核酸的分离提取及定量
核酸的提取与鉴定实验报告
核酸的提取与鉴定实验报告一、实验目的1、掌握从生物样本中提取核酸（DNA 或 RNA）的基本原理和方法。
2、学习使用各种试剂和仪器进行核酸提取的操作步骤。
3、了解核酸鉴定的常用方法及其原理。
4、培养实验操作技能和科学研究的严谨态度。
二、实验原理核酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），是生物体遗传信息的携带者。
核酸提取的基本原理是利用细胞裂解液将细胞破碎，使核酸释放出来，然后通过一系列的物理和化学方法将核酸与其他细胞成分分离，最后得到纯度较高的核酸样品。
DNA 提取常用的方法有酚氯仿抽提法、盐析法等。
酚氯仿抽提法是利用酚和氯仿的混合液去除蛋白质，然后通过乙醇沉淀得到 DNA。
盐析法是利用高浓度的盐使蛋白质变性沉淀，从而分离出 DNA。
RNA 提取常用的方法有异硫氰酸胍法、Trizol 法等。
Trizol 法是基于异硫氰酸胍和酚的作用，能够有效地裂解细胞并抑制 RNA 酶的活性，从而提取出完整的 RNA。
核酸鉴定的方法主要有紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法等。
紫外分光光度法通过测定核酸在 260nm 和 280nm 处的吸光度值（A260 和 A280）来评估核酸的纯度和浓度。
A260/A280 的比值在 18 20 之间表示 DNA 纯度较高，在 19 21 之间表示 RNA 纯度较高。
琼脂糖凝胶电泳法则是根据核酸分子在电场中的迁移率不同来分离和鉴定核酸，DNA 分子在琼脂糖凝胶中迁移距离与分子量大小成反比，RNA 通常会呈现出 28S、18S 和 5S 三条带。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的动物组织（如肝脏、肌肉等）或培养的细胞。
大肠杆菌菌液。
2、实验试剂细胞裂解液（含蛋白酶 K）。
酚氯仿混合液（酚：氯仿＝ 1:1）。
无水乙醇、75%乙醇。
3M 醋酸钠（pH 52）。
Trizol 试剂。
异丙醇。
RNA 酶抑制剂。
琼脂糖。
50×TAE 电泳缓冲液。
核酸染料（如 EB 或 GelRed）。
第十一章 核酸提取与鉴定
Trizol一步法提取总RNA：
附：Trizol法步骤
1）实验前取冰，4℃离心机预冷，DEPC处理水（高压灭菌 处理）配制的75%乙醇4℃预冷； 2）1ml Trizol匀浆好的样品； 3）加入0.2ml氯仿，颠倒混匀（15秒）——“慢”，氯仿使蛋
白变性
4）室温，静置3分钟； 5）离心机4℃、14000转/分，离心15分钟；静置1分钟（分
（2）体液标本
浆膜腔积液、脑脊液、尿液、关节积液等； 按水样标本方式离心，取沉淀用于核酸提取。
（二）提取用具预处理
1. DNA提取用具的处理
要求无菌；试剂、器材高压干燥等进行无DNase处理。
2. RNA提取用具的处理
要求无菌，防止二次污染。 RNA易被RNase水解，RNase无处不在且耐高温， 提取条件要求严格。
条件用-20℃、1小时，目的为了更好分层）
9）离心机4℃、14000转/分，离心10分钟 10）弃上液（移液器调至1ml，分两步快速轻轻吸弃上清：第1步，
沿液面吸弃约0.9ml上清；第2步，沿液面吸弃其余上清;注意吸头不要接 触到沉淀斑区）
11)沿试管内壁轻轻加入1ml 4℃预冷的75%乙醇,注意切勿 冲击到沉淀斑区 12）离心机4℃、10000转/分，离心5分钟 13）弃上液（用枪把里面的乙醇吸去，留极少许即可，以防干燥过 程中把RNA烤干），60℃恒温箱干燥5分钟（注意：打开管盖；或用
• 所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA 提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药 匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。
• 严格来说，所有溶液均应用0.1％DEPC于37℃ 处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高 压灭菌15分钟，去除残余DEPC。
核酸2
2. 碱水解：
RNA可被碱水解为核苷酸。
DNA对碱具有一定抗性。
RNA的磷酸酯键对碱敏感 室温，0.3-1mol/L KOH，18-24h，可将RNA完
全水解，得到2’-ysis of RNA under alkaline conditions.
