酶的提取与分离纯化分享资料

7
2.高压匀浆法（High-pressure homogenization）
——大规模细胞破碎的常用方法
采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成，英国APV公司 和美国 Microfluidics公司均有产品出售）。
原理：
利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲 击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时， 每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环 上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动 过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成 细胞破碎。
空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的 冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪 切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。
一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌 的效果较差， 该法在实验室小规模细胞破碎中常用。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活A螯合剂
处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结 构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持， 一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落， 使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补， 从而导致内层膜通透性的增强。
(3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化， 可用制备式电泳 或 HPLC。
3
本章 目录
第二节：细胞破碎
许多酶存在于细胞内。为 JY92-II D超声波 了提取这些胞内酶，首先 需要对细胞进行破碎处理。 细胞粉碎机
1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
高 压 细 胞 破 碎 机
细 胞 破 碎 珠
4
细胞破碎方法及其原理
机械破碎
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
物理破碎 化学破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
酶促破碎
通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎
2
酶分离纯化不同阶段
酶的纯化过程，约可分为三 个阶段：
(1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质打破细胞 → 抽 出全蛋白，多使用 盐析沉淀 法；可以粗略去除蛋白质以 外的物质。
(2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用 各钟 柱层析法。
10
11
4.酶溶法（Enzymatic Lysis）
（1）外加酶法
常用的溶酶
溶菌酶、 溶菌酶主要用于细菌类 β-1，3-葡聚糖酶、 β-1，6-葡聚糖酶、 蛋白酶、 甘露糖酶、 糖苷酶、 肽键内切酶、 壳多糖酶等
细胞壁溶解酶是几种酶的复合物 12
利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学 组成选择适当的酶，并确定相应的次序。
13
（2）自溶法（Autolysis）
诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的 活力，以达到细胞自溶的目的。
影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激 活剂和细胞代谢途径等。
缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的 变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。
14
4.化学渗透法（Chemical permeation）
第六章 酶的提取和分离纯化
Go 1、酶的提取与分离纯化技术路线 Go 2、细胞破碎 Go 3、酶的提取 Go 4、酶的分离方法 Go 5、酶的组合分离纯化策略 Go 6、酶的浓缩、干燥与结晶
1
第一节 酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞
酶提取
发酵液
酶分离纯化
酶浓缩 酶贮存
离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、 抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透 性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。 该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。
15
（1）表面活性剂
可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。
如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有 很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子 层，使某些胞内物质释放出来。 其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可 使细胞破碎。
8
在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及 高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。
易造成堵塞的团状或丝状真菌， 较小的革兰氏阳性菌， 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）
不宜采用高压匀浆法。
9
3.超声破碎法（Ultrasonication）
在15-25 kHz的频率下操作。其原理可能与空化现象（cavitation phenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。
对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖 结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后 只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂， 释出胞内产物。
酶溶法的优点： 选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。
缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同 的酶），产物抑制的存在。 在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡 聚糖酶。
捣碎法 研磨法 匀浆法
温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法
有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween
自溶法 外加酶制剂法
5
本章 目录
1.珠磨法（Bead mill）
原理：
进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化 铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨 剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放 出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内， 浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹 套冷却的方式带走。
6
实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、 Braun匀浆器； 中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德 国西门子机械公司制造）。
珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分 子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不 易分离而给后续操作带来的困难。