从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶
从肝脏中分离纯化一种酶
四.酶的分离
1.等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低， 及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的 pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。 在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性 电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子 能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH，把 目的酶和杂蛋白分开。
实验步骤：装柱；平衡；上样；洗脱；收集
五.酶的纯化、精制
真空干燥 冷冻干燥：冷冻干燥是先将酶液降温到冰点以 下，使之冻结成固态，然后在低温下抽真空， 使冰直接升华为气体，而得到干燥的酶制剂。 冷冻干燥得到的酶质量较高，结构保持完整， 活力损失少，但是成本较高。特别适用于对 热非常敏感而价值较高的酶类的干燥。 实验步骤：先将酶在-80℃环境下预冻1到2 小时然后把样品置于冷冻干燥剂的干燥箱中， 开始冷冻干燥，时间一般为8到20小时。待冻 干物称酥块状或松散片状即可停止。
实验步骤
取家兔肝脏2g，在冰块中用剪刀剪碎，移 入插在冰块中的匀浆器中，加入生理盐水 10ml进行匀浆，再经32层纱布过滤，得到 匀浆液。
物理破碎法：冻融法、渗透压法和超声波破碎法均可。使 用冻融法应注意不能在过高的温度下操作，以免引起酶的 变性失活。 化学破碎法：常用的化学试剂有：① 有机试剂② 表面活 性剂③ 螯合剂等。他们都可以增加细胞膜的通透性，使 酶容易释放。
实验步骤：将盐析操作中的滤液置于烧杯中，一边搅拌，
一边利用ph计测量酸碱度，用盐酸调整ph至6.2.然后倒置离 心管中以6000r/min离心15min弃去上清液，得到目的酶蛋白。
2.离子交换柱层析法 酶提取液中含有目的酶以及其他杂质。可用柱层析法进 行进一步的分离。 将交换剂缓冲液的ph调节到目的酶的PL与杂质蛋白的PL 之间使其中一类蛋白吸附在交换剂或者虑过层析柱从而 达到分离的目的。
从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶
2.离子交换柱层析法 酶提取液中含有目的 酶以及其他杂质。可 用柱层析法进行进一 步的分离。 将交换剂缓冲液的ph 调节到目的酶的PL与 杂质蛋白的PL之间使 其中一类蛋白吸附在 交换剂或者虑过层析 柱从而达到分离的目 的。
五.酶的纯化、精制
1.结晶：
结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程，不仅 为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而 且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。通常 酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。常用方 法有盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶 法、等电点结晶法 由于本实验目的产物为酶，故采用盐析结晶法。 原因：主要用于大分子如蛋白质、酶、多肽等的结 晶。特点：不耐热，对pH变化及有机溶剂十分敏感。 用中性盐作为沉淀剂，安全、操作简单。盐析结晶 法操作包括：加固体盐法；饱和盐溶液；透析扩散 法。 有机溶剂结晶法：针对小分子物质的结晶。 等电点结晶法：多用于一些两性物质。
冷冻干燥：冷冻干燥是先将酶液降温到冰点以下，
使之冻结成固态，然后在低温下抽真空，使冰直接升华为 气体，而得到干燥的酶制剂。冷冻干燥得到的酶质量较高， 结构保持完整，活力损失少，但是成本较高。特别适用于 对热非常敏感而价值较高的酶类的干燥。
六.酶纯度的检验
对该酶进行SDSPAGE电泳，因本实 验目的酶含有三个 不同亚基，所以若 仅出现3条色带， 则说明酶的纯化成 功。
四.酶的分离
常用的酶分离方法有沉淀法、层析法、电泳法、离心法、过滤 和膜分离法、萃取法等。 1.等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低， 及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的 pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。 在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性 电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子 能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH，把 目的酶和杂蛋白分开。但由于蛋白质在pI点附件一定范围的 pH内都可发生沉淀，只是沉淀的程度很不一样，而且相当多 的蛋白质的pI点很靠近，所以该法的回收率和纯化倍数都不 理想，一般只用于酶的粗分离阶段。
实验一 动物肝脏组织中基因组DNA提取和鉴定-精
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核酸提取的主要步骤
