从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶

2.防止蛋白酶的水解作用 2.防止蛋白酶的水解作用： 防止蛋白酶的水解作用： 预防的措施是加入蛋白酶抑制剂。 预防的措施是加入蛋白酶抑制剂。常用的丝氨 蛋白酶抑制剂 酸蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（PMSF）、 酸蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（PMSF）、 二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有EDTA 二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有EDTA EGTA（乙二醇四乙酸） 和EGTA（乙二醇四乙酸） 3.除核酸 3.除核酸： 除核酸： 一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸污 除核酸的常用方法是沉淀法 沉淀法， 染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀剂的 选择需要大量的试验来选定， 选择需要大量的试验来选定，已知的有 1%~2%的链霉素硫酸盐 PEG、溶菌酶等。 的链霉素硫酸盐、 1%~2%的链霉素硫酸盐、PEG、溶菌酶等。
pH值 提取时，溶液的pH值不宜过高或过低， pH值：提取时，溶液的pH值不宜过高或过低， pH值不宜过高
以免引起酶的变性失活， 避开酶的等电点。 以免引起酶的变性失活，并避开酶的等电点。当pH 值等于某酶的等电点时，酶分子的溶解度最小。 值等于某酶的等电点时，酶分子的溶解度最小。
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提取液的体积：增加提取液的用量，可以提 增加提取液的用量 可以提 提取液的用量，
真空干燥：真空干燥是在与真空系统相连接的密
闭干燥器中，一边抽真空一边加热，使酶液在较低的温度 闭干燥器中，一边抽真空一边加热， 条件下蒸发干燥的过程。 蒸发干燥的过程 条件下蒸发干燥的过程。在真空泵之前需要设置水蒸气凝 结收集器，以免汽化产生的水蒸气进入真空泵。 结收集器，以免汽化产生的水蒸气进入真空泵。酶液真空 干燥的温度一般控制在60℃以下。 60℃以下 干燥的温度一般控制在60℃以下。
酶的提取
1.常用方法 盐溶液提取、酸溶液提取、 1.常用方法：盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶
剂提取。 剂提取。 本实验中因缺乏酶的更多信息，故采用盐溶液提取法 盐溶液提取法。 本实验中因缺乏酶的更多信息，故采用盐溶液提取法。 盐溶液提取：适用于大多数酶。盐溶现象： 盐溶液提取：适用于大多数酶。盐溶现象：大多数 酶在低浓度的盐存在的条件下， P酶在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的 升高而增加。盐析现象：在盐浓度达到某一界限后， 升高而增加。盐析现象：在盐浓度达到某一界限后，酶 的溶解度随盐浓度升高而降低。 的溶解度随盐浓度升高而降低。 影响酶提取的主要因素： 影响酶提取的主要因素： 酶在所使用溶剂中的溶解度 溶解度； 酶在所使用溶剂中的溶解度； 酶向溶剂扩散的速度 扩散的速度： 酶向溶剂扩散的速度：酶向溶剂扩散的速度与温度 ）、黏度 黏度（ ）、扩散面积 扩散面积（ ）、扩散距离 扩散距离（ （↗）、黏度（↘）、扩散面积（↗）、扩散距离（↘） 及两相间的浓度差（ 有密切关系； 及两相间的浓度差（↗）有密切关系； 温度：在不影响酶活性的条件下，适当提高温度， 温度：在不影响酶活性的条件下，适当提高温度， 有利于酶的提取。适当提高温度 可以提高酶的溶解度 提高温度， 提高酶的溶解度， 有利于酶的提取。适当提高温度，可以提高酶的溶解度， 也可以增大酶分子的扩散速度 但是温度过高， 增大酶分子的扩散速度， 也可以增大酶分子的扩散速度，但是温度过高，易引起 酶的变性失活，所以提取时温度不宜过高。 酶的变性失活，所以提取时温度不宜过高。
3.干燥 3.干燥： 干燥：
将固体、半固体或浓缩液中的水分或其他溶剂除去一部分， 将固体、半固体或浓缩液中的水分或其他溶剂除去一部分， 以获得含水分较少的固体物质的过程。 以获得含水分较少的固体物质的过程。 常用方法有真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、 常用方法有真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥和 吸附干燥等。本实验采取任何一种均可。 吸附干燥等。本实验采取任何一种均可。
10级七年二班 10级七年二班 第五组
材料的选择
因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂 核酸的物质，所以取饥饿24 24小时 质、核酸的物质，所以取饥饿24小时 的动物肝脏为实验材料。 的动物肝脏为实验材料。