3. 酶水解：
定义：
高温、酸、碱及某些变性剂（如尿素等）能破
坏核酸中的氢键，使有规律的双螺旋结构变成单
链的、无规律的线团，此作用称DNA的变性。
•变性不涉及共价键的断裂。 •变性后，核酸紫外吸收值增加，粘度、比旋下降，生物
活性部分或全部丧失。
Stages in the reversible denaturation and renaturation of DNA.
• 核酸酶（nuclease）（特异性地水解核酸）
根据作用方式
核酸内切酶 核酸外切酶
核糖核酸酶 如：牛胰核糖核酸酶（ RNaseⅠ）
根据底物 核糖核酸酶T1
脱氧核糖核酸酶 如：牛胰脱氧核糖核酸酶（DNaseⅠ）
牛脾脱氧核糖核酸酶（DNase Ⅱ） 限制性核酸内切酶
An example of nuclease specificity: The specificity of RNA hydrolysis by bovine pancreatic Rnase （RNaseⅠ）.
（670nm比色）
（2）二苯胺法定性、定量鉴定DNA: 加热 D-2-脱氧核糖 + 酸 + 二苯胺 冰醋酸，少量浓硫酸
蓝色物质
（595nm比色）
（3）核酸的溴化乙锭（EB）染色： EB是一种荧光染料，可插入核酸相邻碱基对之间。在紫
外灯下，结合EB的核酸呈橙红色荧光。
核酸的纯化主要方法
分离纯化核酸时的注意事项：防止物理因素的降解：1.尽量简化操作步骤，缩短提取时间，以减少变性机会。
2.防止热变性，避免高温。
一般0-4℃。
3.防止机械剪切作用动作轻缓；搅拌温和；加山梨醇等增加渗透压。
防止化学因素的降解：1.避免强酸强碱作用，抽提液pH要保持在4-10之间。
2.保持提取液一定的离子强度，以调节核酸的溶解度和保持二级结构的稳定性。
防止核酸酶的降解防止DNA酶的降解：通常加入酶的抑制剂、蛋白质的变性剂和去垢剂来实现。
1.加入金属离子螯合剂抑制DNA酶2.去垢剂及某些RNase抑制剂，对DNA酶也有一定抑制作用。
防止RNA酶的降解：RNase很难抑制，且无处不在，汗液、唾液中均有。
很耐热，80℃处理15分钟不能灭活。
操作注意事项：1.带一次性手套、口罩；2.器皿试剂高压灭菌或用DEPC（乙二基焦炭酸）处理。
但含有Tris的试剂不宜用，因DEPC可与胺类迅速发生化学反应。
3.尽早除去蛋白质（含RNase）,并加抑制剂。
常用的抑制RNase活性的方法有：1.核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin,人胎盘中分离的一种蛋白）优点：效果好，不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。
使用注意事项：（1）置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DDT）的50%甘油中，-20℃储存。
（2）最大活性的发挥要求有巯基试剂。
（3）冻融数次后应弃之不用。
（4）在变性裂解哺乳动物细胞提取RNA的初始步骤中不宜使用，在其后RNA纯化步骤中应用。
用酚抽提可除去蛋白质抑制剂，故纯化过程中应补加。
2．糖核苷复合物（vanadyl-ribinucleaside complex）由氧钒（IV）离子和4种核糖中的任意一种形成的复合物，是一种过渡态类似物，它能与多种RNase结合并几乎能百分百地抑制RNA酶的活性。
缺点：强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译。
可用0.1%羟基喹啉的苯酚（用0.01mol/L E(pH>7.8)平衡）多次抽提除去。
核酸的性质与研究方法
核酸的理化性质
核酸的分离纯化、 测定及研究方法
ห้องสมุดไป่ตู้酸的理化性质
核酸的性质是由其结构决定的。核酸的结构 特点是分子大,有一些可解离的基团,具有共轭 双键等.这些特点决定了核酸及其组分核苷酸性 质的基础.下面介绍几种重要的性质:
一、物理性质
1、性状：RNA及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色 的粉末或结晶；DNA则为疏松的石棉一样的纤维状固体。
核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此， 核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸 性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNA的pI约 为4～5，RNA的pI约为2.0～2.5，在pH7～8电泳时 泳向正极。
四、UV吸收 ：核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱，因而具有紫 外吸收的的性质，在260nm处核酸紫外吸收最强。核酸的紫外 吸收是核酸定量测定的基础。
