酶的分离纯化.
酶的分离纯化方法介绍
酶的分离纯化方法介绍酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。
关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。
这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。
这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
酶的来源多为生物细胞。
生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
酶的分离纯化
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五、抗体酶
五、抗体酶 （abzyme） ） 抗体酶本质上是免疫球蛋白， 抗体酶本质上是免疫球蛋白，但在易变区被赋予了 免疫球蛋白 酶的属性，所以又称“催化性抗体” 酶的属性，所以又称“催化性抗体”（catalytic antibody）。 ）。 抗原： 抗原：
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二、调节酶
• 调节酶是对代谢调节起特殊作用的酶类。 调节酶是对代谢调节起特殊作用的酶类。 • 调节酶分子中有活性区和调节区，其催化活力 调节酶分子中有活性区 调节区， 活性区和
可因与调节剂的结合而改变， 可因与调节剂的结合而改变，有调节代谢反应 的功能。 的功能。
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三、酶的纯度鉴定
酶产品质量评价中常使用比活力， 酶产品质量评价中常使用比活力， 比活力越高，纯度越高。 比活力越高，纯度越高。
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第七节 一些酶的名称及概念介绍
寡聚酶( ) 一 寡聚酶(oligoenzyme)
酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地 酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地 非催化部位 非共价键结合后引起酶分子构象的改变， 非共价键结合后引起酶分子构象的改变， 进而改变酶的活性状态， 进而改变酶的活性状态，这种现象称为别 构调节作用。 构调节作用。
别构激活作用 别构抑制作用
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三、同工酶
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酶的分离纯化
二、酶纯化过程的三个阶段
粗蛋白(crude 粗蛋白(crude protein)
采样 破细胞 提取全部蛋白，多用盐析沉淀法。
部分纯化(partially 部分纯化(partially purified) 初步的纯化，使用
各种柱层析法。
均质纯化(homogeneous) 均质纯化(homogeneous) 目的酶的进一步精制，
二、抽提
细胞破碎后，可采用两种方式进行抽提：
普遍抽提和先后用不同溶剂进行选择性抽提。
抽提条件的选择：
一般用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液进行抽提。
酶的主要提取方法
提取方法 盐溶液提取 酸溶液提取 碱溶液提取 使用的溶剂或溶液 0.02～0.5mol/L的盐溶 0.02～0.5mol/L的盐溶 液 PH2～ PH2～6的水溶液 PH8～12的水溶液 PH8～12的水溶液 提取对象 用于提取在低浓度盐溶液中溶解度 较大的酶 用于提取在稀酸溶液中溶解度大， 且稳定性较好的酶 用于提取在稀碱溶液中溶解度大且 稳定性较好的酶 用于提取那些与脂质结合牢固或含 有较多非极性基团的酶
饱和度调整
加入固体盐。不增大 溶液体积。 饱和溶液。原溶液体 积不大。 透析平衡法
541× ( S 2 − S1 ) g= 1 − 0.3 × S 2
100 × (S2 − S )1 v= 1 − S2
4) 影响盐析的因素
(1)pH
接近于待纯化酶的等电点。