1. 细胞破碎
材料的预处理
机械破碎法：可选用捣碎法或匀浆法。 机械破碎法：可选用捣碎法或匀浆法。 捣碎法 使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞团用 使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞团用 大块的组织或者细胞团 组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。 组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。 研磨法常用于微生物 植物组织细胞的破碎故 微生物和 研磨法常用于微生物和植物组织细胞的破碎故 本实验不采用。 本实验不采用。 物理破碎法：冻融法、 物理破碎法：冻融法、渗透压法和超声波破碎法均 可。 使用冻融法应注意不能 过高的温度下操作 不能在 的温度下操作， 使用冻融法应注意不能在过高的温度下操作， 以免引起酶的变性失活。 以免引起酶的变性失活。 在冷库中进行， 使用超声波破碎法应注意操作需在冷库中进行 使用超声波破碎法应注意操作需在冷库中进行， 或将样品置于冰浴中，并采用问歇操作， 或将样品置于冰浴中，并采用问歇操作，如破碎 30～60 s，间歇1 min，如此反复进行。 30～ s，间歇1 min，如此反复进行。 化学破碎法：常用的化学试剂 化学试剂有 化学破碎法：常用的化学试剂有：① 有机试剂 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）； ）；② （甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）；② 表面活性剂 Tween、特里顿（Triton） ）；③ （Tween、特里顿（Triton）等）；③ 螯合剂 EDTA：乙二胺四乙酸） 他们都可以增加细胞膜 （EDTA：乙二胺四乙酸）等。他们都可以增加细胞膜 的通透性，是酶容易释放。 的通透性，是酶容易释放。 酶溶法：因对此肝酶不了解故不采用此方法。 酶溶法：因对此肝酶不了解故不采用此方法。
喷雾干燥： 喷雾干燥：喷雾干燥是通过喷雾装置将酶液喷成 直径仅为几十微米的雾滴，分散于热气流中， 直径仅为几十微米的雾滴，分散于热气流中，水 分迅速蒸发而得到粉末状的干燥酶制剂。 分迅速蒸发而得到粉末状的干燥酶制剂。喷雾干 燥由于酶液分散成为雾滴，直径小，表面积大， 燥由于酶液分散成为雾滴，直径小，表面积大， 水分迅速蒸发，只需几秒钟就可以达到干燥。 水分迅速蒸发，只需几秒钟就可以达到干燥。在 于燥过程中，由于水分迅速蒸发，吸收大量热量， 于燥过程中，由于水分迅速蒸发，吸收大量热量， 使雾滴及其周围的空气温度比气流进口处的温度 只要控制好气流进口温度， 低，只要控制好气流进口温度，就可以减少酶在 干燥过程中的变性失活。 干燥过程中的变性失活。
2.浓缩： 2.浓缩： 浓缩
从低浓度酶液中除去部分水或其他溶剂而成为高浓 度酶液的过程。浓缩的方法很多，离心分离、 度酶液的过程。浓缩的方法很多，离心分离、过滤 与膜分离、沉淀分离、 与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作 用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、 用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶 等吸去水分，也可以达到浓缩效果。 等吸去水分，也可以达到浓缩效果。 本实验采用真空蒸发浓缩法。 本实验采用真空蒸发浓缩法。 真空蒸发浓缩：在一定的真空条件下， 真空蒸发浓缩：在一定的真空条件下，使酶液在 60℃以下汽化蒸发，进行浓缩的过程。 一般说来， 60℃以下汽化蒸发，进行浓缩的过程。 一般说来， 以下汽化蒸发 在不影响酶活力的前提下，适当提高温度、 在不影响酶活力的前提下，适当提高温度、降低压 增大蒸发面积都可以使蒸发速度提高。 力、增大蒸发面积都可以使蒸发速度提高。
高酶的提取率。但是过量的提取液，会使酶的浓度 酶的提取率。但是过量的提取液， 降低，对进一步的分离纯化不利。因此， 降低，对进一步的分离纯化不利。因此，控制提取 原料体积的3 液的总量一般为原料体积的 液的总量一般为原料体积的3～5倍。
酶的分离