指经加热变性的DNA在适当条件下，二条互补链全部 或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种 逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过 程称之为退火(annealing)。这一术语也用以描述杂交核 酸分子的形成(见后)。
DNA的复性不仅受温度影响，还受DNA自身特性等其它因 素的影响：
杂交可以发生于DNA与DNA之间，也可以发生于RNA 与RNA之间和DNA与RNA之间。
实验七 核酸的定量
成分测定
取200mg提取的核酸，加入3mol/L硫酸10ml，在沸 水浴中加热10min制成分解液并进行组分的鉴定。
1、嘌呤碱 取水解液1ml加入过量浓氨水，然后加 入约1ml 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的 银化合物沉淀。
2、核糖 取一支试管加入水解液1ml、三氯化铁浓 盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。放沸水浴中 10min。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。
二、器材与试剂
1、试剂的配制 钼酸铵-过氯酸沉淀剂[0.25%钼酸按-2.5%过
氯酸溶液]：取3.6ml 70%过氯酸和0.25g钼酸 铵溶于96.4ml蒸馏水中。 样品DNA 2、器材 容量瓶（50ml）、离心管、离心机、紫外分 光光度计。
三、操作步骤
取两支1.0ml小离心管，甲管加入0.5ml样品 和 0.5ml 蒸 馏 水 ； 乙 管 加 入 0.5ml 样 品 和 0.5ml钼酸铵-过氯酸沉淀剂，摇匀，在冰浴 中放置15min，以3000r/min离心10min，分 别取上清液0.75ml在量筒中定容到25ml，备 用。
干扰因素
蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能 吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在 280nm波长处，在260nm处的消光值仅为核 酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质 含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。 RNA的260nm与280nm消光值的比值在2.0以 上；DNA的260nm与280nm消光值的比值则 在1.8左右。当样品中蛋白质含量较高时比 值即下降。
2、二苯胺试剂为什么要溶于浓醋酸? 3、请分析自己的DNA样品。
三、操作 1、提取 称取干酵母粉2g于50mL三角瓶内。加
10% NaCl溶液10mL，搅拌均匀，然后于沸水浴 中提取半小时。 2.分离 将上述提取液取出，用自来水冷却，分装 在离心管内，以3500r/min离心10min，使提取 液与菌体残渣等分离。 3.沉淀RNA 将离心得到的上清液倾于50mL烧杯 内，并置于有冰块的250mL烧杯中冷却。待溶液冷 至10℃以下时，在搅拌下小心地加入等体积的酸性 乙醇，随着酸性乙醇的加入，溶液的逐步下降，溶液 中白色沉淀也逐渐增加，当 pH=2.5（RNA 等电 点）时沉淀量最多（注意严格控制pH值），继续于 冰浴中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。
核酸提取方法
核酸提取方法核酸提取是分子生物学实验中的重要步骤，它是从生物样本中提取出核酸（DNA或RNA）的过程。
核酸提取的质量和纯度对后续实验结果具有重要影响，因此选择合适的核酸提取方法至关重要。
本文将介绍几种常用的核酸提取方法，帮助您选择适合您实验需求的方法。
1.酚氯仿提取法。
酚氯仿提取法是最常用的核酸提取方法之一。
它适用于从细胞或组织样本中提取核酸。
该方法的原理是利用酚和氯仿的不同密度，将细胞或组织中的蛋白质和脂质沉淀到有机相中，从而分离出核酸。
酚氯仿提取法简单、快速，适用于大批量样本的提取。
2.硅胶柱法。
硅胶柱法是一种基于硅胶膜的离心柱层析技术，适用于从血液、组织、细胞培养物等样本中提取核酸。
该方法通过硅胶膜的亲和作用，使DNA或RNA能够在柱子中特异性地吸附，然后经过洗脱步骤将核酸从硅胶柱中纯化出来。
硅胶柱法提取的核酸纯度高，适用于需要高纯度核酸的实验。
3.磁珠法。
磁珠法是利用磁珠与核酸的亲和作用，将核酸特异性地吸附到磁珠表面，然后利用外加磁场将磁珠与其他杂质分离。
该方法操作简便，无需离心步骤，适用于高通量核酸提取。
磁珠法提取的核酸质量好，适用于高灵敏度的实验。
4.酶解法。
酶解法是利用蛋白酶和蛋白酶K等酶类将蛋白质降解，从而释放出核酸。
该方法操作简单，适用于从血液、组织等样本中提取核酸。
酶解法提取的核酸适用于一些特殊实验，如PCR、RT-PCR等。
5.离心法。