(2)温度 (2)温度
从酶的稳定性和溶Байду номын сангаас度看，盐析温度一般以控制 在30℃左右为宜。 30℃
1 2 3 4
机 破碎 理破碎 化 酶 破碎 破碎
DY89-I 动 匀 机 细 胞 破 碎 珠
酶的分离纯化讲解
第二节分离纯化步骤及方法
一、步骤
发酵产品
1、酶的提取
固液分离，破碎，抽 提，浓缩
2、初分离
3、 纯化
精制品
4结晶
保藏
酶分离纯化总体步骤
1、酶液的提取
（1）发酵液的固液分离 （2）细胞破碎
（1）发酵液的固液分离
❖ 常用的分离方法有离心和过滤。 ➢ 离心分离速度快，效率高，操作时卫生条件
转筒真空过滤器
II
1 2
4 III
6 7
5
3
a.转动盘
b.固定盘
I
1－转筒；2－滤饼；3－割刀；4－分配头；5－吸走滤液的真空凹槽； 6－吸走洗水的真空凹槽；7－通入压缩空气的凹槽I－过滤区； II－洗涤脱水区；III－卸渣区
（2）细胞破碎
❖ 按微生物细胞酶的分布分为三类 ❖ 细胞破碎是指通过物理、化学或生物的方法，
❖ 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的 方法，通常可先用家用食品加工机将组织打 碎，然后再用10000r/min～20000r/min 的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织 的细胞打碎。
物理破碎
通过各种物理因素 的作用，使组织、 细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
冻结-融化法 压榨法 渗透压法 超声波破碎法
纯度要求 极高纯度（>99%）
高纯度（95%-99%）
一般纯度（<95%）
用途 医疗用途
理化性质研究
生产抗原
2、明确目标蛋白与主要杂质的性质
❖ 检测目标酶蛋白稳定条件，至少检测pH 值和离子强度两个条件。
❖ 了解目标酶和杂质的性质：分子大小、 等电点、溶解度等。
酶的分离纯化及活性测定
第五节酶的分离、纯化及活性测定1一、酶的分离、纯化•:一类由细胞内产生然后分泌到细胞外进行作用胞外酶生然后分到行作的酶，这类酶大多都是水解酶类。
•胞内酶:另一类酶在细胞内合成后在细胞内起催化作用的，这类酶数量较多。
的多2一般原则：般原则：防止强酸、强碱, 要求加入的化学试剂不使酶变性；在低温下操作，全部操作在低温0～4℃；在分离提纯过程中避免剧烈搅拌 在分离提纯过程中，避免剧烈搅拌；在提纯溶剂中加一些保护剂如少量EDTA 在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量β-巯基乙醇；在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈的烈”的手段。
3酶的分离提纯三个基本环节：第一抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；第二纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；第三制剂，即将酶制成各种剂型。
在酶的分离纯化过程中．每步都须做三件事：第一第，测定酶活力(IU/ml)；第二，测定蛋白质含量(mg/ml)；第三，测量体积(ml)。
4基本操作程序微生物、动物、选材植物加入提取液抽提胞内酶先破碎抽提先净化处理再沉淀法分离离子交析分离纯化换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等5（一）酶的抽提（）酶的抽提1、破碎细胞对于细胞外酶可用水缓冲液浸泡过对于细胞外酶可用水、缓冲液浸泡过滤后，可得粗抽提液。
对于细胞内酶要破碎细胞、动物细胞较易破碎，通常用匀浆器捣碎机，制成较易破碎，通常用匀浆器、捣碎机，制成匀浆离心后可得酶抽提液。
细菌细胞壁较厚，需用超声波、溶胞壁较声溶菌酶等抽提。
酶等提62、酶的抽提酶的抽提一般的酶可用稀酸或稀碱的水溶液抽提出来。
抽提条件：提出来抽提条件⑴抽提溶的pH选择应该在酶的pH稳定，并离范围之内，并且最好远离等电点。
低温下抽提⑵低温下抽提（0～40C）7（二）酶的纯化（）酶的纯化抽提液中除含有所需有酶外，还含有其它大抽提液中除含有所需有酶外还含有其它大分子物质。
常用分离纯化的方法：①溶解度②电荷性质③大小或质量④亲和部位。
