酶的分离纯化

灰尘、细菌
微孔滤膜
除菌，回收 菌
生物大分子及以上 超滤膜
蛋白质、多 肽和多糖的 回收和浓缩
生物小分子及以上 纳滤膜 脱盐、浓缩
盐类及以上百度文库
盐、氨基酸、 反渗透膜 糖的浓缩、
淡水制造
二、酶分离纯化中几种常见的膜分离技术
（一） 微 滤(MF)
又称微孔过滤，是以微滤膜作为过滤介质的膜分离技术。
（1）截留颗粒直径：0.2~2 um。 （2）操作压力：低于0.1 MPa。 （3）应用：
（一）抽提方法 四稀：稀酸、稀碱、稀盐、稀有机溶剂
（二）抽提过程中的注意事项
1、pH值：选择的pH值不超出酶的酸碱稳定范围；
最好远离待抽提酶的等电点。 2、温度：通常控制在0~4℃左右，尤其是采用有机溶剂提取时。 3、抽提液体积（用量）
抽提液的用量一般为含酶原料体积的2~5倍。可一次抽提，也可分几次 反复抽提。 4、为提高酶的稳定性，可以加入适量的保护剂。
大多数酶的回收纯化过程成本约占70%； 医用酶的生产回收过程的成本高达85%； 基因工程表达产物的回收纯化过程成本一般占85-90%以上； 青霉素回收过程成本约占50%； 乙醇的回收过程成本仅占14%。
二、分离纯化的一般流程
原料液
线路1
细胞分离（离心、过滤）
线路2
细胞（胞内产物）
清液（胞外产物）
细胞破碎
2、酸碱变性法：与热变性原理类似，目的酶与杂蛋白的酸 碱稳定性不同，可以调整不同的pH使杂蛋白变性沉淀。
第三节 膜过滤技术在酶分离纯化中的应用
借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不 同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离、提 纯或浓缩的新型分离技术。
膜分离技术已被国际上公认为20世
纪末至21世纪中期最有发展前途，甚
膜
膜
水
渗透
盐类 水
透析
透析袋 酶溶液 蒸馏水
三、膜分离技术的基本流程
料液罐
浓缩液（回流液）
渗出液
泵
膜组件
四、生产中常用的膜分离装置
中空纤维超滤器 中空纤维膜分 离装置是将成束的中空纤维装入 一筒内，两端封闭。当轴流通过 管腔时，造成高剪切力，在截留 溶质分子的同时，将浓度降至最 低限度。每根中空纤维内腔直径 为0.2mm,中空纤维由惰性的非离 子聚合物制成．具有各向异性、 抗堵塞性，运用成束纤维表面积 大，流量大、阻留溶质的浓度范 围(4％一20％左右) 如右图。
膜材料
生物分离过程常用的膜分离技术为超滤、微滤和反渗透。为 实现高效率的膜分离操作，对膜材料有如下要求： (1)起过滤作用的有效膜厚度小，超滤和微滤膜的开孔率高， 过滤阻力小； (2)膜材料为惰性，不吸附溶质(蛋白质、细胞等)，从而使膜 不易污染，膜孔不易堵塞； (3)适用的pH和温度范围广，耐高温火茵，耐酸碱清洗剂， 稳定性高，使用寿命长； (4)容易通过清洗恢复透过性能； (5)满足实现分离目的的各种要求，如对菌体细胞的截留、对 生物大分子的通透性或截留作用等。 目前市售膜的种类很多，主要有天然高分子、合成高分子和 无机材料。下面简要介绍制造超滤、微滤和反渗透膜的各种 膜材料。
V0 — 原来溶液的体积 V— 所需加入饱和硫酸铵的体积
S1 — 原来溶液的硫酸铵饱和度 S2 — 所需达到的硫酸铵饱和度
加固体（NH4）2SO4 ：
例：某酶制剂厂生产15吨蛋 白酶发酵液，用硫酸铵进行盐析, 要求硫酸铵的饱和度达到40%， 计算需要加入固体硫酸铵多少kg? （25℃）
W=
B（S2 - S1） 1 － AS2
实验室和生产中通常利用微滤技术除去或收集酶发酵 液中的细胞。
无菌水、矿泉水、纯生啤酒的生产。热敏性药 物和营养物质的过滤除菌等
（二） 超 滤(UF)
可截留溶液中溶解的大分子物质，而透过小分子物质。
（1）截留颗粒直径：10~200 nm。 （2）操作压力：0.1~0.7MPa。
（3）应用：一是分离纯化，从高分子物质与低分子物质的溶 液中，使低分子物质透过膜；二是溶液的浓缩。
盐类 水
灰尘 细菌 病毒 生物大分子 生物小分子 盐类
水
纳滤（MF） 反渗透滤（RO）
（2-10nm）
（＜2nm）
各种膜分离法的原理和应用范围
膜分离法 截留的颗粒大小 截留的主要物质 过滤介质 应用举例
微 滤（MF） 0.2~2um
超 滤 （UF） 10nm~200nm 纳滤
（NF） 2nm~10nm 反渗透 （RO） <2nm
硫酸铵盐析
免疫亲和层析
