酶的分离纯化
酶的分离纯化方法介绍
酶的分离纯化方法介绍酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。
关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。
这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。
这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
酶的来源多为生物细胞。
生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
酶的分离纯化
二、酶纯化过程的三个阶段
粗蛋白(crude 粗蛋白(crude protein)
采样 破细胞 提取全部蛋白，多用盐析沉淀法。
部分纯化(partially 部分纯化(partially purified) 初步的纯化，使用
各种柱层析法。
均质纯化(homogeneous) 均质纯化(homogeneous) 目的酶的进一步精制，
二、抽提
细胞破碎后，可采用两种方式进行抽提：
普遍抽提和先后用不同溶剂进行选择性抽提。
抽提条件的选择：
一般用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液进行抽提。
酶的主要提取方法
提取方法 盐溶液提取 酸溶液提取 碱溶液提取 使用的溶剂或溶液 0.02～0.5mol/L的盐溶 0.02～0.5mol/L的盐溶 液 PH2～ PH2～6的水溶液 PH8～12的水溶液 PH8～12的水溶液 提取对象 用于提取在低浓度盐溶液中溶解度 较大的酶 用于提取在稀酸溶液中溶解度大， 且稳定性较好的酶 用于提取在稀碱溶液中溶解度大且 稳定性较好的酶 用于提取那些与脂质结合牢固或含 有较多非极性基团的酶
饱和度调整
加入固体盐。不增大 溶液体积。 饱和溶液。原溶液体 积不大。 透析平衡法
541× ( S 2 − S1 ) g= 1 − 0.3 × S 2
100 × (S2 − S )1 v= 1 − S2
4) 影响盐析的因素
(1)pH
接近于待纯化酶的等电点。
(2)温度 (2)温度
从酶的稳定性和溶Байду номын сангаас度看，盐析温度一般以控制 在30℃左右为宜。 30℃
1 2 3 4
机 破碎 理破碎 化 酶 破碎 破碎
DY89-I 动 匀 机 细 胞 破 碎 珠
分离纯化一种酶的方法
分离纯化一种酶的方法分离纯化一种酶是生物工程领域的一个重要研究课题，有多种方法可以用来实现这一目标。
下面将介绍几种常用的分离纯化酶的方法。
1.固定相吸附色谱法固定相吸附色谱法是最常用的酶纯化方法之一。
在这种方法中，通过对酶进行吸附，然后使用缓冲溶液洗脱的方式分离纯化酶。
为了实现这一目标，可以选择一种适合酶吸附的固定相，例如亲和树脂、离子交换树脂或凝胶等。
通过在不同的条件下洗脱，可以逐步去除非目标蛋白质，最终得到纯化的酶。
2.亲和层析法亲和层析法是常用的可以选择性地与酶相互作用的方法。
在亲和层析法中，可以通过与酶相互作用的特定亲和剂将酶从复杂混合物中分离出来。
例如，可以根据酶与金属离子的亲和性，使用金属离子柱进行层析。
亲和层析法通常需要先对亲和剂进行固定，然后通过加载样品和适当的洗脱剂来纯化酶。
3.凝胶过滤法凝胶过滤法是一种基于酶的大小差异来分离纯化的方法。
这是一种较为简单的方法，适用于分离不同分子量的酶。
在凝胶过滤法中，通过将混合物通过一系列的凝胶分离层来分离不同大小的分子。
酶分子会在凝胶中被阻止，而较小的分子可以通过凝胶透析孔隙。
通过控制凝胶的孔隙大小，可以选择性地纯化酶。
4.电泳法电泳法是一种常用的酶分离纯化方法，尤其适用于具有不同电荷的酶。
在电泳法中，通过在电场中施加电压，根据不同酶的迁移速度将酶分离出来。
根据酶的等电点和电荷性质，可以选择凝胶电泳或者等电聚焦电泳来分离纯化酶。
电泳法的一个重要应用是SDS-PAGE，它从凝胶中获得酶的纯化和分析。
5.超滤法超滤法是一种可以根据酶的分子量选择性地分离纯化酶的方法。
在超滤法中，通过将混合物通过一系列合适孔径的滤膜，可以将酶与其他较小分子分离开来。
较大分子（包括酶）会被限制在滤膜上方，而较小分子则可以通过滤膜，从而实现分离纯化酶的目的。
综上所述，分离纯化酶的方法有很多种。
选择适用的方法取决于酶的性质、目标和需求。
常用的方法包括固定相吸附色谱法、亲和层析法、凝胶过滤法、电泳法和超滤法。
酶分离纯化的步骤主要原理
酶分离纯化的步骤主要原理
酶的纯化和分离是通过一系列步骤实现的，其主要原理包括以下几点：