分离纯化一种酶的方法
分离纯化一种酶的方法分离纯化一种酶是生物工程领域的一个重要研究课题，有多种方法可以用来实现这一目标。
下面将介绍几种常用的分离纯化酶的方法。
1.固定相吸附色谱法固定相吸附色谱法是最常用的酶纯化方法之一。
在这种方法中，通过对酶进行吸附，然后使用缓冲溶液洗脱的方式分离纯化酶。
为了实现这一目标，可以选择一种适合酶吸附的固定相，例如亲和树脂、离子交换树脂或凝胶等。
通过在不同的条件下洗脱，可以逐步去除非目标蛋白质，最终得到纯化的酶。
2.亲和层析法亲和层析法是常用的可以选择性地与酶相互作用的方法。
在亲和层析法中，可以通过与酶相互作用的特定亲和剂将酶从复杂混合物中分离出来。
例如，可以根据酶与金属离子的亲和性，使用金属离子柱进行层析。
亲和层析法通常需要先对亲和剂进行固定，然后通过加载样品和适当的洗脱剂来纯化酶。
3.凝胶过滤法凝胶过滤法是一种基于酶的大小差异来分离纯化的方法。
这是一种较为简单的方法，适用于分离不同分子量的酶。
在凝胶过滤法中，通过将混合物通过一系列的凝胶分离层来分离不同大小的分子。
酶分子会在凝胶中被阻止，而较小的分子可以通过凝胶透析孔隙。
通过控制凝胶的孔隙大小，可以选择性地纯化酶。
4.电泳法电泳法是一种常用的酶分离纯化方法，尤其适用于具有不同电荷的酶。
在电泳法中，通过在电场中施加电压，根据不同酶的迁移速度将酶分离出来。
根据酶的等电点和电荷性质，可以选择凝胶电泳或者等电聚焦电泳来分离纯化酶。
电泳法的一个重要应用是SDS-PAGE，它从凝胶中获得酶的纯化和分析。
5.超滤法超滤法是一种可以根据酶的分子量选择性地分离纯化酶的方法。
在超滤法中，通过将混合物通过一系列合适孔径的滤膜，可以将酶与其他较小分子分离开来。
较大分子（包括酶）会被限制在滤膜上方，而较小分子则可以通过滤膜，从而实现分离纯化酶的目的。
综上所述，分离纯化酶的方法有很多种。
选择适用的方法取决于酶的性质、目标和需求。
常用的方法包括固定相吸附色谱法、亲和层析法、凝胶过滤法、电泳法和超滤法。
酶的分离纯化
超声波破碎法
化学破碎法： 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton、
Tween等表面活性剂
酶促破碎法
自溶法 加酶处理
G+菌：溶菌酶 G-菌：溶菌酶、巯基乙醇等 酵母菌：β-葡聚糖酶和溶菌酶 霉菌：几丁质酶
四、抽提 指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充
分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的提取。
2、按膜孔径或截留物质的大小：
微滤 —— 超滤 —— 纳滤 、电渗析 、透析 —— 反渗透
膜
孔
径大
小
灰尘 细菌
膜
病毒 生物大分子 生物小分子 盐类 水
灰尘 细菌 病毒 生物大分子
生物小分子 盐类 水
微滤（MF）
（0.2-2um）
超滤（UF）
（10-200nm）
灰尘 细菌 病毒 生物大分子 生物小分子
选择性热变性法、选择性酸碱变性法、 选择性表面变性法
亲和层析、亲和电泳
ห้องสมุดไป่ตู้
第三节 酶的沉淀分离
盐析沉淀法√、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法
一、盐析沉淀法 1、原理： 2、硫酸铵盐析的优点
优点：①在水中溶解度大，溶解的温度系数小； ②价廉，便宜； ③可保护酶。
缺点：溶解过程随浓度增加的体积变化是非线性的变化。
(25℃)
当溶液体积不大，要达到的盐浓度不高，可以加 入饱和硫酸铵溶液；当溶液体积较大，要达到的盐 浓度又较高，此时加入固体硫酸铵较好。
4、为了得到较好的盐析效果，应控制下列因素
（1）不同酶，盐析时所需的盐浓度各不相同。实际料液中目 标酶的盐析沉淀操作前，所需的硫酸铵浓度或饱和度可通过实 验确定。
（2）加盐操作时，防止局部盐浓度过高，防止产生泡沫。
酶分离纯化的步骤主要原理
酶分离纯化的步骤主要原理
酶的纯化和分离是通过一系列步骤实现的，其主要原理包括以下几点：
1. 细胞破碎：首先需要将含有酶的细胞破碎，以释放酶分子。
这可以通过物理方法（如超声波或搅拌）或化学方法（如溶解细胞膜）实现。
2. 酶的特异性沉淀：根据酶的特性和条件，选择适当的方法使酶与其他杂质分子分离。
常用的方法包括沉淀、沉降和离心。