• 破碎细胞：研磨、组织匀浆、超声、冻融；异硫氰酸胍、 碱裂解；酶解（溶菌酶）
• 除去与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子： 酚/氯仿抽提、蛋白变性剂（SDS、异硫氰酸胍等）、蛋白 酶处理、高盐洗涤 • 除去其它不需要的核酸分子
• 沉淀核酸RNA。
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核酸的理化性质
在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在。 溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。 在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来。
3
基因组DNA的提取方法
浓盐法：利用RNA和DNA在不同盐浓度溶液中的溶解度 不同将二者分离。
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四、实验步骤
1、DNA的提取 （7）将混合液转移至50mL刻度离心管中， 3500r/min离心 10min ，取上清至一个新的50mL刻度离心管。 （8）加入20mL95%乙醇溶液，上下颠倒混匀后，出现丝状 物，用枪头挑取丝状物，或者3500r/min离心5min 。 （9）弃去上清液（注意：缓慢倒去上清液），沉淀物质即 为DNA，空气干燥后即可加入适量的TE缓冲液。
9
四、实验步骤
1、DNA的提取 （1）称取5g鸡肝，置于预冷的研钵中，在冰浴中剪碎，加 入10mL预冷的0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA溶液，研磨 成匀浆液。 （2）将匀浆液加入到15mL刻度离心管中，2000r/min离心 10min，弃去上清液。 （3）将沉淀转移至50mL离心管中，加入10mL预冷的 0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA溶液，充分摇匀后，于 4℃ 2000r/min离心10min，弃去上清液。
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动物肝脏DNA提取和鉴定
整个操作步骤应尽量简化，缩短实验过程，减少核酸变性、降解、机械切割的机会。
核酸提取过程中的注意事项：
01
加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的DNA。
02
保存：将DNA于滤纸上干燥，溶于1mlTE中低温保存。
03
纯的DNA样品的获得
琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。 琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。琼脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶，电泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比琼脂少，电渗作用降低，因而分离效果明显提高。
溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10ng甚至更少的DNA。
01
02
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琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素
（1）核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 凝胶中，DNA片段迁移率与DNA分子大小(碱基对的对数)成反比(≤ 20kb) ，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。 （2）核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为：闭环DNA>直线DNA>开环的双链环状DNA. （3）不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 琼脂糖浓度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线状DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-0.2 2-0.1 注：DNA片段在5-500bp之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行电泳分离。
酶的分离纯化方法
酶的分离纯化方法-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1酶的分离纯化方法摘要酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。
一个特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行摸索，很少有通用的规律可循。
本文从酶原料选择、酶的分离与纯化、酶纯度的评价三个方面进行总结，列举了一些常用的分离纯化方法。