1. 细胞破碎：首先需要将含有酶的细胞破碎，以释放酶分子。
这可以通过物理方法（如超声波或搅拌）或化学方法（如溶解细胞膜）实现。
2. 酶的特异性沉淀：根据酶的特性和条件，选择适当的方法使酶与其他杂质分子分离。
常用的方法包括沉淀、沉降和离心。
例如，可以通过加入特定的沉淀剂或改变pH值来使酶沉淀，从而将其与其他溶液中的物质分离。
3. 过滤和超滤：利用不同孔径的滤膜，可以通过过滤和超滤方法去除较大分子，如蛋白质碎片和细胞残渣。
4. 离子交换层析：离子交换层析是利用酶与离子交换树脂之间的相互作用进行分离的方法。
树脂上的离子可吸附酶，而其他杂质则被洗脱。
5. 亲和层析：亲和层析是通过酶与特定配体之间的亲和力实现分离的方法。
配体可以是酶的底物、抗体或其他具有与酶特异性结合的小分子。
酶与配体结合后，可以用洗脱剂将酶从亲和层析柱上洗脱。
6. 凝胶过滤层析：凝胶过滤层析是根据酶的分子大小和形状实现分离的方法。
通过选择合适孔径的凝胶、调节操作条件，可以将酶与其他分子分开。
7. 高效液相层析：高效液相层析（HPLC）是一种高效的液相分离技术。
通过调节流动相和固定相的性质，利用酶与固定相之间的相互作用进行分离。
8. 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法，通过电泳平台上的电场作用下，根据酶的电荷、形状和大小进行分离。
以上步骤和原理可以根据酶的特性和所需纯度的要求进行组合和调整，以实现酶的有效纯化和分离。
酶的分离 纯化
（2-4）
若酶的总浓度用[E]t表示，那么 [E]= [E]t－[ES]，代入式（2-4）并整理得
（2-5）
由于酶的反应速度与[ES]成正比，所以
V = k3 [ES] 将（2-5）代入（2-6），得
（2-6）
（2-7）
第一节 酶促反应动力学
当底物浓度很高时，所有酶都与底物结合生成中间产物ES，则[E]t=[ES]。此时 反应速度达到最大Vmax，即
整理上式可得 Km= [S] 由此可以看出，Km的物理意义就是当酶反应速度达到最大反应速度的一半时的 底物浓度，其单位与物质摩尔浓度单位相同，用mol/L表示。Km数值大小与酶的浓 度无关，是酶反应的特性常数。不同酶的Km值不同，且同一酶在不同的底物下，其 Km值也不同。米氏常数可由实验测得，也可用下面的公式求得：
Vmax= k3 [ES]= k3[E]t
（2-8）
（2-7）除以（2-8），并整理得
（2-9）
这就是米-曼氏方程（Michaelis-Menten equation），又称为米氏方程，式中的 Km是一常数值，称为米氏常数。在特殊情况下，当v = Vmax时，米氏方程可转化为下 式：
第一节 酶促反应动力学
第三章 酶的分离纯化
酶分离纯化的目的
酶分离纯化的目的是使酶制剂 产品达到应用所需的纯度。
分离纯化过程包括3个基本步骤：
1 抽提 2 纯化 3 制剂
Crude product concentration versus selling price (Dwyer, 1984)
第一节 酶促反应动力学
对许多酶的性质的观察和研究得知，在低的底物浓度[S]下，反应速度（v）直接 与底物浓度[S]成正比；在高底物浓度[S]下，速度趋向于最大值（Vmax），此时反应速 度与底物浓度[S]无关（如图2-1）。
酶的分离纯化
三浓缩 1蒸发 2超过滤 3胶过滤 4反复冻融
三酶的纯化原理与方法
1根据溶解度的不同进行的纯化 A盐析法 B有机溶剂沉淀法 C共沉淀法 D选择性沉淀法
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2按照分子大小进行的纯化
A胶过滤（层析）法 B 超过滤法 C超离心法
三根据电学解离性质进行纯化
酶的分离纯化与制剂
一酶分离纯化工作的基本原则 酶分离纯化工作包括三个基本环节： 1抽提（extraction） 2纯化（purification） 3制剂（preparation）。
抽提是要将酶从原料中抽提出来作 成酶溶液；
纯化则是要将酶和杂质分离开来，或者选 择地将酶从包含杂质的溶液中分离出 来，或者选择地将杂质从酶溶液中移除出 去； 制剂则是要将纯化的酶作成一定形式的制 剂。
为了能够成功地进行酶的分离纯化， 应注意以下问题。
1防止酶变性失效 2选择有效的纯化方法 3酶活性的测定贯穿纯化过程的始终
二酶的抽提
一预处理和破细胞 二抽提 1pH 首先应考虑的是酶的酸碱稳定性，选 择的pH不能超过酶的稳定范围。 2盐 抽提液一般采用等渗盐溶液，最普通的 有0.020~0.050mol/L的磷酸缓冲液， 0.15mol/LNaCl溶液等。 3温度 抽提温度一般控制在0~4℃.