例如，可以通过加入特定的沉淀剂或改变pH值来使酶沉淀，从而将其与其他溶液中的物质分离。
3. 过滤和超滤：利用不同孔径的滤膜，可以通过过滤和超滤方法去除较大分子，如蛋白质碎片和细胞残渣。
4. 离子交换层析：离子交换层析是利用酶与离子交换树脂之间的相互作用进行分离的方法。
树脂上的离子可吸附酶，而其他杂质则被洗脱。
5. 亲和层析：亲和层析是通过酶与特定配体之间的亲和力实现分离的方法。
配体可以是酶的底物、抗体或其他具有与酶特异性结合的小分子。
酶与配体结合后，可以用洗脱剂将酶从亲和层析柱上洗脱。
6. 凝胶过滤层析：凝胶过滤层析是根据酶的分子大小和形状实现分离的方法。
通过选择合适孔径的凝胶、调节操作条件，可以将酶与其他分子分开。
7. 高效液相层析：高效液相层析（HPLC）是一种高效的液相分离技术。
通过调节流动相和固定相的性质，利用酶与固定相之间的相互作用进行分离。
8. 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法，通过电泳平台上的电场作用下，根据酶的电荷、形状和大小进行分离。
以上步骤和原理可以根据酶的特性和所需纯度的要求进行组合和调整，以实现酶的有效纯化和分离。
酶的分离 纯化
（2-4）
若酶的总浓度用[E]t表示，那么 [E]= [E]t－[ES]，代入式（2-4）并整理得
（2-5）
由于酶的反应速度与[ES]成正比，所以
V = k3 [ES] 将（2-5）代入（2-6），得
（2-6）
（2-7）
第一节 酶促反应动力学
当底物浓度很高时，所有酶都与底物结合生成中间产物ES，则[E]t=[ES]。此时 反应速度达到最大Vmax，即
整理上式可得 Km= [S] 由此可以看出，Km的物理意义就是当酶反应速度达到最大反应速度的一半时的 底物浓度，其单位与物质摩尔浓度单位相同，用mol/L表示。Km数值大小与酶的浓 度无关，是酶反应的特性常数。不同酶的Km值不同，且同一酶在不同的底物下，其 Km值也不同。米氏常数可由实验测得，也可用下面的公式求得：
Vmax= k3 [ES]= k3[E]t
（2-8）
（2-7）除以（2-8），并整理得
（2-9）
这就是米-曼氏方程（Michaelis-Menten equation），又称为米氏方程，式中的 Km是一常数值，称为米氏常数。在特殊情况下，当v = Vmax时，米氏方程可转化为下 式：
第一节 酶促反应动力学
第三章 酶的分离纯化
酶分离纯化的目的
酶分离纯化的目的是使酶制剂 产品达到应用所需的纯度。
分离纯化过程包括3个基本步骤：
1 抽提 2 纯化 3 制剂
Crude product concentration versus selling price (Dwyer, 1984)
第一节 酶促反应动力学
对许多酶的性质的观察和研究得知，在低的底物浓度[S]下，反应速度（v）直接 与底物浓度[S]成正比；在高底物浓度[S]下，速度趋向于最大值（Vmax），此时反应速 度与底物浓度[S]无关（如图2-1）。
酶的分离纯化
三浓缩 1蒸发 2超过滤 3胶过滤 4反复冻融
三酶的纯化原理与方法
1根据溶解度的不同进行的纯化 A盐析法 B有机溶剂沉淀法 C共沉淀法 D选择性沉淀法
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2按照分子大小进行的纯化
A胶过滤（层析）法 B 超过滤法 C超离心法
三根据电学解离性质进行纯化
酶的分离纯化与制剂
一酶分离纯化工作的基本原则 酶分离纯化工作包括三个基本环节： 1抽提（extraction） 2纯化（purification） 3制剂（preparation）。
抽提是要将酶从原料中抽提出来作 成酶溶液；
纯化则是要将酶和杂质分离开来，或者选 择地将酶从包含杂质的溶液中分离出 来，或者选择地将杂质从酶溶液中移除出 去； 制剂则是要将纯化的酶作成一定形式的制 剂。
为了能够成功地进行酶的分离纯化， 应注意以下问题。
1防止酶变性失效 2选择有效的纯化方法 3酶活性的测定贯穿纯化过程的始终
二酶的抽提
一预处理和破细胞 二抽提 1pH 首先应考虑的是酶的酸碱稳定性，选 择的pH不能超过酶的稳定范围。 2盐 抽提液一般采用等渗盐溶液，最普通的 有0.020~0.050mol/L的磷酸缓冲液， 0.15mol/LNaCl溶液等。 3温度 抽提温度一般控制在0~4℃.