关键词酶、分离纯化、方法、纯度中图分类号O6酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。
一个特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行摸索，很少有通用的规律可循。
酶的纯化过程与一般的蛋白质纯化过程相比，又有其本身独有的特点：一是酶一般取自生物细胞，而特定的一种酶在细胞中的含量很少；二是酶可以通过测定活力的方法加以跟踪，前者给纯化带来了困难，而后者却能使我们迅速找出纯化过程的关键所在。
1 酶原料选择提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
但是由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
2 酶的分离纯化由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。
酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。
酶的分离纯化方法(基础教学)
酶的分离纯化方法摘要酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。
一个特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行摸索，很少有通用的规律可循。
本文从酶原料选择、酶的分离与纯化、酶纯度的评价三个方面进行总结，列举了一些常用的分离纯化方法。
关键词酶、分离纯化、方法、纯度中图分类号O6酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。
一个特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行摸索，很少有通用的规律可循。
酶的纯化过程与一般的蛋白质纯化过程相比，又有其本身独有的特点：一是酶一般取自生物细胞，而特定的一种酶在细胞中的含量很少；二是酶可以通过测定活力的方法加以跟踪，前者给纯化带来了困难，而后者却能使我们迅速找出纯化过程的关键所在。
1 酶原料选择提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
但是由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
2 酶的分离纯化由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。
酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。
酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
动物肝脏中dna的提取和鉴定
动物肝脏中DNA的提取和鉴定一、实验目的1.学习并掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。
2.掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。
3.学习核酸染色的方法。
二、实验原理为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提取DNA。
由于DNA分子在生物体内的分布及浓度不同，要选择适当的材料提取DNA。
动植物中小牛胸腺、动物肝脏、脾脏、鱼类精子、植物种子的胚中都含有丰富的DNA。
微生物中，谷氨酸菌体含7%～10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠杆菌9%～10%。
从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。
对于低等生物，如从病毒中提取DNA比较容易，多数病毒DNA相对分子量较小，提取时易保持其结构完整性。
从细菌及高等动植物中提取DNA难度大些。
细菌DNA相对分子质量较大，一般达2×109Da。
因此易被机械张力剪短。
细菌DNA，除核DNA外，还有质粒DNA等。
1.DNA的基本功能生物遗传信息复制的模板和基因转入的模板，是生命遗传繁殖的物质基础，也是个体生命活动的基础；作为DNA分子中的某一区段，有复制、转录和翻译等主要功能称为基因。
2.核酸的结构与功能核酸（nucleic acid)是以核苷酸为基本组成的生物大分子。
天然存在的核酸有两类，一类为脱氧核苷酸（deoxyribonucleic acid,DNA)，另一类为核糖核酸（ribonucleic acid,RNA)。
DNA存在于细胞核和线粒体中，携带遗传信息。
RNA存在于细胞质和细胞核内，参与细胞内DNA遗传信息的表达。
3.DNA的存在形式天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白（DNP）形式存在于细胞核中。
要从细胞核中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖、RNA及无机离子等，从中分离DNA。
DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。
DNP在低浓度盐溶液中几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠溶液中溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中溶解度很大，比纯水高2倍。
小鼠肝脏RNA的提取纯化与鉴定
