透射电镜制样
透射电镜的样品制备技术
平整的废包埋块压在其上,于60 ℃聚合硬化.将 粘有包埋块的玻片置于90 ℃热板上加温10s,取
下包埋块修块,超薄切片及电子染色.
构不清
超薄切片质量好坏指标
• 样品结构保存良好,结构细腻,无丢失. • 切片厚薄均匀,厚度在60-90nm之间.表面无
皱折、刀痕、震颤等缺陷. • 样品反差良好,无染色沉淀. • 支持膜厚度适中,观察时不产生漂移和破裂.
六.电子染色
• 利用重金属盐类选择性地与生物样品中不同 结构成分相结合,来提高结构成分散射电子的 能力,从而增加图像反差的染色,又称为正染
Fig. 4. Colloidal gold nanoparticles 20 nm. 1: anti-TTX Mab labelled colloidal gold nanoparticles showing the protein halo around the labelled nanoparticles, 2: unlabelled colloidal gold nanoparticles.
• 多用于解剖关系比较复杂、质地柔软或对 缺氧比较敏感的组织.以保证器官的血液供 给,避免缺血造成的组织损伤或自溶.
• 操作步骤 在动物麻醉后保持血液供应的条件下,
边解剖边在取材的部位局部滴加固定液,直 至组织达到适当的硬度为宜.
灌流固定法
• 指通过血液循环途径,将固定液灌注 到组织器官内,进行固定后再取材的方法. 常用于对缺氧敏感,死后变化快的组织器 官,如中枢神经系统、心脏、胃肠道、视 网膜和肾脏等.也可用于所取组织的种类 较多以及解剖关系比较复杂、难以渗透 的组织器官.
透射电镜制样流程
透射电镜制样流程透射电镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）制样是指通过一系列的化学和物理方法来制取透射电镜所需的样品。
透射电镜是一种高分辨率的显微镜，可以在纳米尺度下观察材料的原子结构和微观形态。
为了获取高质量的TEM图像，制样过程非常关键。
下面将详细介绍透射电镜制样的流程。
1.样品制备：样品可以是纳米颗粒、薄膜、纤维或生物样品等。
首先，准备适宜的基底材料，如碳膜覆盖的铜网格或碳膜覆盖的铜刀片。
样品通常需要制成非常薄的切片，通常在50到100纳米的厚度范围内。
制备方法包括机械切割、电解石蠟切片、离子切割或电离蚀刻等。
2.固定和固化：对于生物样品，需要先进行固定处理，以保持样品的形态和结构。
常用的固定剂包括戊二醛、酸性醛或重金属盐。
然后，固定的样品需要进一步处理以固化，如用过氧化物、树脂或聚合物进行浸渍，以增加样品的稳定性。
3.切割和悬浮：将固化的样品切割成适当的尺寸和形状。
使用超微切割机、离子切割仪或其他切割工具进行切割。
切割后，样品通常会悬浮在水或有机溶液中，以便进一步处理。
4.脱水和对比染色：脱水是将样品从水中逐渐转移到有机溶剂中的过程。
这种处理可以控制样品的体积，以减少对比染色和观察中的伪影。
脱水通常通过渗透固定液逐渐转移，然后通过有机溶剂（如醋酸乙酯、丙酮或丙二醇）进行交换。
5.嵌入：将样品嵌入到透明的聚合物或树脂中。
嵌入过程中，通常采用逐渐增加浓度的树脂混合物，以确保样品得到完全浸透。
然后，将样品与树脂进行硬化，通常在高温下进行。
6.超薄切片：将固化的样品切割成非常薄的切片。
使用超薄切片机和钻磨刀片进行切割。
切割后的切片应尽快收集并转移到透明的铜网格或铜刀片上。
7.超薄切片处理：超薄切片通常需要进行后继处理以增强对比度和解决其他问题。
这可能包括染色、胶层增强或薄膜剥离等方法。
8.观察：将制备好的样品放入透射电镜中进行观察。
在观察前，样品需要在真空中或过氮气中去除气泡和其他杂质。
细菌透射电镜样品制备方法
细菌透射电镜样品制备方法
细菌透射电镜样品制备可参考以下步骤：
