0.5 mL DNA 液中加 0.12 5 mL 4 mol/L NaCl 和 0.625 mL 13% PEG 8000（冰浴 1 h）或用 水饱和乙醚，1.2-1.5 mol/L NaCl 溶液将大部分多糖去除, 再用2 倍乙醇沉淀DNA 可大大提高效率 （4）高浓度 KCH3COOH 有利于除去多糖
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6. DNA提取过程中杂质去除
(5) DNA 沉淀重悬于30 %乙醇,4 ℃过夜先沉淀多糖,离心取上清加乙醇至80 %重新沉淀DNA (6) 常温25oC异丙醇过夜沉淀DNA 可减少杂质污染 (7) 在提取缓冲液中1/2体积的氯苯，氯苯与多糖的羟基作用而去除多糖 (8) 如果材料较少或要求较高，则可考虑用柱层析方法，使用对 DNA 具有 特异性吸附的树脂来纯化 DNA 曾有文献提到选用 Wizard Purification Kit， PRC-5 柱 ，Sephacryl S-1000 或 S-500，Qiagen Genomic tip 500/G ，或者 CsCl 梯度离心纯化 DNA (9) 调节取样时期可减少粗提产品中多糖含量，生长幼苗暗室暗化处理，黄化 叶提取DNA可有效地防止多糖污染
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5. 提取缓冲液对植物总DNA提取的影响与作用
表面表面活性剂： 十二烷基磺酸钠(SDS)： 是一种阳离子强表面活性剂, 通常与蛋白酶K和抗氧化剂、 螯合剂一起使用 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) ：是一种在高盐下能与核酸结合形成可溶、稳定的 复合物, 低盐浓度下可沉淀的表面活性剂
酶抑制剂 乙二胺四乙酸 (EDTA)： 可用于抑制金属离子依赖性的酶 (螯合Mg2+ 、Ca2+ ) 的活 性 牛血清白蛋白(BSA) ：可使一些降解酶的表面变性 精胺及其他多胺: 降低核酸酶的影响 氰化物: 降低重金属氧化酶的影响
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6. DNA提取过程中杂质去除
植物色素成分去除
植物色素分布：在植物中广泛存在 种类：脂溶性和水溶性色素两类
脂溶性色素多为四萜类衍生物 不溶于水，难溶于甲醇，易溶于乙醇、乙醚和氯仿等 叶绿素、叶黄素、胡萝卜素、番红花素和辣椒红素等 其中胡萝卜素不溶于乙醇。
水溶性色素：主要为花色甙类，又称花青素，普遍存在于花中 可溶于水与乙醇，不溶于乙醚与氯仿等有机溶剂，色泽随pH改变
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2. 提取DNA应满足的基本原则
不同的研究对DNA的要求不一致，但一般应满足: (1) 排除蛋白、糖类和脂类等物质的污染，DNA纯度应满足下游操作需要 用于RFLP、AFLP应满足酶切要求 用于PCR的不含PCR的干扰甚至抑制物 (2) 所得DNA应当完整 电泳检测得到清晰、完整、可重复、无降解的条带 保证DNA一级结构的完整 (3) 足够量的DNA 有的实验要求量多（标记）
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7. DNA提取过程中各试剂的主要作用
β巯基乙醇和抗坏血酸钠：抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变， 使酚类物质容易从基因组DNA去除 蛋白酶K:是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，切割脂族和芳香族氨基酸 的羧基端肽键，用于生物样品中蛋白质的一般降解。将蛋白质降解成小肽 或氨基酸，使DNA分子分离出来 NaCl: 提供一个高盐环境, 使DNA充分溶解于液相中 异戊醇：（1）在抽提DNA时，为了混合均匀，必须振荡混匀数次，这时在 混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低 分子表面张力，减少泡沫产生。一般采用氯仿：异戊酵=24：1或酚：氯仿： 异戊醇=25: 24: 1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与 异戊醇即成） （2） 同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及 下层有机溶剂相维持稳定
现代分子生物学的发展导致DNA 分离技术层出不穷, DNA 已经可以 从诸如化石、标本、木乃伊等极端材料中分离出来, 也可以从痕量材料获 得DNA
无论什么材料, 针对不同来源和特点, 调整设计相应的提取缓冲液及 不同的技术方案是十分重要和必需的
在实际应用中可针对不同情况对具体实验方案的各个部分进行不同 组合。缓冲液的成分应根据分离对象的不同而变化，缓冲液的pH值、保 护剂和表面活性剂都要根据不同样品进行优化
植物分子生物学实验技术
颜泽洪
1
主要内容
第一部分 核酸的分离制备 第二部分 PCR技术 第三部分 主要分子标记 第四部分 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ因克隆
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参考书目：
（美）Dveksler GS and Dieffenbach CW. 黄培堂 俞炜源 陈添弥等译 现代生物技术译从 PCR技术实验指南 科学出版社