分子生物学实验报告一、实验时间：2011年11月21日10:00—17:30二、实验内容：小鼠肝脏RNA的提取纯化与鉴定三、实验目的：了解总RNA提取的基本原理、应用及操作的注意事项，熟悉掌握组织中总RNA提取方法及其检测方法。
四、实验原理：在真核生物，由于绝大多数基因含有内含子，因此不能直接由基因组克隆目的基因，提取RNA并逆转录形成cDNA或构建cDNA文库是获取真核生物表达基因的主要手段，此外，在利用Northern印迹杂交等技术分析基因表达水平时也需要提取RNA。
本实验要求自小鼠肝脏提取RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳进行检测，通过紫外分光光度法进行定量。
RNA是极易降解的核酸分子，这主要是因为RNA酶分布广、活性强、且难以失活，痕量的RNA酶就能够造成严重的RNA降解。
抑制RNA酶活性的方法很多，但均不能彻底避免RNA酶对RNA的降解。
焦磷酸二乙酯（DEPC）是一种强烈的烷化剂，它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制RNA酶的活性。
DEPC是消除外源性RNA酶的主要方法。
以0.1%DEPC处理实验器皿与试剂配制用水，基本可以消除外源RNA酶的污染。
但DEPC具有致癌性，在使用时一定要留意。
DEPC处理的器皿与水必须经高压灭菌处理，使DEPC 分解后方能使用。
值得注意的是，DEPC具有很强的反应性，能够与包括RNA在内的多种生物分子以及多种化学试剂作用，因此不能直接用于抑制样品以及试剂中的RNA酶活性。
在RNA抽提试剂中加入异硫氰酸胍，是抑制样品来源RNA酶活性的主要方法。
作为一种蛋白变性剂，异硫氰酸胍可导致包括RNA 酶在内的所有酶活性的丧失，因此RNA纯化过程中因尽可能去除异硫氰酸胍，以防止其对酶促反应的影响。
在使用蛋白质变性剂的同时，更重要的是去除样品中的蛋白质，防止内源性RNA酶对样品RNA的降解。
逆转录反应时，反应体系中不能含有烷化剂或变性剂，此时痕量的RNA酶也可能对RNA产生破坏。
动物肝脏中dna的提取和鉴定
动物肝脏中DNA的提取和鉴定一、实验目的1.学习并掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。
2.掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。
3.学习核酸染色的方法。
二、实验原理为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提取DNA。
由于DNA分子在生物体内的分布及浓度不同，要选择适当的材料提取DNA。
动植物中小牛胸腺、动物肝脏、脾脏、鱼类精子、植物种子的胚中都含有丰富的DNA。
微生物中，谷氨酸菌体含7%～10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠杆菌9%～10%。
从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。
对于低等生物，如从病毒中提取DNA比较容易，多数病毒DNA相对分子量较小，提取时易保持其结构完整性。
从细菌及高等动植物中提取DNA难度大些。
细菌DNA相对分子质量较大，一般达2×109Da。
因此易被机械张力剪短。
细菌DNA，除核DNA外，还有质粒DNA等。
1.DNA的基本功能生物遗传信息复制的模板和基因转入的模板，是生命遗传繁殖的物质基础，也是个体生命活动的基础；作为DNA分子中的某一区段，有复制、转录和翻译等主要功能称为基因。
2.核酸的结构与功能核酸（nucleic acid)是以核苷酸为基本组成的生物大分子。
天然存在的核酸有两类，一类为脱氧核苷酸（deoxyribonucleic acid,DNA)，另一类为核糖核酸（ribonucleic acid,RNA)。
DNA存在于细胞核和线粒体中，携带遗传信息。
RNA存在于细胞质和细胞核内，参与细胞内DNA遗传信息的表达。
3.DNA的存在形式天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白（DNP）形式存在于细胞核中。
要从细胞核中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖、RNA及无机离子等，从中分离DNA。
DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。
DNP在低浓度盐溶液中几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠溶液中溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中溶解度很大，比纯水高2倍。
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❖ 知识就是财富 ❖ 丰富你的人生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
从动物肝组织中分离、提取、纯化和 鉴定一种酶
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6、黄金时代是在我们的前面，而不在 我们的 后面。
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7、心急吃不了热汤圆。
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8、你可以很有个性，但某些时候请收 敛。