1. 将适量无菌水加入生长良好的细菌斜面内，用吸管轻轻拨动菌体制成菌悬液。
2. 用无菌滤纸过滤菌悬液，并调整滤液中的细胞浓度为10^8-10^9个/毫升。
3. 取等量的上述菌悬液与等量的2％的磷钨酸钠水溶液混合，制成混合菌悬液。
4. 用无菌毛细吸管吸取混合菌悬液滴在铜网膜上。
5. 经3-5分钟后，用滤纸吸去余水，待样品干燥后，置低倍光学显微镜下检查，挑选膜完整、菌体分布均匀的铜网。
细菌透射电镜样品制备的方法还有很多，具体步骤可能因细菌的种类和实验需求而有所不同。
透射点镜的生物样本的制样过程
透射电镜生物样品制作过程透射电镜生物样品制作过程大致经过取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片及染色等步骤。
一. 取材取材时要注意的要点是：快、小、冷、净、准、避免机械损伤。
取材方法：将固定液滴在冰台上的卡片上，在麻醉后的动物身上快速用剪刀剪取一块组织，用预冷的过的缓冲液将剪下的组织洗净，迅速放到卡片上的固定液中，用刀片切去被镊子夹到和剪刀剪过的组织，后按实验的目的将组织切成0.5~1mm2的立方或横截面为1mm2的长方体。
用牙签将切好的组织块转移到装有固定液的小瓶中，贴好标签并置于4℃的冰箱中。
二．固定以下操作尽可能在4℃的环境下，使用的溶液也要保存在4℃的冰箱中。
1、戊二醛固定：用镊子轻轻的将组织块从固定液中取出，放在卡片上的固定液中，利用双面刀片把组织块切成小块状，放进盛有1~1.5ml的0.1%的戊二醛的固定液的细管中，将吸管放进真空箱中，将大气压抽到760托后取出，使组织块在戊二醛溶液中固定1小时。
2、漂洗：经戊二醛固定的组织块要用1~1.5ml的0.1%PBS缓冲溶液漂洗，漂洗的次数为5次，在漂洗到第四次时可以将组织留在PBS漂洗液中过夜，放入4℃的冰箱中。
第二天早晨再进行第五次漂洗。
3、四氧化锇固定：向漂洗过的组织中加入0.5ml的0.1%四氧化锇固定液，固定时间为2个小时。
由于四氧化锇具有毒性，因此操作在通风橱里进行。
4、漂洗四氧化锇：用0.1%PBS缓冲溶液漂洗剩余的四氧化锇，然后再漂洗两次，其时间间隔为10min。
三．脱水为了保证包埋介质完全渗入组织内部，必须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用的脱水剂是乙醇和丙酮。
1、酒精脱水:用浓度梯度依次为30%、50%、70%、90%的酒精，依次浸泡组织，其浸泡的时间一般为10min。
当在70%梯度的酒精时，样品可以放置过夜。
2、丙酮脱水：用浓度梯度为90%、100%的丙酮浸泡组织，在纯丙酮中浸泡三次。
透射电镜制样步骤以及注意事项
透射电镜制样步骤以及注意事项透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，简称TEM）是目前最常用的高分辨率电子显微镜，可以用于观察物质的微观结构。
制备TEM样品的过程非常重要，下面将详细介绍TEM制样的步骤以及需要注意的事项。
制备TEM样品的步骤一般包括样品的选择、固定与固化、切片、薄化、网格制备和贴膜等。
第一步是样品的选择，样品应具有研究价值且适合观察。
例如，生物样品可以是细胞、组织或器官的薄片，金属样品可以是扁平的块状、粉末或薄膜等。
第二步是固定与固化。
对于生物样品，常用的固定方法包括浸泡法、灌注法和切片冷冻法；对于无机样品，可以使用固定剂将样品固定在固定剂中。
第三步是切片。
将固定好的样品切割成薄片，一般要求薄片的厚度在100 nm以下，通常使用超薄切片机来进行切割。
第四步是薄化。
将切割好的样品进行薄化处理，使其达到TEM观察所需的薄度。
常见的薄化方法有机械薄化、电化学薄化和离子薄化等。
第五步是网格制备。
将薄化好的样品放置在铜网格上，网格的选取应该根据所研究样品的性质和需要进行选择。
最后一步是贴膜。