阳离子交换层析 仅三步，总收率达81.0%
在实践工作中选择方法时:
首先，应对被纯化的酶的理化性质有—个比较全面的了 解;
其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以测定酶 活性为标准。
再者，在纯化工作中，往往不宜重复采用相同的步骤和 条件。
最后，要严格控制操作条件。随着酶的逐步纯净，杂蛋 白含量亦逐步降低，蛋白质之间的相互作用力随之下降, 酶更不稳定，因此,更要防止酶变性。
选择性热变性法、选择性酸碱变性法、 选择性表面变性法
亲和层析、亲和电泳
第三节 酶的沉淀分离
盐析沉淀法√、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法
一、盐析沉淀法 1、原理： 2、硫酸铵盐析的优点
优点：①在水中溶解度大，溶解的温度系数小； ②价廉，便宜； ③可保护酶。
缺点：溶解过程随浓度增加的体积变化是非线性的变化。
（三） 反渗透(RO)
在压力作用下，溶剂（通常是水）透过膜，而溶质被阻 挡于膜壁外。
（1）截留颗粒直径：小于2 nm。
（2）操作压力：1~8 MPa。 （3）应用：主要用于分离各种离子和小分子物质。
在酶液的浓缩、无离子水的制备、海水淡化等方面广泛 应用。
膜
膜
溶质
水
水
渗透
溶质
水
水
反渗透
（四） 电渗析
在电场作用下，带电离子透过膜向两极移动，而达到分离 的目的。
+
膜
-
膜
酶液
-
+
应用：电渗析主要用于酶液或其他溶液的脱盐、海水淡化、 纯水制备等
（五） 透析
应用：在生物分离方面，主 要用于生物大分子溶液的脱盐。 由于透析过程以浓差为传质推 动力，膜的透过通量很小，不 适于大规模生物分离过程，而 在实验室中应用较多。
至会导致一次工业革命的重大生产技
渗出液
术，所以可以称为前沿技术，是世界
各国研究的热点。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
一、膜分离的类型
1、按推动力不同可分为： （1）扩散膜分离：渗透、透析 （2）压力差膜分离：微滤、超滤、纳滤、反渗透 （3）电位差膜分离：电渗析
（2）加盐操作时，防止局部盐浓度过高，防止产生泡沫。
（3）pH值和温度：等电点附近，室温或低温操作。
（4）蛋白质浓度：样品液的蛋白质浓度一般控制在2.5~3.0% 为宜，太浓时应适当稀释，以减少杂蛋白共沉淀。 （5）脱盐：超滤、透析或层析。
（二）等电点沉淀
1、原理 2、实际操作
与其他方法一起使用（盐析、有机溶剂沉淀、复合沉淀）。 单独使用时，主要是用于从粗酶中除去某些等电点相距较 大的杂蛋白 。
酶分离纯化方法：
现有的纯化方法，都是以酶与杂蛋白在理化性质、稳定 性上的差异以及酶的生物学特性为依据而建立起来的。
分离依据的性质
分离方法
根据分大小、轻重
离心分离、凝胶过滤、膜分离
根据溶解度大小 根据电学性质
盐析沉淀、有机溶剂沉淀、共沉淀、 选择性沉淀、等电点沉淀
离子交换层析、电泳分离
根据稳定性差异 根据亲和作用
3、注意 加酸碱调节pH值时，防止局部酸碱过高。
（三）有机溶剂沉淀法
1、作用原理 去水膜；降低介电常数、破坏氢键。
2、注意 低沸点，易燃易爆；低温操作，沉淀析出后要尽快分离。
（四）复合物沉淀法
1、原理 2、常用的复合沉淀剂：
单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。
PAA + 酶
PAA-酶
PAA-酶 pH6以上 PAA + 酶
3、盐析操作 （1）硫酸铵的饱和度
实际浓度 （NH4）2SO4 的饱和度（%）= 饱和浓度 ×100%
0.4S = 40%（饱和度）
（2）调整盐浓度的方法
例：将2升0.2S的硫酸 铵溶液提升至0.5S，需加饱
和硫酸铵多少升？溶液体积
加饱和（NH4）2SO4 溶液： 增加多少倍？
V=
V0（S2 - S1） 1 - S2
超声波破碎法
化学破碎法： 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton、
Tween等表面活性剂
酶促破碎法
自溶法 加酶处理
G+菌：溶菌酶 G-菌：溶菌酶、巯基乙醇等 酵母菌：β-葡聚糖酶和溶菌酶 霉菌：几丁质酶
四、抽提 指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充