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9、只为成功找方法，不为失败找借口 (蹩脚 的工人 总是说 工具不 好)。
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10、只要下定决心克服恐惧，便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为，请 记住， 除了在 脑海中 ，恐惧 无处藏 身。-- 戴尔． 卡耐基 。
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从动物肝组织中分离、提取、纯化和 鉴定一种酶
1、战鼓一响，法律无声。——英国 2、任何法律的根本；不，不成文法本 身就是 讲道理 ……法 律，也 ----即 明示道 理。— —爱·科 克
3、法律是最保险的头盔。——爱·科 克 4、一个国家如果纲纪不正，其国风一 定颓败 。—— 塞内加 5、法律不能使人人平等，但是在法律 面前人 人是平 等的。 ——波 洛克
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
从动物肝脏组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶(由三个不同亚基组装成,为结合酶,等电点为6.2)的技术路线 p
• 除核酸：除核酸的常用方法是沉淀法。
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4.2.3酶的提取
• 盐溶液提取：适用于大多数酶。盐溶现象： 大多数P酶在低浓度的盐存在的条件下，酶 的溶解度随盐浓度的升高而增加。盐析现 象：在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解 度随盐浓度升高而降低。
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4.2.4酶的分离
• 等电点沉淀法：已知所需酶的pI=6.2，故适宜采用此种方法 进行分离。
• 等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低， 及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的 pH 值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。 在溶液的pH 值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两 性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分 子能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH ， 把目的酶和杂蛋白分开。但由于蛋白质在pI 点附件一定范 围的pH 内都可发生沉淀，只是沉淀的程度很不一样，而且 相当多的蛋白质的pI 点很靠近，所以该法的回收率和纯化 倍数都不理想，一般只用于酶的粗分离阶段。
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4.3.6纯度的检验
• 酶纯度的检验：对该酶进行SDSPAGE 电泳，若仅出现3条色带， 则说明酶以纯化成功。
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请老师和同学们批评指正！
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4.1.2核酸的分离纯化——DNA
①先将饥饿数天的实验动物杀死以除去肝糖原； ②然后利用淀粉酶除去多糖； ③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取 液，以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成 DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之 与多糖分离； ④利用去污剂或氯仿-戊/辛醇或苯酚处理后除去蛋白 质； ⑤利用胰脏核糖核酸酶或钙盐或活性炭除去RNA。
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2.浓缩： 2.浓缩： 浓缩
从低浓度酶液中除去部分水或其他溶剂而成为高浓 度酶液的过程。浓缩的方法很多，离心分离、 度酶液的过程。浓缩的方法很多，离心分离、过滤 与膜分离、沉淀分离、 与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作 用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、 用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶 等吸去水分，也可以达到浓缩效果。 等吸去水分，也可以达到浓缩效果。 本实验采用真空蒸发浓缩法。 本实验采用真空蒸发浓缩法。 真空蒸发浓缩：在一定的真空条件下， 真空蒸发浓缩：在一定的真空条件下，使酶液在 60℃以下汽化蒸发，进行浓缩的过程。 一般说来， 60℃以下汽化蒸发，进行浓缩的过程。 一般说来， 以下汽化蒸发 在不影响酶活力的前提下，适当提高温度、 在不影响酶活力的前提下，适当提高温度、降低压 增大蒸发面积都可以使蒸发速度提高。 力、增大蒸发面积都可以使蒸发速度提高。
