基因工程期末复习

这是我整理的老师布置的思考题，不一定齐全也不一定正确，不过可以选择性地参考下。

1、DNA提取常见问题，原因分析及其对策

问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。

原因：1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3.DNA中残留有金属离子

对策：1.重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发3.增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）

问题二：DNA降解。

原因：1.材料不新鲜或反复冻融2.未很好抑制内源核酸酶的活性3.提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4.外源核酸酶污染5.反复冻融

对策：1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融

2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液

3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量

4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔

5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌

6.将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融

问题三：DNA提取量少。

原因：1.实验材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉淀不完全4.洗涤时DNA丢失

对策：1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2.动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 3.高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）4.低温沉淀，延长沉淀时间5.加辅助物，促进沉淀6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒

2、猪肝脏总RNA的提取？RNA提取常见问题，原因分析及其对

策

问题一：RNA的降解

（1）新鲜细胞或组织的RNA降解

RNA降解：1.裂解液的质量2.外源RNase的污染3.裂解液的用量不足

4.组织裂解不充分

5.另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA 的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。（2）冷冻样品的RNA降解

1.样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点；

2.先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；

3.样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。

问题二：OD260 /OD280 比值偏低

（1）蛋白质污染；（2）苯酚残留；（3）抽提试剂残留；（4）设备限制。

问题三：电泳带型异常

（1）非变性电泳：上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。

（2）变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；

（3）甲醛的质量不高

问题四：下游实验效果不佳

（1） RNA 降解；（2）抽提试剂的残留；（3）样品中杂质的残留；（4）DNA 污染。

3、已知单链RNA的序列，分别用sanger和化学裂解法测定其序

列，写出操作过程。

Sanger双脱氧链终止法：

1.分离待测核酸模板

2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记dATP，例如?32 PdATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸)。

3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理)结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。

4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddATP)，则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’ 末端都为同一种双脱氧碱基。

5.放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。

化学降解法测序：

（1）待测模版DNA分子的制备：一般用限制性内切核酸酶将待测DNA分子切割成250~300bp的片段，然后用碱性磷酸酶除去DNA片段5’端的磷酸根，最后用T4多核苷酸激酶和[r32P]ATP，使DNA片段的5’端带上放射性核酸标记。

（2）化学降解待测模版的DNA分子：纯化并碱变性待测DNA片段，回收其中的一条单链，分装在4支试管中进行上述4组特异性切割反应。4组反应分别产生大小不同且具有共同标记末端的寡核苷酸片段混合物。

（3）待测模版DNA分子的序列分析：通过聚丙烯酰胶凝胶电泳将上述4组反

应的寡核苷酸片段进行分离，经放射自显影后即可从X光片上读出DNA 序列。

4、实验设计：DNA片段之间的连接

带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。利用T4 DNA连接酶进行目的DNA和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5’磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。

1、不对称粘性末端：两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA 可以定向插入到载体中。

2、对称性粘性末端；线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理；载体与外源DNA 连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。

3、平端：要求高浓度的DNA和连接酶；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高。粘性末端连接：

实验试剂：

用适当的限制酶消化质粒和外源DNA。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒DNA。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化DNA，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。

10×T4DNA连接酶buffer（该缓冲液应分装成小份，贮存于－20℃。）：

200mMTris-HCl(pH7.6)；50mMMgCl2；50mM二硫苄糖醇；

500μl/ml BSA（可用可不用）

T4DNA连接酶

5mM ATP

实验步骤：

1、在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：

1) 10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5），补足ddH2O 至8μl。