将组织切片或带有样品的网格进行贴膜，以保护样品并提高图像的对比度。
在以上步骤中，需要注意的事项有：1.样品在制备过程中要避免受到污染或氧化，尽量在纯净无尘的环境中进行操作。
2.固定剂的选择要合理，不同的样品可能需要使用不同的固定剂，应根据需要进行选择。
3.切片时要注意刀片的尖锐度和切割角度，以免对样品造成损伤或变形。
4.薄化过程中要控制好加工参数，以保证样品的均匀薄化。
5.制作网格时应选择合适的网格尺寸和类型，以适应观察需求。
6.贴膜时要使薄膜均匀平整，并避免出现气泡或杂质。
总之，TEM制样是一项复杂而关键的过程，要保证样品的质量和可观察性，需要仔细选择方法、控制操作参数、注意样品的保护与处理。
合理的样品制备能够获得高质量的TEM图像，并提供准确的实验数据和结论。
透射电镜样品制备
透射电镜试样制备一、实验内容及目的了解透射电镜对试样的要求，熟悉透射电镜试样的制备过程，制备一个合格的透射电镜试样。
二、薄膜样品的制备用于透射电镜下观察的试样厚度要求在50-200nm之间，试样的制备过程大致可以分为以下三个步骤：第一步从实物或大块样品上切割厚度为0.3-0.5mm厚的薄片。
电火花线切割法是目前用得最广泛的方法，它是用一根往返运动的金属丝作切割工具，以被切割的样品作阳极、金属丝作阴极，两极间保持一个微小的距离，利用其间的火花放电进行切割。
电火花切割可切下厚度小于0.5mm的薄片，切割时损伤层比较浅，可以通过后续的磨制或减薄过程去除。
电火花切割只能切割导电样品，对于陶瓷等不导电样品可用金刚石刃内圆切割机切片。
第二步样品薄片的预减薄。
预减薄的方法有两种，即机械法和化学法。
机械法是通过手工研磨来完成的，把切割好的薄片一面用粘接剂粘在样品座表面，然后在水砂纸磨盘上进行研磨减薄。
应注意把样品平放，不要用力太大，并使它充分冷却。
减薄到一定程度时，用溶剂把粘接剂溶化，使样品从样品座上脱落下来，然后用同样方法研磨另一个面直至样品被减薄至规定的厚度。
（如果材料较硬，可减薄至70μm左右；若材料较软，则厚度不能小于100μm。
另一种预先减薄的方法是化学薄化法。
这种方法是把切割好的金属薄片放入配制好的化学试剂中，使它表面受腐蚀而急需减薄。
因为合金中各组成相的腐蚀倾向是不同的，所以在进行化学减薄时，应注意减薄液的选择。
化学减薄的速度很快，因此操作时必须动作迅速。
化学减薄的最大优点是表面没有机械硬化层，减薄后样品的厚度可以控制在20-50μm 。
经化学减薄的样品最终抛光穿孔后，可供观察的薄区面积较大。
但是化学减薄时必须事先把薄片表面充分清洗，否则将得不到满意的结果。
第三步最终减薄目前效率最高和操作最简便的方法是双喷电解抛光法，图为一台双喷式电解抛光装置的示意图。
将预先减薄的样品剪成直径为3mm的圆片,装入样品夹持器中。
透射电镜制样要求与制样方法
透射电镜制样要求与制样方法1. 样品一般应为厚度小于100nm的固体。
2. 样品在电镜电磁场作用下不会被吸出，附于极靴上。
3. 样品在高真空中能保持稳定。
4. 不含有水分或其它易挥发物，含有水分或其他易挥发物的试样应先烘干。
TEM样品常放置在直径为3mm的200目载网上纳米粉末样品的制备方法1、研磨法将（研磨后的）粉末放在去离子水或无水乙醇溶液里，用超声波分散器将需要观察的粉末分散成悬浮液。
用滴管滴几滴在覆盖有支持膜的电镜载网上，待其干燥(或用滤纸吸干)后, 即成为电镜观察用的粉末样品。
载网种类：方华支持膜：方华支持膜的化学成分是聚乙烯醇缩甲醛，由于是纯的有机膜，所以膜的弹性好，厚度通常为 10nm 左右，透射电镜观察时背底影响小。
但方华膜因导电性不好，在电子束照射下，易因高温或电荷积累，产生样品漂移甚至膜破损，通常在 100kV 电镜和生物样品中使用较多。
碳支持膜：是一种最常用的支持膜，有两层膜结构。
