第四章酶的提取与分离纯化

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2、表面活性剂
可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞 的破碎。表面活性剂可与细胞膜中的磷脂及脂蛋白 作用而破坏膜结构，增加膜的通透性。
三、化学破碎法
化学破碎法取决于化学试剂的类型以及细 胞壁膜的结构与组成，不同化学试剂对各 种微生物作用的部位和方式有所不同。
常用的化学试剂：有机溶剂和表面活性剂
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1、有机溶剂
能破坏细胞壁中的类脂。 常用试剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。 可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透
过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释放出胞 外。
酶促破碎法
自溶法 外加酶制剂法
通过细胞本身的酶系或外加 酶制剂的催化作用，使细胞 外层结构受到破坏，而达到 细胞破碎
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一、机械破碎法
通过机械运动所产生的 剪切力的作用，使细胞破 碎的方法 1、机械捣碎法： 器械：捣碎机。 常用于动物内脏、植物叶 芽等比较脆嫩的组织细胞 破碎，也可用于微生物， 特别是细菌的细胞破碎。
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3、超声波破碎法
超声波细胞破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系。 影响因素：细胞浓度、溶液粘度、pH值、温度以及离子强度等。 必须根据细胞种类以及酶的特性加以选择。 一般操作条件为：音频10 kHz或20 kHz；功率100～150W；温度 0～10℃；pH4～7；处理时间3～10 min，最好间隔几次操作；细 胞浓度和溶液粘度不宜太高，最好采用对数生长期的细胞进行破 碎。细胞浓度一般以1 g湿菌体加1～2 mL缓冲液为宜。
第四章 酶的提取与分离纯化
The Extraction, Separation and Purification of Enzyme
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酶的提取与分离纯化定义
将酶从细胞或其它酶原料中提取出来，再 与杂质分开，而获得所需酶制品的技术过 程，主要包括细胞破碎、提取、离心分离、 过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电 泳分离、萃取分离、浓缩、干燥、结晶等。
干燥法条件变化剧烈，容易引起蛋白质或其他活 性物质变性。
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三、化学破碎法
应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的 结构改变或破碎的方法。
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活 性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞 壁和膜的通透性（渗透性），从而使细胞内物 质有选择地渗透出来。
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酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞
酶提取( 粗提) 酶分离纯化
发酵液
酶浓缩 酶贮存
离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
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酶分离纯化不同阶段
酶的纯化过程，约可分为三个阶段：
(1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均 质打破细胞 → 抽提出全蛋白，多使用 盐析沉淀 法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。
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表4-1 细胞破碎方法及其原理
分类
细胞破碎方法
捣碎法 机械破碎法 研磨法
匀浆法
温度差破碎法 压力差破碎法 物理破碎法 超声波破碎法 反复冻融法 干燥法
细胞破碎原理
通过机械运动产生的剪切力， 使组织、细胞破碎
通过各种物理因素的作用，使 组织、细胞的外层结构破坏， 而使细胞破碎
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化学破碎法
添加有机溶剂、 通过各种化学试剂对细胞膜 添加表面活性剂 的作用，而使细胞破碎
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一、机械破碎法
2、研磨法 器械：研钵、细菌磨等。设备简单，效率较低，常 用于微生物和植物组织细胞的破碎。
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一、机械破碎法
3、匀浆法 器械：匀浆器。 通常用于破碎那些易于 分散、比较柔软、颗粒 细小的组织细胞，细胞 破碎程度较高，其机械 切力对酶的破坏也较少， 但难于在工业生产上应 用。
只适用于细胞壁较脆弱的菌体，破损率低，常需 反复多次。
在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。
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5、干燥法
多种方法使细胞干燥，如气流干燥、真空干燥、 喷雾干燥和冷冻干燥等。
通过干燥使细胞壁膜的结合水分丧失，从而改变 细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对 干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出 来。
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二、物理破碎法
各种物理因素：温度、压力、声波等的作用， 使组织细胞破碎的方法。
多用于微生物细胞的破碎。
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1、温度差破碎法
利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用使 细胞破碎。
温度差破碎法对那些较脆弱、易破的细胞破碎 效果好，但在酶的提取时，不能在过高的温度 下操作，以免酶失活。
此法难以用于工业生产。
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3、超声波破碎法
超声波：通常人的耳朵可听到的 声音频率范围为16-20kHz，频率 高于20 kHz的波。
其破碎机理可能与空化现象引起 的冲击波和剪切作用有关。在超 声波作用下，细胞膜由于空穴作 用而破碎。
由于空化作用而使液体形成局部 减压引起液体内部发生流动，旋 涡生成与消失时，产生很大的压 力使细胞膜破裂到达破碎细胞的 效果。
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2、压力差破碎法
高压细胞破碎机
（1）高压冲击法 （2）突然降压法
取决因素： a.压力差 b.压力减低的速度 c.细胞种类和生长期
此法对大肠杆菌等革兰氏阴性菌效果较佳，最 好使用对数生长期的细胞。
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（3）渗透压差法
步骤：
高渗平衡→转入低渗溶液→低渗溶胀破裂
适用范围：
膜结合的酶、细胞间质酶等的提取 无壁或壁破坏
(2) 部分纯化 (partially purified): 初步的 纯化，使用各种 柱层析法。
(3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步 精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。
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第一节 细胞破碎（Cell Disruption ）
细胞破碎：是通过各种方法使细法特点：
处理少量样品时操作简单、快捷、液量损失 少、效果好；
是最常用的物理破碎法，特别适用于微生物 细胞的破碎。
超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作时常 在细胞悬浮液中加入冰块或在夹套中通入冷却 剂进行冷却。
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4、反复冻融法
将待破碎的细胞放在低温下（-15～-20℃）突然 冷冻，然后在室温（或40℃）下缓慢地融解，如 此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞 液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。