基因工程与分子生物学

基因工程与分子生物学重点1．限制性核酸内切酶：凡是识别切割双链的DNA分子内特定核苷酸序列的酶称为限制性核酸内切酶，简称为限制性酶。

2．限制性核酸内切酶的一般性质：37℃，pH为7.2~7.6，用Tris—HCl，Gly—NaOH两种缓冲液，Mg2+Buffer，5mM，盐浓度，巯基试剂：β-ME，DTT，BSA（牛血清白蛋白，稳定酶的作用）；决定生产的特定的DNA片段的大小，识别顺序具有180°的旋转对称，识别顺序一般是4~6个碱基，也有6个以上的，但是没有4个以下的，产生三种不同的切口:形成平头末端（SmalⅠ）：连接困难，效率较低；形成5’粘性末端（EcoRⅠ）：相对而言，5’突出尾，3’凹末端；形成3’粘性末端（PstⅠ）相对而言，3’突出尾，5’凹末端。

3．星活性：在非标准条件下（低盐和高pH，高甘油浓度>5%），限制酶识别顺序与切割顺序发生改变的现象。

4．大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）：将Pol1切下一个小片段失去5’到3’外切酶活性。

补平限制酶切割DNA产生3’凹槽（5’到3’合成），用[32p]dNTP补平3’凹端，对DNA片段进行末端标记，对带3’突出端的DNA进行末端标记（利用置换活性），在cDNA 克隆中，用对和陈那个cDNA的第二条链，在体外诱变中用于从单链模版合成双链DNA，应用Sanger双脱氧末端终止法进行DNA测序，消化限制酶产生的3’突出端，应用于PCR 技术。

5．基因工程的工具酶：T7噬菌体DNA聚合酶，修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，TaqDNA 聚合酶（没有校正功能），大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段，T4噬菌体DNA聚合酶。

6．末端转移酶：将相同的核苷酸依次连接到3’末端，然后两条DNA通过同源多聚尾巴连接在一起，在表达前将ploy(G)切除，否则影响蛋白质的生物活性。

7．T4噬菌体多核苷酸激酶：使DNA的5’端磷酸化，也可以使DNA的5’端去磷酸化。

可以发生正向反应，也可发生交换反应。

正向反应：5’CTGCAG在酶和ATP（ATP具有α，β，γ磷酸基团，其中γ可给出）的作用下，生成5’pCTGCAG；交换反应：5’pCTGACG在酶和ADP的共同作用下，去磷酸化，将DNA链上的磷酸基团给出，生成5’CTGCAG和ATP，在酶和被标记的A TP作用下使得DNA再次被磷酸化同时被标记，生成ADP和5’*pCTGCAG。

8．基因工程载体种类：质粒，噬菌体的衍生物，科斯质粒或粘粒，噬菌体质粒，单链DNA 噬菌体M13，真核病毒载体，酵母质粒载体，杆状病毒。

9．质粒：在细菌细胞内作为与宿主染色体有别的复制子而进行复制，并且在细胞分裂时能恒定传递给子代细胞的独立遗传因子。

10．质粒作为基因工程载体所必备的条件：1）具有较小的分子量和松弛的复制子，2）基因组上有1~2个筛选标记，便于在平板中区分重组体和非重组体，3）DNA链上有1到几个限制酶的单一识别与切割位点，便于外源DNA的插入，4）具有插入失活（或是插入表达）的筛选标记，便于从平板中直接筛选阳性重组体。

11．Ti质粒：引起植物形成肿瘤—冠瘿瘤的质粒称为诱导肿瘤的质粒。

12．Ti质粒的优点：宿主范围广泛，Ti质粒能过转化所有的双子叶植物，并将外源基因导入植物细胞；整合到宿主细胞ch—DNA上的T—DNA成了染色体的正常遗传成分，永远居留，代代相传；T—DNA上的Opine合成酶基因有一个强大的启动子，能启动外源基因在植物细胞中高效表达。