从下至上依次为裸网、方华膜和碳膜，由于碳层具有较强的导电性和导热性，弥补了无碳方华膜的荷电效应以及热效应，增强了膜整体的稳定性，适合大多数纳米材料和生物样品的一般形貌观察用于常规样品制样。
微栅：在膜上制作出微孔，以便使样品搭载在微孔边缘，使样品“无膜”观察，提高图象衬度。
观察管状、棒状、纳米团聚物效果好，特别是观察这些样品的高分辨像及mapping时更是最佳选择。
超薄碳膜：在微栅的基础上叠加了一层很薄的碳膜，一般为3-5纳米。
这层超薄碳膜的目的是用超薄碳膜把微孔堵住。
主要针对粒度较小的纳米材料。
如10纳米以下分散性很好的纳米材料，如果用微栅可能从微孔中漏出，如果在微栅孔边缘，由于膜厚可能会影响观察。
所以用超薄碳膜就会得到很好的效果。
纯碳膜：当样品所用的有机溶剂（氯仿、甲苯等）能够溶解方华膜时，载网膜中就要去除方华膜，只剩碳膜，称为纯碳膜，碳膜的厚度通常为 20nm 左右，在高分辨观察时背底的影响也比较明显。
透射电镜生物制样
透射电镜生物制样透射电镜（Transmission Electron Microscope, TEM）是一种强大的工具，用于研究和观察生物制样，特别是在纳米级别下的细胞和组织结构。
利用透射电镜，科学家可以深入研究生物体内部的微观结构和化学组成，为我们深化理解生命的基本单位提供了巨大帮助。
在生物制样的过程中，首先需要对样品进行固定，以保持其原始的形态和结构。
常用的固定剂包括冷冻与化学固定剂。
冷冻固定将样品迅速冷冻至极低温，以保留细胞的天然形态和水合状态。
化学固定则通过化学反应交联细胞中的分子结构，稳定样品并防止其后续的变化。
固定后，样品需要进行剖面制备。
通常采用超薄切片技术，将样品切割成约70至100纳米厚的薄片。
这一步骤需要高超净实验室环境和专业的技术操作，以确保样品的质量和薄片的均匀性。
之后，透射电镜的操作步骤就开始了。
样品薄片被放置在透明的铜网上，并通过仔细的步骤逐渐加膜、压制，最终制备成为透射电镜样品。
为了提高样品的对比度，在样品制备过程中，常常需要对其进行染色。
例如，使用重金属盐（如铇酸）对样品进行染色，使得不同细胞组分在电镜下有更明显的特征。
在样品制备完毕后，样品会被放置在透射电镜的样品室中。
电子束经过样品，透射到另一端的检测器上。
通过检测电子束的强度和散射情况，透射电镜可以产生高分辨率和详细的图像。
这些图像经过处理和分析，可以揭示出生物样品中微观结构的细节。
利用透射电镜生物制样，可以提供许多重要的信息。
例如，可以观察到细胞的亚细胞结构，如线粒体、内质网和高尔基体等细胞器的详细形态。
还可以研究细胞和组织中的超微结构、蛋白质聚集和聚体、核糖体和核纤维等。
透射电镜也能够帮助科学家研究细胞和组织中的病理变化和与疾病相关的结构异常。
例如，可以观察到病毒的形态和复制过程，深入了解病毒感染的机理。
同时，也可以通过透射电镜观察神经元的超微结构，帮助我们理解神经系统疾病的发病机制。
总之，透射电镜生物制样为生命科学领域提供了研究细胞和组织的有力工具。
透射电镜制样流程
透射电镜样品制备过程
组织取材（60s内），体积<1mm3，之后进行如下步骤
1）前固定：3%戊二醛2h或过夜。
2）漂洗：磷酸缓冲液，3次，10min/次。
3）后固定：1%锇酸固定液，2h。
4）漂洗：（同上）。
5）梯度脱水：50%丙酮，70%丙酮，80%丙酮，90%丙酮两次，各10min 。
100%丙酮两次，各15min。
6）渗透：丙酮/包埋剂（1:1,1:2），室温各1h。
丙酮/包埋剂1:3, 4度过夜。
纯包埋剂，4度过夜。
7）包埋：纯包埋剂（37度,45度,60度各24h）。
取出包埋块，进行超薄切片，片厚70nm。
分别采用醋酸双氧铀对切片进行染色30min，双蒸水漂洗3-5次，之后用柠檬酸铅
染色10min，双蒸水漂洗3-5次。
待切片干燥后，透射电镜观
察。
切片机型号：Leica UC7 超薄切片机，速度1mm/s.