A吸附层析法 B离子交换层析法 C电泳法 D聚焦层析法 E快速液相层析法 F疏水层析法
四利用专一亲和作用进行纯化
1亲和层析法 2亲和电泳法 3融合蛋白亲和分离法 4其他相关的亲和分离法 A金属螯合层析法 B共价层析法
酶的分离纯化
第三章酶的分离纯化第三章酶的分离纯化第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤第二节细胞破碎第三节酶的抽提第四节酶的纯化第五节酶的纯度与产量第六节酶的剂型与保存第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤1926年Summer制备了第一个结晶酶，自此以后，酶分离纯化工作进展很快，现已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净，并根据酶的作用特点，理化性质、发展了各种类型的分离纯化方法、试剂和设备。
一、基本原则二、酶分离纯化的基本步骤为了能成功地进行酶的分离纯化，需注意以下两个基本原则：1. 防止酶变性失效防止酶变性失效是酶分离纯化工作很重要的问题，这一点在纯化后期尤为突出。
一般地，凡是用以预防蛋白质变性的方法与措施，都可考虑用于酶分离纯化工作中。
常见的措施有：（1）低温：除少数例外，所有操作应在低温下进行，有有机溶剂存在时，更应注意。
二、酶分离纯化的步骤酶分离纯化时，一般要经过如下步骤：1. 细胞破碎：除在体液中提取酶或胞外酶，一般都要进行细胞破碎，促使胞内酶溶出，以利于抽提。
2. 抽提3. 纯化下面分节对这三个基本环节加以介绍第二节细胞破碎细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法。
一、机械破碎法二、物理破碎法三、化学破碎法四、酶学破碎法：通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。
1. 机械捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎，转速可高达10000r/min。
常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。
此法在实验宝和生产规模均可采用。
通过温度、压力、声波等各种物理因素作用，使组织细胞破碎的方法，该称为物理破碎法。
物理破碎法包括如下几种方法；1. 温度差破碎法：通过温度的突然变化使细胞破碎。
即将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将在较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。
酶的分离纯化 ppt课件
凝胶电泳
（88.9%）
共六步，总收率仅为16%
staehelin等人：
硫酸铵盐析
免疫亲和层析
阳离子交换层析 仅三步，总收率达81.0%
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
在实践工作中选择方法时:
首先，应对被纯化的酶的理化性质有—个比较全面的了解;
其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以测定酶 活性为标准。
适用于耐热的酶，注意常要加适当的酶保护剂。 （2）加凝聚剂或絮凝剂
（3）调pH值 二、固液分离 方法：（1）离心分离；（2）过滤；（3）双水相萃取
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三、细胞破碎
捣碎法：捣碎机
机械破碎法
研磨法：研钵、细菌磨、石磨、球磨等 匀浆法：匀浆器
物理破碎法
温度差破碎法：冻融交替法 压力差破碎法：高压冲击法、突然降压法、渗透压变化
各国研究的热点。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
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一、膜分离的类型
1、按推动力不同可分为： （1）扩散膜分离：渗透、透析 （2）压力差膜分离：微滤、超滤、纳滤、反渗透 （3）电位差膜分离：电渗析
2、按膜孔径或截留物质的大小：
水
超滤（UF）
（10-200nm）
纳滤（MF） 反渗透滤（RO）
（2-10nm）
（＜2nm）
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各种膜分离法的原理和应用范围
膜分离法 截留的颗粒大小 截留的主要物质 过滤介质 应用举例
微 滤（MF） 0.2~2um
超 滤 （UF） 10nm~200nm 纳滤
酶主要的分离纯化方法
酶主要的分离纯化方法。
1、根据酶分子大小和形状的分离方法。
(1)离心分离。
许多酶往往富集于某一特定的细胞器内，先通过离心得到某一特定的亚细胞成分，然后再对某一特定的酶进行纯化。
包括一般离心、差速离心、密度梯度离心。
(2)凝胶过滤。
酶蛋白分子大小不同，大于凝胶孔径的被凝胶排阻，因而在凝胶颗粒间隙中移动，速度较快；小于凝胶孔径的可自由出人凝胶颗粒的小孔内，路径加长，移动缓慢。
这样通过一定长度的凝胶层析柱后，大小不同的酶蛋白分子就被分开了。
(3)透析与超滤。
通过透析可以除去酶液中的盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。
超滤指在一定压力下，将溶液强制通过一定孔径的滤膜以达到分离纯化的目的。
2、根据酶分子电荷性质的分离方法。
(1)离子交换层析。
根据不同的蛋白质与离子交换剂的亲合力不同而达到分离目的的方法称为离子交换层析。
(2)层析聚焦。
层析聚焦层析聚焦类似于等电聚焦，但其连续的pH梯度是在固相离于交换载体上形成的。
(3)电泳。
在外电场作用下，由于蛋白质离于所带净电荷的大小和性质不同，因而其泳动方向和速率也不同，从而达到分离的目的。
酶的分离纯化
细胞破碎方法及其原理
机械破碎
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