分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的提取。
3680Kg
经验常数W — 将01℃L饱和度10为℃S1的溶20液℃提高2到5℃S2所 30℃
要添加的固体硫酸铵克数；
A
0.271 0.281 0.290 0.294 0.298
A、B — 与温度有关的经验常数
B（g/L） 514.72 525.05 536.34 541.24 545.88
（mol/L） 3.09 3.97 4.06 4.10 4.13
适用于耐热的酶，注意常要加适当的酶保护剂。 （2）加凝聚剂或絮凝剂
（3）调pH值
二、固液分离 方法：（1）离心分离；（2）过滤；（3）双水相萃取
三、细胞破碎
捣碎法：捣碎机
机械破碎法
研磨法：研钵、细菌磨、石磨、球磨等 匀浆法：匀浆器
物理破碎法
温度差破碎法：冻融交替法 压力差破碎法：高压冲击法、突然降压法、渗透压变化
碎片分离
粗分离 纯化 成品化
人干扰素、是一种重要蛋白类生物药品，具有抗癌和治疗 肝炎等作用。
Yonehara等人：
醋酸锌盐析
（83.0%）
离子交换层析
（62.7%）
硫酸铵盐析
（96.2%）
铜螯合层析
（46.0%）
疏水层析
（78.3%）
凝胶电泳
（88.9%）
共六步，总收率仅为16%
staehelin等人：
第四章 酶的分离纯化及产品成型
4
本章知识点：
（
的）
（1）酶的抽提
纯酶
（2）酶的分离纯化：沉淀分离、离心分离、
度 监
纯 化
膜过滤、层析分离、电泳分离 测 过
（3）酶液的浓缩、结晶、干燥、成型
程
一、生物下游加工技术
下游加工过程包括目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化 等过程。 生物产物从原料（培养液或细胞）生产到产品的后处理技 术（分离纯化技术）的发展，使低成本、高收率地纯化目标 产物成为现实。
中空纤维超滤膜组件
渗出液
清洗液出口 （c）
渗出液
清洗液
五、膜及膜的使用性能
（一）、膜的结构和制膜材料 表层：孔径各异，厚度为0.1~5um
膜 基层：起支持作用，厚度为50~250um
制膜材料：醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚砜、聚酰胺等
（二）、膜的使用性能 （1）透水率（透水通量、流率）； （2）截留率； （3）截留物相对分子质量
2、按膜孔径或截留物质的大小：
微滤 —— 超滤 —— 纳滤 、电渗析 、透析 —— 反渗透
膜
孔
径大
小
灰尘 细菌
膜
病毒 生物大分子 生物小分子 盐类 水
灰尘 细菌 病毒 生物大分子
生物小分子 盐类 水
微滤（MF）
（0.2-2um）
超滤（UF）
（10-200nm）
灰尘 细菌 病毒 生物大分子 生物小分子
(25℃)
当溶液体积不大，要达到的盐浓度不高，可以加 入饱和硫酸铵溶液；当溶液体积较大，要达到的盐 浓度又较高，此时加入固体硫酸铵较好。
4、为了得到较好的盐析效果，应控制下列因素
（1）不同酶，盐析时所需的盐浓度各不相同。实际料液中目 标酶的盐析沉淀操作前，所需的硫酸铵浓度或饱和度可通过实 验确定。
PAA + 酶 + Ca 2+
PAA- Ca 2+ + 酶
PAA- Ca 2+ + SO4 2-
CaSO4 + PAA
（五）选择性变性沉淀法
选择一定的条件使酶液中存在的某些蛋白质等杂质变性 沉淀，而不影响所需的酶。
1、热变性法：根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异，可以在 较高温度下，使杂蛋白变性沉淀，而酶则保持可溶状态。
三、酶分离纯化的基本原则
（一）酶分离纯化包括三个基本环节
抽提
纯化
精制
（二）酶分离纯化应注意以下问题
1、防止酶变性失活：温度、pH、泡沫、重金属等。 2、选择有效的纯化方法。 3、酶活性测定与总蛋白质含量测定应贯穿纯化过程的 始终。
第一节 从发酵液制取酶提取液（酶溶液的制备）
一、发酵液的预处理 目的：降低粘度，便于固液分离 方法：（1）加热：
1.天然高分子材料 主要是纤维素的衍生物，有醋酸纤维、硝酸纤维和再生纤
维素等。其中醋酸纤维膜的截盐能力强，常用作反渗透膜、 也可用作微滤膜和超滤膜。醋酸纤维膜使用最高温度和pH范 围有限，一般使用温度低于45～50℃，pH3～8。再生纤维 素可制造透析膜和微滤膜。 2.合成高分子材料