透射电镜型号：日立高新HT7700，电压80kv 电流10μa.。
透射电镜常规样品制备流程
透射电镜样品制备流程由于透射电镜能观察的样品必须很薄（60～70nm），所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单一，仅有一下两种方法：一．负染色技术负染色技术简单快速，可以显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小以及表面结构的特征。
尤其在病毒学中，负染色技术有着广泛的应用。
样品要求：①样品悬液的纯度不要求很纯，但是如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。
尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。
②样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品堆积影响观察。
操作流程：吸取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2min后滤纸吸去负染色液，待干后用于电镜观察。
二、超薄切片技术超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞超微结构最常用的技术。
广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。
一般厚度在10～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。
超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。
但是，超薄切片切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。
具体操作步骤、注意事项如下：1．取材和前固定：快速的切取大小为0.5～1.0mm3的样品块，一分钟内把组织（样品）块浸入2.5％戊二醛（进口品质）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装20个以上的样品块，作为一个样送到平台。
要求：①取材前一定要和工作人员取得电话联系！②取材选择部位要准确可靠，确保每块材料都是要观察的部位。
③所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空15mins，不能沉底的样品一定要抽真空致沉底！④细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心沉淀后送到平台，由平台工作人员处理。
透射电镜样品制备方法
¾透射电子显微镜成像时，电子束是透过样品成像。
¾由于电子束的穿透能力比较低，用于透射电子显微镜分析的样品必须很薄。
¾根据样品的原子序数大小不同，一般在50～500nm之间。
透射电镜样品的要求：¾1. 样品必须对电子束透明。
¾2. 所制得样品必须具有代表性，以真实反映所分析材料的特征。
主要方法：粉末样品、复型、离子减薄、电解双喷。
¾透射电镜观察用的样品很薄，需放在专用的样品铜网上。
¾透射电子显微镜使用的铜网一般直径为3毫米，上面铳有许多微米大小的孔，在铜网上覆盖了一层很薄的火棉胶膜并在上面蒸镀了碳层以增加其膜的强度，被分析样品就承载在这种支撑膜上。
样品铜网的作用：¾承载样品，并使之在物镜极靴孔内平移、倾斜、旋转，寻找观察区。
¾样品通常放在外径3mm ，200目方孔或圆孔的铜网上，铜网牢固夹持在样品座中保持好的热、点接触，减少因电子照射引起的热或电荷积累而产生样品漂移或损伤。
样品台透射电子显微镜样品制备电镜观察时样品受到的影响：(1)真空的影响。
含有挥发溶剂或易升华的试样必须冷冻后观察。
(2)电子损伤的影响。
试样在电镜中受到l0－3～1A/cm2的电子束照射，电子束的能量部分转化为热，使试样内部结构或外形发生变化或污染。
观察有机物或聚合物试样时，为防止电子束对试样的损伤和污染，应提高电压。
(3)电子束透射能力的影响。
由于电子束透射能力较弱，一般100kv加速电压时，试样厚度必须在20～200nm之间。