物理破碎 化学破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使 溶液的介电常数降低。例如，20℃时水的介电常数为80，而82％乙 醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子 间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜 的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破 坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等
基本原理
➢ 有机溶剂沉淀主要是降低水溶液的介电常数，减小溶剂的极 性，削弱溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋 白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。
➢ 由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋 白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子 的水膜，因而发生沉淀作用
1、中性盐沉淀
➢ 中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所 以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜， 暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水 胶体，蛋白质分子即形成沉淀。
➢ 优点是：①成本低，不需要特别昂贵的设备。②操 作简单、安全。③对许多生物活性物质具有稳定作 用。
➢ 在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解 度随盐浓度升高而降低，这称为盐析 现象。
③ 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。 有的酶或蛋白质用2～3mol/L的(NH4)2SO4保存可 达数年之久。
酶的分离纯化
酶的分离纯化提取原则a. 相似相溶。
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。
一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。
酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。
b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
酶的提取方法酶的分离方法1沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。
其中以硫酸铵最为常用。
在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。
有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。
主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。
溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等2离心分离离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。
在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。
蛋白质分子在离心時，其分子量、分子密度、组成、形状等，均会影响其沉降速率，沉降係系数即用來描述此沉降性质；其单位为S (Svedberg unit)。
每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。
不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法，在密度梯度中作分離。
3、过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。
过滤的分类及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同)借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。
酶的分离与纯化
● 鹽溶 Salting-in:
加鹽使蛋白質溶入水溶液中
● 鹽析 Salting-out:
加鹽使蛋白質由水溶液中沉澱出來
設計純化步驟時，需考慮下列各項要求
• • • •
a. 高活性 b. 高回收率 c. 高純度 d. 方便與快速
組合純化步驟
• a. 組合標準 • (1) 已知的酵素，可依照已發表的步驟進行， 有問題再作改進。 通常都是以 硫酸銨分劃 - 膠 体過濾 - 離子交換 為骨幹，再加上其它方法， 組成全部流程。 • (2) 對完全未知的酵素，可循此骨幹先試行純 化，看其結果如何再加改進。 • (3) 不要忘記利用該酵素的特殊性質來純化， 如在其 pI 沉澱性、特別的疏水性、有專一的抑 制劑或熱穩定性等。
• 膠体過濾法在操作時，有些內在的問題，會影 響結果的好壞： • (1) 擴散及亂流： 由於是在液相中進行，樣本 在膠柱中的 擴散現象 相當顯著；又因液体在 膠球間流動時，受 重力 及 對流 的影響，會造 成 亂流。 擴散及亂流都會使膠体過濾的解析 力降低甚多。 • (2) 管柱設計不良： 經常是致命的傷害，例如 無效空間 (dead volume) 過大、緩衝液進入膠体 時流動不均、溶離液出口端的管路太長或太粗 等。
近朱者赤、近墨者黑，物以類聚，不 論人類或是分子皆同
色谱的类型
. 常用的層析方法
膠體過濾法
• 膠体過濾 属 partition 層析法，流動相為溶離緩 衝液，固定相為膠体孔隙內的緩衝液。 溶質 (樣本蛋白質) 根據其 分子量 的大小，決定分 佈在這兩相的比例。 分子量大的不易進入膠球， 隨流動相溶離；分子量小的，則易竄入膠球內 的固定相，而被延滯流出膠柱 。 分子的 形狀、 大小 均為影響因素，即與其 分子半徑 (Stokes radius) 有關，與分子量不完全成正比關係；但 一般均視蛋白質為球形，故其形狀較無影響 力。