A吸附层析法 B离子交换层析法 C电泳法 D聚焦层析法 E快速液相层析法 F疏水层析法
四利用专一亲和作用进行纯化
1亲和层析法 2亲和电泳法 3融合蛋白亲和分离法 4其他相关的亲和分离法 A金属螯合层析法 B共价层析法
酶的分离纯化
第三章酶的分离纯化第三章酶的分离纯化第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤第二节细胞破碎第三节酶的抽提第四节酶的纯化第五节酶的纯度与产量第六节酶的剂型与保存第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤1926年Summer制备了第一个结晶酶，自此以后，酶分离纯化工作进展很快，现已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净，并根据酶的作用特点，理化性质、发展了各种类型的分离纯化方法、试剂和设备。
一、基本原则二、酶分离纯化的基本步骤为了能成功地进行酶的分离纯化，需注意以下两个基本原则：1. 防止酶变性失效防止酶变性失效是酶分离纯化工作很重要的问题，这一点在纯化后期尤为突出。
一般地，凡是用以预防蛋白质变性的方法与措施，都可考虑用于酶分离纯化工作中。
常见的措施有：（1）低温：除少数例外，所有操作应在低温下进行，有有机溶剂存在时，更应注意。
二、酶分离纯化的步骤酶分离纯化时，一般要经过如下步骤：1. 细胞破碎：除在体液中提取酶或胞外酶，一般都要进行细胞破碎，促使胞内酶溶出，以利于抽提。
2. 抽提3. 纯化下面分节对这三个基本环节加以介绍第二节细胞破碎细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法。
一、机械破碎法二、物理破碎法三、化学破碎法四、酶学破碎法：通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。
1. 机械捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎，转速可高达10000r/min。
常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。
此法在实验宝和生产规模均可采用。
通过温度、压力、声波等各种物理因素作用，使组织细胞破碎的方法，该称为物理破碎法。
物理破碎法包括如下几种方法；1. 温度差破碎法：通过温度的突然变化使细胞破碎。
即将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将在较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。
酶的分离纯化方法
酶的分离纯化方法-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1酶的分离纯化方法摘要酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。
一个特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行摸索，很少有通用的规律可循。
本文从酶原料选择、酶的分离与纯化、酶纯度的评价三个方面进行总结，列举了一些常用的分离纯化方法。
关键词酶、分离纯化、方法、纯度中图分类号O6酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。
一个特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行摸索，很少有通用的规律可循。
酶的纯化过程与一般的蛋白质纯化过程相比，又有其本身独有的特点：一是酶一般取自生物细胞，而特定的一种酶在细胞中的含量很少；二是酶可以通过测定活力的方法加以跟踪，前者给纯化带来了困难，而后者却能使我们迅速找出纯化过程的关键所在。
1 酶原料选择提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
但是由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
2 酶的分离纯化由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。
酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。
酶主要的分离纯化方法
酶主要的分离纯化方法。
1、根据酶分子大小和形状的分离方法。
(1)离心分离。
许多酶往往富集于某一特定的细胞器内，先通过离心得到某一特定的亚细胞成分，然后再对某一特定的酶进行纯化。
包括一般离心、差速离心、密度梯度离心。
(2)凝胶过滤。
酶蛋白分子大小不同，大于凝胶孔径的被凝胶排阻，因而在凝胶颗粒间隙中移动，速度较快；小于凝胶孔径的可自由出人凝胶颗粒的小孔内，路径加长，移动缓慢。