10级七年二班 10级七年二班 第五组
材料的选择
因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂 核酸的物质，所以取饥饿24 24小时 质、核酸的物质，所以取饥饿24小时 的动物肝脏为实验材料。 的动物肝脏为实验材料。
1. 细胞破碎
材料的预处理
机械破碎法：可选用捣碎法或匀浆法。 机械破碎法：可选用捣碎法或匀浆法。 捣碎法 使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞团用 使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞团用 大块的组织或者细胞团 组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。 组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。 研磨法常用于微生物 植物组织细胞的破碎故 微生物和 研磨法常用于微生物和植物组织细胞的破碎故 本实验不采用。 本实验不采用。 物理破碎法：冻融法、 物理破碎法：冻融法、渗透压法和超声波破碎法均 可。 使用冻融法应注意不能 过高的温度下操作 不能在 的温度下操作， 使用冻融法应注意不能在过高的温度下操作， 以免引起酶的变性失活。 以免引起酶的变性失活。 在冷库中进行， 使用超声波破碎法应注意操作需在冷库中进行 使用超声波破碎法应注意操作需在冷库中进行， 或将样品置于冰浴中，并采用问歇操作， 或将样品置于冰浴中，并采用问歇操作，如破碎 30～60 s，间歇1 min，如此反复进行。 30～ s，间歇1 min，如此反复进行。 化学破碎法：常用的化学试剂 化学试剂有 化学破碎法：常用的化学试剂有：① 有机试剂 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）； ）；② （甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）；② 表面活性剂 Tween、特里顿（Triton） ）；③ （Tween、特里顿（Triton）等）；③ 螯合剂 EDTA：乙二胺四乙酸） 他们都可以增加细胞膜 （EDTA：乙二胺四乙酸）等。他们都可以增加细胞膜 的通透性，是酶容易释放。 的通透性，是酶容易释放。 酶溶法：因对此肝酶不了解故不采用此方法。 酶溶法：因对此肝酶不了解故不采用此方法。
其他沉淀法：盐析法、有机溶剂沉淀法、 其他沉淀法：盐析法、有机溶剂沉淀法、 复合沉淀法需根据酶的种类配置合适浓度的溶 故无法采用。热处理沉淀法同样不宜。 液，故无法采用。热处理沉淀法同样不宜。 电泳法：对该酶的带电量不了解。（ 。（等点 电泳法：对该酶的带电量不了解。（等点 凝胶电泳：会使该酶的亚基分开而不能采用）。 凝胶电泳：会使该酶的亚基分开而不能采用）。 层析法：对酶和层析柱的吸附效果不了解， 层析法：对酶和层析柱的吸附效果不了解， 无法进行分离。 无法进行分离。 离心法：对酶的大小密度不了解， 离心法：对酶的大小密度不了解，无法知 道所需酶的位置。 道所需酶的位置。 过滤法、膜分离法：对酶的大小不了解。 过滤法、膜分离法：对酶的大小不了解。 萃取分离法：对酶的溶解度不了解。 萃取分离法：对酶的溶解度不了解。
高酶的提取率。但是过量的提取液，会使酶的浓度 酶的提取率。但是过量的提取液， 降低，对进一步的分离纯化不利。因此， 降低，对进一步的分离纯化不利。因此，控制提取 原料体积的3 液的总量一般为原料体积的 液的总沉淀法、层析法、电泳法、离心法、过滤和 常用的酶分离方法有沉淀法、层析法、电泳法、离心法、过滤和膜分 沉淀法 离法、萃取法等 离法、萃取法等。 因本实验中对此种酶的了解有限，故应采用等电点沉淀法 等电点沉淀法。 因本实验中对此种酶的了解有限，故应采用等电点沉淀法。 已知所需酶的pI=6.2 故适宜采用此种方法进行分离。 pI=6.2， 已知所需酶的pI=6.2，故适宜采用此种方法进行分离。 等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低 两性电解质在等电点时溶解度最低， 等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，及 不同两性电解质的等电点不同这一特性 通过调节溶液的pH 这一特性， pH值 不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的pH值， 使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。在溶液的pH 使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。在溶液的pH 值等于溶液中某两性电解质的等电点时， 值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性电解质分子的净 电荷为零，分子间的静电斥力消除， 电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀 下来。因此可以通过调节介质的pH，把目的酶和杂蛋白分开。 调节介质的pH 下来。因此可以通过调节介质的pH，把目的酶和杂蛋白分开。但 由于蛋白质在pI点附件一定范围的pH内都可发生沉淀， pI点附件一定范围的pH内都可发生沉淀 由于蛋白质在pI点附件一定范围的pH内都可发生沉淀， 只是沉淀的程度很不一样，而且相当多的蛋白质的pI 只是沉淀的程度很不一样，而且相当多的蛋白质的pI 点很靠近，所以该法的回收率和纯化倍数都不理想， 点很靠近，所以该法的回收率和纯化倍数都不理想， 一般只用于酶的粗分离阶段。。 一般只用于酶的粗分离阶段。。