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酶的分离纯化提取原则a. 相似相溶。
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。
一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。
酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。
b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
酶的提取方法酶的分离方法1沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。
其中以硫酸铵最为常用。
在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。
有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。
主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。
溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等2离心分离离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。
在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。
蛋白质分子在离心時，其分子量、分子密度、组成、形状等，均会影响其沉降速率，沉降係系数即用來描述此沉降性质；其单位为S (Svedberg unit)。
每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。
不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法，在密度梯度中作分離。
3、过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。
过滤的分类及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同)借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。
膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。
有时也可以采用动物膜等。
膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。
膜的孔径有多种规格可供使用时选择。
微滤，推动力是压力差，分离机理为筛分超滤，同上纳滤，同上，分离机理为优先吸附和表面电位反渗透，同上，分离机理为优先吸附和溶解扩散4层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。
利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。
层析法的分类流动相有两种状态：*液体作为流动相*气体作为流动相固定相也有两种状态：*固体吸附剂作为固定相*以吸附在固体上的液体作为固定相▪按两相所处的状态分类：液相层析液-固层析液-液层析气相层析气-固层析气-液层析●按层析过程的机理分类：吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异。
分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的不同。
离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。
凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。
按操作形式不同分类：柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。
纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。
薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定层析分离方法吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。
吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。
吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简单。
吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。
层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。
在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。
●洗脱剂的选择要注意下列各点：●◇洗脱剂不会与吸附剂起化学反应，也不会使吸附剂溶解。
●◇洗脱剂对混合液中的各组分的溶解度大，粘度小，流动性好，容易与被洗脱的组分分离。
●◇洗脱剂要求一定的纯度，以免杂质对分离带来不利影响。
分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。
分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。
在层析条件确定后，层析系数是一常数。
在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。
另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为流动相。
当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。
交换层析（ion exchange chromatography，IEC）1.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。