这样通过一定长度的凝胶层析柱后，大小不同的酶蛋白分子就被分开了。
(3)透析与超滤。
通过透析可以除去酶液中的盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。
超滤指在一定压力下，将溶液强制通过一定孔径的滤膜以达到分离纯化的目的。
2、根据酶分子电荷性质的分离方法。
(1)离子交换层析。
根据不同的蛋白质与离子交换剂的亲合力不同而达到分离目的的方法称为离子交换层析。
(2)层析聚焦。
层析聚焦层析聚焦类似于等电聚焦，但其连续的pH梯度是在固相离于交换载体上形成的。
(3)电泳。
在外电场作用下，由于蛋白质离于所带净电荷的大小和性质不同，因而其泳动方向和速率也不同，从而达到分离的目的。
酶的分离纯化
酶的分离纯化提取原则a. 相似相溶。
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。
一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。
酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。
b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
酶的提取方法酶的分离方法1沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。
其中以硫酸铵最为常用。
在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。
有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。
主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。
溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等2离心分离离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。
在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。
蛋白质分子在离心時，其分子量、分子密度、组成、形状等，均会影响其沉降速率，沉降係系数即用來描述此沉降性质；其单位为S (Svedberg unit)。
每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。
不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法，在密度梯度中作分離。
3、过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。
过滤的分类及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同)借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。
酶的分离与纯化
● 鹽溶 Salting-in:
加鹽使蛋白質溶入水溶液中
● 鹽析 Salting-out:
加鹽使蛋白質由水溶液中沉澱出來
設計純化步驟時，需考慮下列各項要求
• • • •
a. 高活性 b. 高回收率 c. 高純度 d. 方便與快速
組合純化步驟
• a. 組合標準 • (1) 已知的酵素，可依照已發表的步驟進行， 有問題再作改進。 通常都是以 硫酸銨分劃 - 膠 体過濾 - 離子交換 為骨幹，再加上其它方法， 組成全部流程。 • (2) 對完全未知的酵素，可循此骨幹先試行純 化，看其結果如何再加改進。 • (3) 不要忘記利用該酵素的特殊性質來純化， 如在其 pI 沉澱性、特別的疏水性、有專一的抑 制劑或熱穩定性等。
• 膠体過濾法在操作時，有些內在的問題，會影 響結果的好壞： • (1) 擴散及亂流： 由於是在液相中進行，樣本 在膠柱中的 擴散現象 相當顯著；又因液体在 膠球間流動時，受 重力 及 對流 的影響，會造 成 亂流。 擴散及亂流都會使膠体過濾的解析 力降低甚多。 • (2) 管柱設計不良： 經常是致命的傷害，例如 無效空間 (dead volume) 過大、緩衝液進入膠体 時流動不均、溶離液出口端的管路太長或太粗 等。
近朱者赤、近墨者黑，物以類聚，不 論人類或是分子皆同
色谱的类型
. 常用的層析方法
膠體過濾法
• 膠体過濾 属 partition 層析法，流動相為溶離緩 衝液，固定相為膠体孔隙內的緩衝液。 溶質 (樣本蛋白質) 根據其 分子量 的大小，決定分 佈在這兩相的比例。 分子量大的不易進入膠球， 隨流動相溶離；分子量小的，則易竄入膠球內 的固定相，而被延滯流出膠柱 。 分子的 形狀、 大小 均為影響因素，即與其 分子半徑 (Stokes radius) 有關，與分子量不完全成正比關係；但 一般均視蛋白質為球形，故其形狀較無影響 力。