2.防止蛋白酶的水解作用 2.防止蛋白酶的水解作用： 防止蛋白酶的水解作用： 预防的措施是加入蛋白酶抑制剂。 预防的措施是加入蛋白酶抑制剂。常用的丝氨 蛋白酶抑制剂 酸蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（PMSF）、 酸蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（PMSF）、 二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有EDTA 二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有EDTA EGTA（乙二醇四乙酸） 和EGTA（乙二醇四乙酸） 3.除核酸 3.除核酸： 除核酸： 一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸污 除核酸的常用方法是沉淀法 沉淀法， 染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀剂的 选择需要大量的试验来选定， 选择需要大量的试验来选定，已知的有 1%~2%的链霉素硫酸盐 PEG、溶菌酶等。 的链霉素硫酸盐、 1%~2%的链霉素硫酸盐、PEG、溶菌酶等。
冷冻干燥：冷冻干燥是先将酶液降温到冰点以下， 冷冻干燥是先将酶液降温到冰点以下 酶液降温到冰点以下，
使之冻结成固态，然后在低温下抽真空， 使之冻结成固态，然后在低温下抽真空，使冰直接升华为 气体，而得到干燥的酶制剂。冷冻干燥得到的酶质量较高， 气体，而得到干燥的酶制剂。冷冻干燥得到的酶质量较高， 结构保持完整，活力损失少，但是成本较高。 结构保持完整，活力损失少，但是成本较高。特别适用于 对热非常敏感而价值较高的酶类的干燥。 对热非常敏感而价值较高的酶类的干燥。
喷雾干燥： 喷雾干燥：喷雾干燥是通过喷雾装置将酶液喷成 直径仅为几十微米的雾滴，分散于热气流中， 直径仅为几十微米的雾滴，分散于热气流中，水 分迅速蒸发而得到粉末状的干燥酶制剂。 分迅速蒸发而得到粉末状的干燥酶制剂。喷雾干 燥由于酶液分散成为雾滴，直径小，表面积大， 燥由于酶液分散成为雾滴，直径小，表面积大， 水分迅速蒸发，只需几秒钟就可以达到干燥。 水分迅速蒸发，只需几秒钟就可以达到干燥。在 于燥过程中，由于水分迅速蒸发，吸收大量热量， 于燥过程中，由于水分迅速蒸发，吸收大量热量， 使雾滴及其周围的空气温度比气流进口处的温度 只要控制好气流进口温度， 低，只要控制好气流进口温度，就可以减少酶在 干燥过程中的变性失活。 干燥过程中的变性失活。
酶的提取
1.常用方法 盐溶液提取、酸溶液提取、 1.常用方法：盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶
剂提取。 剂提取。 本实验中因缺乏酶的更多信息，故采用盐溶液提取法 盐溶液提取法。 本实验中因缺乏酶的更多信息，故采用盐溶液提取法。 盐溶液提取：适用于大多数酶。盐溶现象： 盐溶液提取：适用于大多数酶。盐溶现象：大多数 酶在低浓度的盐存在的条件下， P酶在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的 升高而增加。盐析现象：在盐浓度达到某一界限后， 升高而增加。盐析现象：在盐浓度达到某一界限后，酶 的溶解度随盐浓度升高而降低。 的溶解度随盐浓度升高而降低。 影响酶提取的主要因素： 影响酶提取的主要因素： 酶在所使用溶剂中的溶解度 溶解度； 酶在所使用溶剂中的溶解度； 酶向溶剂扩散的速度 扩散的速度： 酶向溶剂扩散的速度：酶向溶剂扩散的速度与温度 ）、黏度 黏度（ ）、扩散面积 扩散面积（ ）、扩散距离 扩散距离（ （↗）、黏度（↘）、扩散面积（↗）、扩散距离（↘） 及两相间的浓度差（ 有密切关系； 及两相间的浓度差（↗）有密切关系； 温度：在不影响酶活性的条件下，适当提高温度， 温度：在不影响酶活性的条件下，适当提高温度， 有利于酶的提取。适当提高温度 可以提高酶的溶解度 提高温度， 提高酶的溶解度， 有利于酶的提取。适当提高温度，可以提高酶的溶解度， 也可以增大酶分子的扩散速度 但是温度过高， 增大酶分子的扩散速度， 也可以增大酶分子的扩散速度，但是温度过高，易引起 酶的变性失活，所以提取时温度不宜过高。 酶的变性失活，所以提取时温度不宜过高。
pH值 提取时，溶液的pH值不宜过高或过低， pH值：提取时，溶液的pH值不宜过高或过低， pH值不宜过高
以免引起酶的变性失活， 避开酶的等电点。 以免引起酶的变性失活，并避开酶的等电点。当pH 值等于某酶的等电点时，酶分子的溶解度最小。 值等于某酶的等电点时，酶分子的溶解度最小。
提取液的体积：增加提取液的用量，可以提 增加提取液的用量 可以提 提取液的用量，
真空干燥：真空干燥是在与真空系统相连接的密
闭干燥器中，一边抽真空一边加热，使酶液在较低的温度 闭干燥器中，一边抽真空一边加热， 条件下蒸发干燥的过程。 蒸发干燥的过程 条件下蒸发干燥的过程。在真空泵之前需要设置水蒸气凝 结收集器，以免汽化产生的水蒸气进入真空泵。 结收集器，以免汽化产生的水蒸气进入真空泵。酶液真空 干燥的温度一般控制在60℃以下。 60℃以下 干燥的温度一般控制在60℃以下。