核酸提取原理及的方法

——重新70%乙醇漂洗
http://www.yrbio.com
基因组DNA提取常见问题分析
DNA降解

基因组DNA提取——CTAB法
2011年7月
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六 烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解 细胞膜，并与核酸形成复合物。
该复合物在高盐溶液中（>0.7 mol/L NaCl）是可溶的， 通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后 加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
离心洗涤
液氮研磨
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
核酸沉淀
DNA溶液
http://www.yrbio.com
基因组DNA提取——SDS法
2011年7月
SDS法原理
SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞， 使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的 DNA 用酚 / 氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。 注：SDS法适用于大部分实验材料基因组DNA提取。如动物组织、 细胞、全血、细菌、酵母等。
四．真核细胞总RNA提取
五．琼脂糖凝胶电泳
http://www.yrbio.com
核酸简介
2011年7月
核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3′，5′- 磷酸
二酯键连接而成的一类生物大分子。包括核糖
核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两类。
DNA主要储存遗传信息。
RNA主要传递遗传信息。
http://www.yrbio.com
核酸提取原理及方法
赢润生物 曾林
WWW.YRBIO.COM
前言
2011年7月
核酸是遗传信息的载体，是最重要的 生物信息分子，是分子生物学研究的主要 对象，因此，核酸的提取是分子生物学实 验技术中最重要、最基本的操作 。
http://www.yrbio.com
主要内容
2011年7月
一．核酸简介 二．基因组DNA提取 三．质粒DNA提取
http://www.yrbio.com
基因组DNA提取——CTAB法
2Leabharlann Baidu11年7月

CTAB提取缓冲液的经典配方
组份 终浓度 Tris-HCl （pH 8.0） 100 mM EDTA （pH 8.0） 20 mM NaCl 0.4 M CTAB 2% (W/V) β-巯基乙醇 0.1%（V/V） 使用前加入
EDTA：螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl：提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中。
http://www.yrbio.com
基因组DNA提取——SDS法
2011年7月
SDS法实验流程（以动物组织为例）
动物组织 抽提
离心洗涤
液氮研磨 或匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
http://www.yrbio.com
基因组DNA提取——CTAB法
2011年7月

组份
CTAB提取缓冲液的改进配方
Tris-HCl （pH 8.0） 100 mM EDTA NaCl （pH 8.0） 20 mM 0.4 M CTAB PVP40 β-巯基乙醇 2%（V/V）使 用前加入
终浓度
酒精沉淀
DNA溶液
http://www.yrbio.com
基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测
2011年7月
琼脂糖凝胶电泳：
以琼脂糖凝胶作为
支持物，利用DNA分子
在泳动时的电荷效应和 分子筛效应，达到分离 混合物的目的。 小鼠gDNA电泳图
http://www.yrbio.com
基因组DNA提取常见问题
http://www.yrbio.com
基因组DNA提取——SDS法
2011年7月

SDS提取缓冲液的配方
组份 终浓度 Tris-HCl （pH 8.0） 50 mM EDTA （pH 8.0 ） 20 mM NaCl 0.4 M SDS 2%
Tris-HCl（pH8.0）：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
http://www.yrbio.com
2011年7月
一．核酸简介
二．基因组DNA提取 三．质粒DNA提取 四．真核细胞总RNA提取
http://www.yrbio.com
基因组DNA提取方法
2011年7月
基因组DNA提取的几种常用方法： CTAB法
SDS法 其他方法
http://www.yrbio.com
3% (W/V)
5% (W/V)
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形
成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中
酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
http://www.yrbio.com
基因组DNA提取——CTAB法
2011年7月
CTAB法实验流程
植物材料 抽提
Tris-HCl （pH 8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。
2011年7月
DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应 DNA降解 DNA量少
http://www.yrbio.com
基因组DNA提取常见问题分析
2011年7月
DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应
DNA中含有蛋白、多糖、多酚类物质 ——抽提纯化、高盐洗涤 DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 ——重新沉淀 DNA中残留有金属离子
核酸简介
2011年7月
如何分离DNA？
如何分离RNA？
http://www.yrbio.com
核酸简介——质粒DNA
2011年7月
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小 从1-200 kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋 状态存在于宿主细胞中。 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中，它具 有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝 数，并表达所携带的遗传信息。