离心法是利用超速离心将细胞或组织破碎，然后通过差速离心将核酸从其他细胞成分中分离出来。
该方法操作简单，适用于从大量样本中提取核酸。
离心法提取的核酸适用于一些基础实验。
总结。
选择合适的核酸提取方法需要根据实验样本的来源、实验需求以及实验室条件等因素综合考虑。
在实际操作中，可以根据不同实验目的选择不同的核酸提取方法，以确保提取的核酸质量和纯度满足实验要求。
希望本文介绍的核酸提取方法能够为您的实验工作提供帮助。
核酸分离鉴定_实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握核酸分离与鉴定的原理和方法。
2. 了解核酸的组成和结构。
3. 学会使用实验仪器和试剂，进行核酸的分离与鉴定。
二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，包括DNA和RNA。
DNA主要存在于细胞核中，负责遗传信息的存储和传递；RNA主要存在于细胞质中，参与蛋白质的合成和调控。
核酸的分离与鉴定是分子生物学研究的基础。
核酸分离与鉴定主要包括以下步骤：1. 核酸提取：利用细胞破碎技术，将细胞内的核酸释放出来。
2. 核酸纯化：去除杂质，得到纯净的核酸。
3. 核酸鉴定：通过物理、化学或生物学方法，鉴定核酸的种类和结构。
本实验以酵母细胞为实验材料，采用碱法提取RNA，并通过紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：酵母细胞2. 试剂：0.04mol/L NaOH溶液、酸性乙醇溶液、琼脂糖凝胶、缓冲液、核酸染料、DNA/RNA Marker等四、实验步骤1. 核酸提取（1）称取1g干酵母细胞，加入2ml 0.04mol/L NaOH溶液，研磨至匀浆状。
（2）加入4ml 0.04mol/L NaOH溶液，混匀，转移至离心管中。
（3）沸水浴加热30min，冷却后离心（2000r/min，15min）。
（4）取上清液，加入等体积的酸性乙醇溶液，混匀，静置2h。
（5）离心（2000r/min，15min），弃去上清液。
（6）加入70%乙醇洗涤沉淀，离心（2000r/min，15min），弃去上清液。
2. 核酸鉴定（1）紫外分光光度法：取适量RNA溶液，在260nm和280nm波长下测定吸光度值，计算RNA浓度。
（2）琼脂糖凝胶电泳：将提取的RNA与DNA/RNA Marker混合，加样至琼脂糖凝胶孔中，电泳（100V，30min）。
观察电泳结果，判断RNA的纯度和完整性。
五、实验结果与分析1. 紫外分光光度法测定结果显示，RNA浓度为0.5mg/ml。
2. 琼脂糖凝胶电泳结果显示，RNA条带清晰，无杂质带，表明RNA纯度和完整性良好。
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核酸的性质
1. DNA、RNA 的理化性质特点：
① 核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团 （氨基），因而核酸具有两性性质，是 两性电解质。
② 由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性 （氨基）是一个弱碱，所以 核酸通常表现为酸性 ，等电 点比较低。如 DNA的等电点为 pI 4-4.5 ，RNA 的等电点为 pI 2-2.5 。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
分离纯化核酸的原则
1. 应保证核酸一级结构的完整性
完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求
① 减少化学因素对核酸的降解：
a. 温度不要过高； b. 控制pH 值范围(pH 值5-9); c. 保持一定离子强度;
② 减少物理因素对核酸的降解：
避免机械剪切力破坏核酸结构
DNA酶需要金属二价离子 Mg2+、Ca 2+的激活，因此使用 金属二价离子螯合剂 EDTA ，可抑制DNA酶活性。
③ 氯仿异戊醇抽提：
氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相分层； 异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡。
核酸分离纯化中各试剂的作用
④ 乙醇沉淀法：
DNA 溶液是 DNA 以水合状态稳定存在，当加入乙醇时， 乙醇会夺去 DNA周围的水分子， 使DNA失水而易于聚合 。用 无水乙醇沉淀 DNA，这是实验中最常用的沉淀 DNA的方法。 乙醇与核酸不会起任何化学反应，对 DNA很安全，因此是理 想的沉淀剂。
核酸分离纯化中各试剂的作用
2. RNA 分离纯化：
① 0.5 mol/L 醋酸-醋酸钠溶液 使混合物中 DNA沉淀 2 mol/L 醋酸醋酸钠溶液 提供一定盐离子促进 RNA 沉淀
② SDS：阴离于型表面活性剂 使蛋白质变性，有破胞和抑制核酸酶的作用；