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超声波破碎法
化学破碎法： 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton、
Tween等表面活性剂
酶促破碎法
自溶法 加酶处理
G+菌：溶菌酶 G-菌：溶菌酶、巯基乙醇等 酵母菌：β-葡聚糖酶和溶菌酶 霉菌：几丁质酶
四、抽提 指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充
分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的提取。
2、按膜孔径或截留物质的大小：
微滤 —— 超滤 —— 纳滤 、电渗析 、透析 —— 反渗透
膜
孔
径大
小
灰尘 细菌
膜
病毒 生物大分子 生物小分子 盐类 水
灰尘 细菌 病毒 生物大分子
生物小分子 盐类 水
微滤（MF）
（0.2-2um）
超滤（UF）
（10-200nm）
灰尘 细菌 病毒 生物大分子 生物小分子
选择性热变性法、选择性酸碱变性法、 选择性表面变性法
亲和层析、亲和电泳
ห้องสมุดไป่ตู้
第三节 酶的沉淀分离
盐析沉淀法√、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法
一、盐析沉淀法 1、原理： 2、硫酸铵盐析的优点
优点：①在水中溶解度大，溶解的温度系数小； ②价廉，便宜； ③可保护酶。
缺点：溶解过程随浓度增加的体积变化是非线性的变化。
(25℃)
当溶液体积不大，要达到的盐浓度不高，可以加 入饱和硫酸铵溶液；当溶液体积较大，要达到的盐 浓度又较高，此时加入固体硫酸铵较好。
4、为了得到较好的盐析效果，应控制下列因素
（1）不同酶，盐析时所需的盐浓度各不相同。实际料液中目 标酶的盐析沉淀操作前，所需的硫酸铵浓度或饱和度可通过实 验确定。
（2）加盐操作时，防止局部盐浓度过高，防止产生泡沫。
（3）pH值和温度：等电点附近，室温或低温操作。
（4）蛋白质浓度：样品液的蛋白质浓度一般控制在2.5~3.0% 为宜，太浓时应适当稀释，以减少杂蛋白共沉淀。 （5）脱盐：超滤、透析或层析。
（二）等电点沉淀
1、原理 2、实际操作
与其他方法一起使用（盐析、有机溶剂沉淀、复合沉淀）。 单独使用时，主要是用于从粗酶中除去某些等电点相距较 大的杂蛋白 。
中空纤维超滤膜组件
渗出液
清洗液出口 （c）
渗出液
清洗液
五、膜及膜的使用性能
（一）、膜的结构和制膜材料 表层：孔径各异，厚度为0.1~5um
膜 基层：起支持作用，厚度为50~250um
制膜材料：醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚砜、聚酰胺等
（二）、膜的使用性能 （1）透水率（透水通量、流率）； （2）截留率； （3）截留物相对分子质量
实验室和生产中通常利用微滤技术除去或收集酶发酵 液中的细胞。
无菌水、矿泉水、纯生啤酒的生产。热敏性药 物和营养物质的过滤除菌等
（二） 超 滤(UF)
可截留溶液中溶解的大分子物质，而透过小分子物质。
（1）截留颗粒直径：10~200 nm。 （2）操作压力：0.1~0.7MPa。
（3）应用：一是分离纯化，从高分子物质与低分子物质的溶 液中，使低分子物质透过膜；二是溶液的浓缩。
第四章 酶的分离纯化及产品成型
4
本章知识点：
（
的）
（1）酶的抽提
纯酶
（2）酶的分离纯化：沉淀分离、离心分离、
度 监
纯 化
膜过滤、层析分离、电泳分离 测 过
（3）酶液的浓缩、结晶、干燥、成型
程
一、生物下游加工技术
下游加工过程包括目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化 等过程。 生物产物从原料（培养液或细胞）生产到产品的后处理技 术（分离纯化技术）的发展，使低成本、高收率地纯化目标 产物成为现实。
盐类 水
灰尘 细菌 病毒 生物大分子 生物小分子 盐类
水
纳滤（MF） 反渗透滤（RO）
（2-10nm）
（＜2nm）
各种膜分离法的原理和应用范围
膜分离法 截留的颗粒大小 截留的主要物质 过滤介质 应用举例
微 滤（MF） 0.2~2um
超 滤 （UF） 10nm~200nm 纳滤
（NF） 2nm~10nm 反渗透 （RO） <2nm
3、盐析操作 （1）硫酸铵的饱和度
实际浓度 （NH4）2SO4 的饱和度（%）= 饱和浓度 ×100%
0.4S = 40%（饱和度）
（2）调整盐浓度的方法
例：将2升0.2S的硫酸 铵溶液提升至0.5S，需加饱
和硫酸铵多少升？溶液体积
加饱和（NH4）2SO4 溶液： 增加多少倍？
V=
V0（S2 - S1） 1 - S2
PAA + 酶 + Ca 2+
PAA- Ca 2+ + 酶
PAA- Ca 2+ + SO4 2-