13．分子杂交（杂交，hybrdization）：核酸研究中一项最基本的实验技术，它是指在一定条件下互补核酸链复性形成双链的过程。

14．分子杂交的原理：(一)DNA的变性：指分子有稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象，确切的说是维持双螺旋结果稳定的氢键和疏水键的断裂，DNA变性不涉及到其一级结构的改变；（二）DNA的复性：指变性的两条互补DNA链在适当条件下，全部或部分恢复到天然双螺旋结果的现象，它是变形的一种逆转过程。

热变性DNA一般经缓慢冷却后便可复性，此过程称之为“退火”（annealing）。

15．Southernblot操作技术：将获取得DNA样品进行琼脂凝胶电泳，将琼脂糖凝胶上的DNA 片段按原有的顺序转移到一张硝酸纤维素薄膜上并固定下来，用32P标记的DNA或RNA 探针与之杂交，用发射自显影技术确定任何能与探针DNA或RNA杂交的带。

16．Northernblot操作技术：将获取得RNA样品进行琼脂糖凝胶变性电泳，将琼脂糖凝胶上的RNA按原有顺序转移到一张硝酸纤维素薄膜上并固定下来，用32P标记的DNA或RNA 探针与之杂交，用发射自显影技术确定任何能与探针DNA或RNA杂交的带。

17．Westernblot操作技术：将获取得蛋白质样品进行聚丙烯凝胶电泳，将聚丙酰胺凝胶上的蛋白质带按原有顺序转移到一张硝酸纤维素薄膜上并固定下来，用32P标记的DNA或酶标记的蛋白质探针与之杂交，用发射自显影技术确定任何能与探针DNA或RNA杂交的带。

18．原位杂交：转为鉴别阳性重组体而设计的DNA杂交法，若受体DNA是从转化的菌落释放，则原位杂交又称菌落杂交，若受体DNA从转染的空斑释放，则称空斑杂交。

基本程序：在硝酸纤维素薄膜上接种转化细胞长出菌落（或空斑）并溶解释放DNA通过变性和干燥，使DNA在原有位置固定，作为杂交的受体DNA，以后的杂交和放射自显影与前两种方法基本相同，原位杂交是鉴别阳性重组体的精确和快速方法，一张硝酸纤维薄膜上筛选的菌落可达到上百个。

19．探针标记：放射性标记：大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段标记合成的寡核苷酸，达成杆菌DNA聚合酶I标记寡核苷酸探针，T4DNA聚合酶标记寡核苷酸探针，末端转移酶标记寡核苷酸探针，T4噬菌体多核苷酸激酶标记寡核苷酸探针；体内标记：生物体的新陈代谢，食物、营养来源标记探针，非放射性标记（成本高，污染小）:地高辛，化学发光素。

20．分子克隆：讲一个基因片段插入到另一个载体DNA中，组成重组DNA分子，将它转入到受体细胞中复制扩增，即进行无性生殖，由于这类克隆在分子水平上操作，故称为分子克隆。

21．外源基因导入宿主细胞的方法：1）逆转录病毒感染法：产物用于食品，医药一般不采用该方法，但在科研上效果好；2）DNA显微注射法：在显微镜下，用显微镜将目的基因注射入宿主细胞内，但对宿主细胞的机械损伤较大；3）磷酸钙转染技术：磷酸钙反复转染，是的DNA沉淀下来，易接受外源DNA；DEAE葡聚糖转染技术：DEAE葡聚糖与目的基因共沉淀，易于细胞结合；5）聚阳离子—DMSO转染技术：DMSO较强的去污剂，对宿主细胞有机械损伤，转入宿主细胞内时间过长，机械损伤过大；6）电穿孔技术：电击，产生微小孔洞使得目的基因转入，强度时间的控制很重要，防止致死细胞；7）原生质体融合技术：充足DNA分子包裹在人工膜（脂质体转染）内，然后直至体育宿主细胞融合导入目的基因；8）精子载体介导法：局限性，与卵子结合，受精卵受精成熟的后，鉴定再哪个组织细胞中；9）胚胎干细胞法：胚胎干细胞培养困难，增长传代系数。