③ 苯酚抽提法： 苯酚是极强烈的 蛋白质变性剂 ，它几乎使所有遇到的蛋 白质都变性。能增加去除蛋白的效果，并 对核酸酶有抑 制作用 。
收集上层水液于量筒中，测水液的体积，加入1/10 体积的2 mol/L 醋酸 钠溶液，混匀。再加2.倍体积预冷的无水乙醇，混匀，冷处放置至絮
状沉淀充分形成（絮状沉淀即为RNA）
核酸分离纯化中各试剂的作用
1. DNA分离纯化 ① DNP在2 mol/L NaCl 中易溶解
DNP在0.14 mol/L NaCl 中不溶 RNP 在0.14 mol/L NaCl 中易溶解 ② EDTA ：DNA酶抑制剂
DNA分离纯化实验步骤
剪碎组织 放入匀浆器加入0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA 液7 mL
匀浆，离心 5000 r/min ，5 min
弃上清。沉淀中加入0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA 液6 mL混匀。 5000 r/min 离心5 min
③ DNA为白色纤维状固体， RNA 为白色粉末状固体。 ④ DNA和RNA 都是极性化合物，因此他们 一般都微溶于水，
而不溶于乙醇，乙醚，氯仿等有机溶剂 。
核酸的性质
2. 核酸的存在方式：
DNA和RNA 在细胞中通常以与蛋白质结合的状态存在。他 们与蛋白质结合形成的复合物分别称为 DNP （脱氧核糖核蛋白） 和RNP （核糖核蛋白）。
沉淀中加入3 mL 0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA , 转入匀浆器匀浆， 在搅拌下缓缓滴入250 g/L SDS 0.4 mL
匀浆，使沉淀悬浮均匀 再加入2 mol/L NaCl 4 mL （此时由于大分子脱氧核糖核蛋白的溶 出，溶液粘度骤然升高，再匀浆，使之均匀）
加氯仿-异丙醇 5 mL，剧烈振摇10min 。混合物离心 3000 r/min 离心10 min 上层水液，下层氯仿，交界面为变性蛋白。
分离纯化酸的原则
③防止核酸的生物降解：
a. 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键， 破坏核酸一级结构。 b. 进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马 上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。 c.所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶 抑制剂。
分离纯化核酸的原则
可用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远 远比95％乙醇昂贵）但是加 95％的乙醇使总体积增大，而 DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而 DNA损失也增大，尤 其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次 沉淀 DNA 时可用 95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要 使用无水乙醇。
核酸纯化原理
? DNA分离纯化原理 ：
脱氧核糖核蛋白（ DNP ）在0.14 mol/L NaCl 中溶解度很 低，而核糖核蛋白（ RNP ）却较易溶解，因此用上述浓度的 NaCl 洗涤组织匀浆，可得到 DNP ，再用氯仿 -异戊醇除蛋白即 可得到 DNA 。
? RNA 分离纯化原理：
组织匀浆在酚与十二烷基硫酸钠 (SDS)存在下， RNA 与蛋 白质分离。酚使蛋白质变性凝固， RNA 则溶解在水相中，用乙 醇使RNA 从水相中沉淀而达到分离。
动物组织中核酸的提取
实验目的及意义
?能够说出组织DNA分离提纯的原理及方 法并能够抽提制备DNA
?能够说出组织RNA分离提纯的原理及方 法并能够抽提制备RNA。
前言
核酸（nucleic acid ）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需 要对核酸进行分离和纯化。
收集上层水液边摇变加入等体积95% 乙醇，即可见有长纤维状DNA析出
RNA分离纯化实验步骤
加入3 mL 0.05 mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液, 250 g/L SDS 0.5 mL ，匀浆
再加入等体积 80% 酚（约4mL ），匀浆
移入三角烧瓶中，65℃水浴中继续振摇5-8min ， 取出流水冷却 5000 r/min 离心10 -15min 上层为稍浑浊含有RNA的水相， 中层为变性蛋白质，下层为酚 液，管底残渣含有DNA。
④ 乙醇沉淀法： 原理同DNA沉淀。