粉末样品制备¾随着材料科学的发展，超细粉体及纳米材料发展很快，而粉末的颗粒尺寸大小、尺寸分布及形态对最终制成材料的性能有显著影响，因此，如何用透射电镜来观察超细粉末的尺寸和形态便成了电子显微分析的一的一项重要内容。
¾其关键工作是是粉末样品的制备，样品制备的关键是如何将超细粉的颗粒分散开来，使其均匀分散到支持膜上，各自独立而不团聚。
透射电镜制样方法
透射电镜制样方法
透射电镜制样方法主要包括以下步骤：
1. 样品制备：首先需要选择合适的样品，并进行必要的前处理。
根据需要，可以使用传统的金相方法，如切片、打磨和腐蚀等来制备样品；也可以使用更先进的方法，如离子切片、聚焦离子束等来制备样品。
2. 高真空处理：将样品置于高真空环境下进行处理，以去除气体和水分的影响。
这可以通过在真空槽中加热样品、通入惰性气体等方法来实现。
3. 制备薄片：将制备好的样品制备成足够薄的薄片，通常厚度要求在几十纳米至几百纳米之间。
这可以通过使用超薄切片机或聚焦离子束来实现。
4. 电导涂层：为了提高样品的导电性，可以在样品表面涂上金薄层或碳薄层。
这可以通过蒸镀、溅射、离子镀等方法来实现。
5. 透射电镜成像：将制备好的样品放入透射电镜中，调整仪器参数，如加速电压、透镜聚焦等，进行成像。
可以使用像差校正技术、电子衍射等方法来提高成像质量。
需要注意的是，不同样品的制备方法会有一定差异，制备薄片时要注意避免样品的破裂和变形，电导涂层要均匀且致密，成像时要注意样品与探针的相对位置等
细节问题。
此外，透射电镜制样方法还包括一些先进的技术，如原位制备、低温制备、离子减薄等，可以根据需要选择适合的方法进行制备。
透射电镜制样方法
透射电镜制样方法
透射电镜制样是实验室中极为重要的一项技术操作，它将不同结构和尺寸的样品细粒度地进行分离，使之适应望远镜进行观察。
目前实验室高等学校科研都广泛运用透射电镜进行材料研究。
透射电镜制样大致可分为以下步骤：
1.准备样品：将细分的材料（如金属、碳、化学物质等）放在石英板上，以保证材料表面光滑。
2.制备标本：用刮子将样品按一定密度均匀地刮到石英板上制备出一个标本，再在标本表面进行抛光，使标本表面光滑，并保证其大小和厚度圆滑兼容。
3.金相分析：将抛光的标本放在金相检测仪上，通过金相范式素材库，自动检测标本的组成成分，较快准确得出有关分析结果。
4.涂覆镜片：将样品夹在两个玻璃挡板间，倒入特殊的样品涂覆液，将两片玻璃挡板缓慢压缩，使涂覆液平稳均匀地涂覆到样品表面，以形成镜片。
5.放入电镜：将涂覆后的样品放入透射电镜，并用调节电源选择对应的廓线调节器，即可通过连续的廓线选择实现不同的形状的样品的聚焦。
6.观察分析：在放大可视屏上观察样品，然后拍照或录制，以便进一步分析。
以上就是透射电镜制样的大致步骤，制备一个完美样品需要仔细操作，技术人员必须熟悉此项技术操作，并结合实际材料和实验步骤多次实践，以达到良好的实验效果。
透射电镜样品制备
一、样品要求1．粉末样品基本要求（1）单颗粉末尺寸最好小于1μm；（2）无磁性；（3）以无机成分为主，否则会造成电镜严重的污染，高压跳掉，甚至击坏高压枪；2．块状样品基本要求（1）需要电解减薄或离子减薄，获得几十纳米的薄区才能观察；（2）如晶粒尺寸小于1μm，也可用破碎等机械方法制成粉末来观察；（3）无磁性；（4）块状样品制备复杂、耗时长、工序多、需要由有经验的老师指导或制备；样品的制备好坏直接影响到后面电镜的观察和分析。
所以块状样品制备之前，最好与TEM 的老师进行沟通和请教，或交由老师制备。
二、送样品前的准备工作1．目的要明确：（1）做什么内容（如确定纳米棒的生长方向，特定观察分析某个晶面的缺陷，相结构分析，主相与第二相的取向关系，界面晶格匹配等等）；（2）希望能解决什么问题；2．样品通过X-Ray粉末衍射（XRD）测试【粉末衍射标准联合委员会】、并确定结构后，再决定是否做HRTEM；这样即可节省时间，又能在XRD的基础上获得更多的微观结构信息。
3．做HRTEM前，请带上XRD数据及其他实验结果，与HRTEM老师进行必要的沟通，以判断能否达到目的；同时HRTEM老师还会根据您的其他实验数据，向您提供好的建议，这样不但能满足您的要求，甚至使测试内容做得更深，提高论文的档次。
三、粉末样品的制备1．选择高质量的微栅网（直径3mm），这是关系到能否拍摄出高质量高分辨电镜照片的第一步；（注：高质量的微栅网目前本实验室还不能制备，是外购的，价格20元/只；普通碳膜铜网免费提供使用。