CaSO4 + PAA
（五）选择性变性沉淀法
选择一定的条件使酶液中存在的某些蛋白质等杂质变性 沉淀，而不影响所需的酶。
1、热变性法：根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异，可以在 较高温度下，使杂蛋白变性沉淀，而酶则保持可溶状态。
在电场作用下，带电离子透过膜向两极移动，而达到分离 的目的。
+
膜
-
膜
酶液
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应用：电渗析主要用于酶液或其他溶液的脱盐、海水淡化、 纯水制备等
（五） 透析
应用：在生物分离方面，主 要用于生物大分子溶液的脱盐。 由于透析过程以浓差为传质推 动力，膜的透过通量很小，不 适于大规模生物分离过程，而 在实验室中应用较多。
灰尘、细菌
微孔滤膜
除菌，回收 菌
生物大分子及以上 超滤膜
蛋白质、多 肽和多糖的 回收和浓缩
生物小分子及以上 纳滤膜 脱盐、浓缩
盐类及以上
盐、氨基酸、 反渗透膜 糖的浓缩、
淡水制造
二、酶分离纯化中几种常见的膜分离技术
（一） 微 滤(MF)
又称微孔过滤，是以微滤膜作为过滤介质的膜分离技术。
（1）截留颗粒直径：0.2~2 um。 （2）操作压力：低于0.1 MPa。 （3）应用：
3680Kg
经验常数W — 将01℃L饱和度10为℃S1的溶20液℃提高2到5℃S2所 30℃
要添加的固体硫酸铵克数；
A
0.271 0.281 0.290 0.294 0.298
A、B — 与温度有关的经验常数
B（g/L） 514.72 525.05 536.34 541.24 545.88
（mol/L） 3.09 3.97 4.06 4.10 4.13
三、酶分离纯化的基本原则
（一）酶分离纯化包括三个基本环节
抽提
纯化
精制
（二）酶分离纯化应注意以下问题
1、防止酶变性失活：温度、pH、泡沫、重金属等。 2、选择有效的纯化方法。 3、酶活性测定与总蛋白质含量测定应贯穿纯化过程的 始终。
第一节 从发酵液制取酶提取液（酶溶液的制备）
一、发酵液的预处理 目的：降低粘度，便于固液分离 方法：（1）加热：
至会导致一次工业革命的重大生产技
渗出液
术，所以可以称为前沿技术，是世界
各国研究的热点。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
一、膜分离的类型
1、按推动力不同可分为： （1）扩散膜分离：渗透、透析 （2）压力差膜分离：微滤、超滤、纳滤、反渗透 （3）电位差膜分离：电渗析
硫酸铵盐析
免疫亲和层析
阳离子交换层析 仅三步，总收率达81.0%
在实践工作中选择方法时:
首先，应对被纯化的酶的理化性质有—个比较全面的了 解;
其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以测定酶 活性为标准。
再者，在纯化工作中，往往不宜重复采用相同的步骤和 条件。
最后，要严格控制操作条件。随着酶的逐步纯净，杂蛋 白含量亦逐步降低，蛋白质之间的相互作用力随之下降, 酶更不稳定，因此,更要防止酶变性。
V0 — 原来溶液的体积 V— 所需加入饱和硫酸铵的体积
S1 — 原来溶液的硫酸铵饱和度 S2 — 所需达到的硫酸铵饱和度
加固体（NH4）2SO4 ：
例：某酶制剂厂生产15吨蛋 白酶发酵液，用硫酸铵进行盐析, 要求硫酸铵的饱和度达到40%， 计算需要加入固体硫酸铵多少kg? （25℃）
W=
B（S2 - S1） 1 － AS2
（一）抽提方法 四稀：稀酸、稀碱、稀盐、稀有机溶剂
（二）抽提过程中的注意事项
1、pH值：选择的pH值不超出酶的酸碱稳定范围；
最好远离待抽提酶的等电点。 2、温度：通常控制在0~4℃左右，尤其是采用有机溶剂提取时。 3、抽提液体积（用量）
抽提液的用量一般为含酶原料体积的2~5倍。可一次抽提，也可分几次 反复抽提。 4、为提高酶的稳定性，可以加入适量的保护剂。
2、酸碱变性法：与热变性原理类似，目的酶与杂蛋白的酸 碱稳定性不同，可以调整不同的pH使杂蛋白变性沉淀。
第三节 膜过滤技术在酶分离纯化中的应用
借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不 同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离、提 纯或浓缩的新型分离技术。
膜分离技术已被国际上公认为20世
纪末至21世纪中期最有发展前途，甚
酶分离纯化方法：
现有的纯化方法，都是以酶与杂蛋白在理化性质、稳定 性上的差异以及酶的生物学特性为依据而建立起来的。
分离依据的性质
分离方法
根据分大小、轻重
离心分离、凝胶过滤、膜分离
根据溶解度大小 根据电学性质
盐析沉淀、有机溶剂沉淀、共沉淀、 选择性沉淀、等电点沉淀
离子交换层析、电泳分离
根据稳定性差异 根据亲和作用
3、注意 加酸碱调节pH值时，防止局部酸碱过高。
（三）有机溶剂沉淀法