22．遗传选择标记：1）胸腺核苷酸基因（tk）：验证生物活性，用HAT培养基（H次黄嘌呤，A氨基嘌呤，T胸腺嘧啶核苷）；2）二氢叶酸还原酶基因（dhfr）：二氢叶酸在二氢叶酸还原酶作用下还原成四氢叶酸，dhfr—不能还原成四氢叶酸，使得细胞死亡；3）氯霉素乙酰转移酶基因（cat）：氯霉素乙酰转移酶将氯霉素乙酰化，是氯霉素失效，cat—则不能是氯霉素乙酰化，细胞死亡；4）细胞的黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因（ecogpt）；5）细菌的新霉素磷酸转移酶基因（econeo）。

1．哺乳动物基因转移中常用的报告基因：1）人生长激素基因（hGH，humangowthhormone）；2）碱酶基因（alkalinephosphatase）；3）半乳糖甘酶基因（Lacz）；4）荧光素酶基因（luciferas）；5）绿荧光蛋白基因（GFP，Greenfluorescentprotein）；6）邻苯二酚—2，3—双加氧标志基因（CatO2aseCatechol:Oxygen2,3—oxidoreductase）2．植物基因工程常用的基因：（一）抗植物病虫病基因：1）Bt基因（苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因）；2）昆虫的蛋白酶抑制剂基因：丝氨酸蛋白酶抑制剂，巯基蛋白酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂；3）植物凝集素基因（lectingene）；4）淀粉酶抑制剂基因；（二）抗植物病毒基因：1）cp基因（外援的病毒外壳蛋白基因）；2）病毒复制酶基因；3）病毒卫星RNA 的利用：卫星RNA是多核苷酸，他们有时在其相伴的病毒中被发现，它们按照相伴病毒的复制和传播机制，从一个植株传到另一个植株，它们不与其相伴病毒序列同源，对病毒的复制也不起作用，但卫星RNA具有改变其相伴病毒的致病力的能力；4）核糖体失活蛋白基因：产物是核糖体失活，影响病毒蛋白质合成；5）干扰素基因；6）缺陷干扰颗粒（defectiveinterfering，DI）指那些序列与亲本病毒相关的，但必须依赖于病毒才能复制的DNA分子，这种分子多存在于动植物病毒中；（三）抗植物真菌病毒基因：1）几丁质酶与β—1，3—葡聚糖酶，几丁质酶降解几丁质（聚N—乙酰胺基葡萄糖），几丁质是构成真菌细胞壁的成分，β—1，3—葡聚糖酶降解β—1，3—葡聚糖，后者也是构成真菌细胞壁的成分；2）植物抗毒素基因；3）RIP基因：核糖体蛋白失活基因，使真菌蛋白不能合成；4）过氧化物基因：木质素由苯基类丙烷醇缩合而成，它可增强细胞壁的强度，增加抗真菌的穿透的压力，而且抗原菌酶的降解，从而限制了真菌酶和毒素向宿主扩散以及水和营养物质从寄主向真菌扩散，过氧化物酶催化苯基类丙烷醇脱氢酶聚合成木质素；（四）抗植物细菌病毒基因：病原菌本身的抗性基因（类似于抗生素）；杀菌肽基因（杀菌性的特异性不强，广谱杀菌）；溶菌酶基因（破坏细菌的细胞壁）。

3．高等植物基因转化方法：根瘤农杆菌—Ti质粒系统；化学刺激法；电脉冲法；基因枪法；电击注入法；脂质体法；直接注射法；激光微束发；超声波法；花粉发。

4．植物基因工程常用遗传选择标记：Npt—II基因（新霉素磷酸转移酶基因或氨基糖苷磷酸转移酶基因，Aph—II），DHFP基因（二氢叶酸还原酶基因）；HPT基因（潮霉素磷酸转移酶基因）；Gent基因（庆大霉素抗性基因）；抗除锈迹的标记基因；争光霉素（博来霉素）抗性基因；Blas（杀稻瘟菌素）；磺胺类药物。

5．PCR技术原理：DNA双螺旋结构的生物功能主要是在与复制和转染，以加热或碱变性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂，双联竭力，形成单链DNA，这称为DNA变性，解除变性条件后，变形的单链可以重新结合起来，形成双链，其原有的活性复原，称为DNA复性，又称退火，变形和复性在一定条件下是完全可逆的。