离子1）离子交换剂：离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。
化学原料合成：树脂类物质载体天然材料制成：cellulose sephadex sepharose阳离子交换剂: 电荷基团（－）, 反离子（＋）电荷基团阴离子交换剂: 电荷基团（＋）, 反离子（－）两种离子交换剂●阴离子交换剂：●常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基●阳离子交换剂：●常用羧甲基CM —CH2COO－●磺丙基SP —C3H6SO3－离子交换剂的选择a. 强、弱离子交换剂的选择：强型：适用的pH范围广，制备无离子水弱型：适用的pH范围窄，分离生物大分子物质b. 阴、阳离子交换剂的选择：酶的稳定性若<pI稳定，蛋白质带正电荷，用阳离子交换剂若>pI稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。
是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。
凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。
较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。
常用的凝胶：葡聚糖凝胶琼脂凝胶与琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。
酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，酶RNA与互补的RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。
故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用.5、电泳分离带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。
电泳方法按其使用的支持体的不同，可以分为：纸电泳薄层电泳薄膜电泳凝胶电泳自由电泳等电聚焦电泳颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。
此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。
6、萃取分离萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。
萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。
有时也可采用其它流体。
按照两相的组成不同，萃取可以分为：有机溶剂萃取双水相萃取超临界萃取反胶束萃取各种双水相系统3.6 酶的浓缩、干燥与结晶浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。
在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。
离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。
用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。
蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。
由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用真空浓缩。
即在一定的真空条件下，使酶液在60℃以下进行浓缩。
纯化方案的设计与评价一、纯化方案的设计●（一）纯化方法的选择依据●根据有效成分和杂质之间理化性质的差异●调节溶解度：沉淀法2. 根据分子大小、形状的不同：离心分离，膜分离，凝胶过滤3. 根据分子电荷性质的不同：离子交换层析，电泳4. 根据专一性结合的方法：亲和层析5. 其它：吸附层析，疏水层析二、纯化方案的评价（一）酶活力测定：酶活力(enzyme activity)又称酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。
其大小可用在一定的条件下，酶催化某一化学反应的反应速率来表示。
一般用单位时间内产物生成的量来表示酶催化的反应速率。
常用的方法：1. 化学分析法（比色法）：产物可与特定的化学试剂反应生成稳定的有色溶液。
2. 分光光度法：利用底物和产物光吸收性质的不同。
3. 量气法：酶促反应中产物或底物之一为气体。
4. 滴定法（pH值测量法）：产物之一是自由的酸性物质或碱性物质。
多用pH电极测。
常用终止反应方法：1）改变反应最适条件：加酸、碱、加热2）加酶变性剂：5％三氯乙酸酶活力单位：通常采用国际酶学委员会规定的单位。
但在纯化过程中，为了方便，可采用自行规定的单位，只要达到可比较的目的即可，如直接以光密度值表示。
常用比活力表示酶制剂的纯度：酶活力（u/ml）比活力＝————————————————蛋白质含量（mg蛋白/ml酶液）（二）蛋白质浓度测定1.紫外吸收法：酪氨酸、色氨酸残基中苯环有共轭双键，在A280有最大吸收。
特点：简便、快速、不损耗样品，但干扰因素多。
2. 双缩脲法：具有两个或两个以上肽键的化合物均有双缩脲反应。
优点：快速缺点：灵敏度差3. 酚试剂（Folin-酚）测定法：繁琐，但灵敏度、准确度高。
4. 染料结合法（考马斯亮蓝染色法（三）提纯倍数与回收率:酶的比活力(纯度)=活力单位数/毫克蛋白比活力越高，酶纯度也越好。
表示酶制剂纯度的一个指标。
纯化倍数=提纯后比活力/提纯前比活力表示提纯过程中纯度提高的倍数。
提纯倍数越大，表示该方法纯化效果越好。
总活力＝酶活力单位数 酶液总体积即样品中全部酶活力。
回收率＝提纯后酶总活力/提纯前酶总活力×100％表示提纯过程中酶损失程度的大小。
回收率越高，损失越小。
判断一个分离纯化方法的优劣，常用总活力的回收率和比活力的提纯倍数两个指标。
回收率：反映酶的损失情况。
提纯倍数：表示方法的有效程度。
一个好的纯化步骤是回收率较高，提纯倍数也较大。
每一步总活性将减少，比活性应明显提高。
酶制剂的保存●(1)温度酶的保存温度一般在0～4℃，但有些酶在低温下反而容易失活，因为在低温下亚基间的疏水作用减弱会引起酶的解离。