（英） Clark MS 主编 顾红雅 瞿礼佳 主译 植物分子生物学实验手册 高等教育出版社 施普林格出版社 郑成木 主编 植物分子标记原理与方法 湖南科学技术出版社 Brown TA. 魏群等译 国外优秀生命科学教材译从 基因克隆和DNA分析 高等教育出版社
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4. 基本步骤
（2）组织（细胞）破碎 物理方法 溶涨和自溶; 化学方法 生物酶降解 液氮快速冷冻处理后研磨（推荐）或在提取缓冲液中研磨（不推荐）
（3）释放DNA 释放DNA到CTAB或SDS类去污剂中、65oC保温处理
（4）纯化和浓缩：去除残渣、沉淀DNA 释放出的DNA中含有大量的RNA、蛋白质、多糖、丹宁和色素等杂质 需用氯仿、苯酚处理后变性、沉淀除去，RNA可用RNase除去。 通常采用4oC离心的方法，产生分层，去掉植物残渣、留上清液部分 沉淀通常采用异丙醇（1 volume)、酒精（2 volume) 等
可以采用非可溶性PVP（polyvinylpyrrolidone）研磨样品， PVP能络合多酚类物 质，不但能较彻底防止氧化作用，而且能有效的去除多糖和色素
在DNA浓缩之前，再用CTAB处理1-2次；或采用乙醇等有机溶剂洗涤 加入抗氧化剂，防止酚类物质褐化
18
7. DNA提取过程中各试剂的主要作用
7
4. 基本步骤
（1）植物材料的采集及前处理 尽可能使组织材料保持水分而保鲜（用湿纱布包裹,放置于密闭的冰盒等） 野外远距离采集样本时，尽可能采用冷冻保存(如放置于液氮中) 不具备冷冻条件时 无水CaSO4 的瓶子分别保存使其迅速干燥，可将材料 保存数月，返回后尽快提取DNA 对具有大量次生代谢物(如丹宁、酚类、醌类等) 的植物材料,尽可能采集幼嫩组织， 冷冻保存、短时间内提取DNA 植物组织化学保存法 乙醇、丙二醇处理法 导致DNA剧烈降解（不推荐） 样品长期保存 液氮处理后贮存在- 80℃冰箱或直接储放于液氮中 在与提取缓冲液接触前防止冰冻样品在空气中融化导致酚类易被氧化 实验室发苗、田间取叶片（清洗去除灰尘、泥土以及菌孢子等） 饥饿处理减少淀粉含量、遮光处理产生黄化苗
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4. 基本步骤
（7）DNA保存备用 通常用pH 8.0的TE（Tris-EDTA）缓冲液（推荐）或超纯水 于4℃或-20 ℃（推荐）冰箱保存、避免反复冻融，1-2年一般没问题 也可短时保存于100%无水乙醇中（几天） 较长期保存可放置于-70 ℃超低温冰箱，可保存5年以上
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5. 提取缓冲液对植物总DNA提取的影响与作用
（5）洗涤 去掉部分色素和盐等，通常采用70%酒精和100%无水乙醇
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4. 基本步骤
（6） DNA纯度和浓度检测 0.8%琼脂糖凝胶电泳或紫外分光光度计检测 琼脂糖凝胶电泳法(常用） DNA样品在紫外线照射下发出的红色荧光强度与DNA的含量成正比 使用标准浓度的DNA样品作对照，可以估计出被测DNA的浓度 紫外分光光度计检测 DNA在260nm处有一个明显的吸收峰估计浓度 在A260 1OD相当于双链DNA浓度50 µg/mL 根据A260/A280比值估计DNA纯度 纯DNA 的A260/A280=1.8±0.1， RNA的比值为2.0左右。 >1.8 可能有RNA未除去 <1.8 可能有酚和蛋白质之类的杂质
防止多酚类物质氧化 聚乙烯吡咯烷酮(PVP) :
减少酚类、醌类及丹宁类物质的影响
14
6. DNA提取过程中杂质去除
酚类杂质
对植物中次生产物酚类物质的去除，普遍是在提取液中加入适量的抗氧化剂 和螯合剂,防止多酚氧化褐变
在提取DNA过程中加入巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇、谷胱甘肽及抗坏 血酸等巯基试剂,抑制氧化反应，避免褐化
在样品液氮研磨及提取缓冲液中加入高分子螯合剂PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 或 PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮) 等能络合多酚和萜类物质离心或氯仿抽提出去,有效的 防止多酚物质氧化成醌类,避免溶液变褐而具有抗氧化作用
在提取液中加入适量的PVP 或PVPP 能提高DNA 的纯度，其用量视杂质的多 少而定(1-6 %)，PVP 同时能有效去除多糖。因此将PVP 和巯基乙醇配合使用并调 整用量,能够有效地防止多酚污染
液氮：组织破碎、裂解细胞 EDTA，Tris/HCl: 缓冲体系使溶液pH不会变化太大，DNA在这一体系中呈稳定 态，EDTA螯合Mg 2+或Mn 2+离子，抑制DNase的活性，防止DNA被DNase降解 异丙醇/酒精：沉淀DNA；DNA溶于水，不溶于酒精，在用乙醇沉淀DNA时常加 入分单子价之的间阳的离同子性电Na荷Cl相或斥N力aC，H而3C易OO于H聚，集N沉a+中淀和DNA分子上的负电荷，减少DNA RNase: 消化RNA。 PVP （polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮): 抗氧化作用，络合酚类物质和萜 类物质, 防止酚类物质氧化而发生褐变, 也可有效的去除多糖和色素，色素是PCR 反应中的强抑制剂，一定要除掉