常用的酶分离方法有沉淀法、层析法、电泳法、离心法、过滤和 常用的酶分离方法有沉淀法、层析法、电泳法、离心法、过滤和膜分 沉淀法 离法、萃取法等 离法、萃取法等。 因本实验中对此种酶的了解有限，故应采用等电点沉淀法 等电点沉淀法。 因本实验中对此种酶的了解有限，故应采用等电点沉淀法。 已知所需酶的pI=6.2 故适宜采用此种方法进行分离。 pI=6.2， 已知所需酶的pI=6.2，故适宜采用此种方法进行分离。 等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低 两性电解质在等电点时溶解度最低， 等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，及 不同两性电解质的等电点不同这一特性 通过调节溶液的pH 这一特性， pH值 不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的pH值， 使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。在溶液的pH 使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。在溶液的pH 值等于溶液中某两性电解质的等电点时， 值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性电解质分子的净 电荷为零，分子间的静电斥力消除， 电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀 下来。因此可以通过调节介质的pH，把目的酶和杂蛋白分开。 调节介质的pH 下来。因此可以通过调节介质的pH，把目的酶和杂蛋白分开。但 由于蛋白质在pI点附件一定范围的pH内都可发生沉淀， pI点附件一定范围的pH内都可发生沉淀 由于蛋白质在pI点附件一定范围的pH内都可发生沉淀， 只是沉淀的程度很不一样，而且相当多的蛋白质的pI 只是沉淀的程度很不一样，而且相当多的蛋白质的pI 点很靠近，所以该法的回收率和纯化倍数都不理想， 点很靠近，所以该法的回收率和纯化倍数都不理想， 一般只用于酶的粗分离阶段。。 一般只用于酶的粗分离阶段。。
冷冻干燥：冷冻干燥是先将酶液降温到冰点以下， 冷冻干燥是先将酶液降温到冰点以下 酶液降温到冰点以下，
使之冻结成固态，然后在低温下抽真空， 使之冻结成固态，然后在低温下抽真空，使冰直接升华为 气体，而得到干燥的酶制剂。冷冻干燥得到的酶质量较高， 气体，而得到干燥的酶制剂。冷冻干燥得到的酶质量较高， 结构保持完整，活力损失少，但是成本较高。 结构保持完整，活力损失少，但是成本较高。特别适用于 对热非常敏感而价值较高的酶类的干燥。 对热非常敏感而价值较高的酶类的干燥。
其他沉淀法：盐析法、有机溶剂沉淀法、 其他沉淀法：盐析法、有机溶剂沉淀法、 复合沉淀法需根据酶的种类配置合适浓度的溶 故无法采用。热处理沉淀法同样不宜。 液，故无法采用。热处理沉淀法同样不宜。 电泳法：对该酶的带电量不了解。（ 。（等点 电泳法：对该酶的带电量不了解。（等点 凝胶电泳：会使该酶的亚基分开而不能采用）。 凝胶电泳：会使该酶的亚基分开而不能采用）。 层析法：对酶和层析柱的吸附效果不了解， 层析法：对酶和层析柱的吸附效果不了解， 无法进行分离。 无法进行分离。 离心法：对酶的大小密度不了解， 离心法：对酶的大小密度不了解，无法知 道所需酶的位置。 道所需酶的位置。 过滤法、膜分离法：对酶的大小不了解。 过滤法、膜分离法：对酶的大小不了解。 萃取分离法：对酶的溶解度不了解。 萃取分离法：对酶的溶解度不了解。
酶的纯化、 酶的纯化、精制
1.结晶 1.结晶：
结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程， 结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程，不仅 为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品， 为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而 且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。 且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。通常 酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。 50%以上 酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。常用方 有盐析结晶法、有机溶剂结晶法、 法有盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶 法、等电点结晶法 由于本实验目的产物为酶，故采用盐析结晶法 盐析结晶法。 由于本实验目的产物为酶，故采用盐析结晶法。 原因：主要用于大分子如蛋白质、 原因：主要用于大分子如蛋白质、酶、多肽等的结 特点：不耐热， pH变化及有机溶剂十分敏感 变化及有机溶剂十分敏感。 晶。特点：不耐热，对pH变化及有机溶剂十分敏感。 用中性盐作为沉淀剂，安全、操作简单。 用中性盐作为沉淀剂，安全、操作简单。盐析结晶 法操作包括：加固体盐法；饱和盐溶液； 法操作包括：加固体盐法；饱和盐溶液；透析扩散 法。 有机溶剂结晶法：针对小分子物质的结晶。 有机溶剂结晶法：针对小分子物质的结晶。 等电点结晶法：多用于一些两性物质。 等电点结晶法：多用于一些两性物质。