）2．用镊子小心取出微栅网，将膜面朝上（在灯光下观察显示有光泽的面，即膜面），轻轻平放在白色滤纸上；3．取适量的粉末和乙醇分别加入小烧杯，进行超声振荡10~30min，过3~5 min 后，用玻璃毛细管吸取粉末和乙醇的均匀混合液，然后滴2~3滴该混合液体到微栅网上（如粉末是黑色，则当微栅网周围的白色滤纸表面变得微黑，此时便适中。
透射电镜标本制备方法
透射电镜样品制备方法透射电镜的样品制备方法，需要经过取材、固定、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。
一．取材的基本要求组织从生物活体取下后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部的各种酶作用，出现细胞器自溶现象。
因此，为了细胞结构尽可能保持天然状态，必须做到快、小、准、冷。
（1）动作迅速，组织从活体取下后应在最短的时间内（1分钟内）投入2.5%戊二醛固定液。
（2）所取组织的体积要小，一般不超过1mm*1mm，取样形状为牙签状。
也可将组织修成1mm*1mm*2-5mm大小长条形。
因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。
（3）机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。
推荐使用手术刀或双面刀片。
（4）操作最好在低温（0℃—4℃）下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。
（5）取材部位要准确。
切片窗小于1mm*1mm，如取样带有太多的多余组织，可能造成你需要的部分刚好被修掉。
二．取材方法（按照自己的样品类型检索）1.动物及人体组织的取材（在冰浴上进行）动物组织的取材，应麻醉（1%戊巴比铵5 ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官。
用手术刀切割取一小块组织，放在干净的硬质板上（例如培养皿底部），滴一滴冷却的固定液。
用新的、无油污的锋利双面刀片将材料切成大约1 mm宽，3~5 mm长的小块并从中选出受损伤较小的小条（牵拉损伤将直接破坏组织，切取时刀片下压，不要来回拉锯），用牙签将这些小块逐一放入盛有预冷的、新鲜固定液的1.5 ml管内，放入冰箱冷藏室低温固定（0~4℃）4小时或以上。
*固定结束后，将固定液用磷酸盐缓冲液稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。
送样前请用磷酸盐缓冲液于4度冰箱浸泡清洗15 min，共3次，做好标记送至电镜室。
送样请使用2 ml离心管，用记号笔在离心管管壁上写好编号，用透明胶带缠绕。
后续管子会接触丙酮和乙醇，一定要用透明胶带缠绕，以防记号被洗掉。
透射电镜的制样方法
序号
1
2 3 4
电解液成份与配比
合用材料
乙醇（80ml），冰醋酸(80ml)，高氯酸 (15ml)，甘油(10ml)
正磷酸(480ml)，硫酸(50ml)，铬酐(80g)， 水(60ml)
高氯酸(80ml)，冰醋酸(70ml)
高氯酸(10ml)，乙醇(90ml)
高温合金，耐热钢 ，铝及其合金。
铝及铝合金
和破裂。
碳一级复型
样品放入真空镀膜装置中， 在垂直方向上向样品表面蒸镀 一层厚度为数十纳米旳碳膜。 把样品放入配好旳分离液中进 行电解或化学分离。 辨别率高（2－5nm）， 电子束照射下不易分解和 破裂，样品易遭到破坏。
碳膜与塑料一级复型旳区别：
1.碳膜复型旳厚度基本上相同，而塑料复型旳厚度 随试样位置而异。
下图是横截面样品旳制备示意图，如图a所示，首先将多块具有生长 薄膜旳晶片对粘在一起，然后用特殊旳装置将其压紧，经过长时间固 化后，再用线切割或者其他措施切出一种略不大于3mm旳小圆柱（ 如图b所示），确保小圆柱旳纵向接近轴线旳地方存在横截面，接下 来用金刚石锯片将小圆柱切成小旳薄片，接下来旳工作与非金属材料 旳制备相同。但是需要注意旳是，横截面样品旳制备要难得多，所以 制备旳过程中一定要小心仔细，最佳在挖坑后来再用抛光轮再抛光一 次，不然旳话在离子减薄时，生长薄膜很轻易被减掉。
钢，硅钢 镍基合金，硅钢，
马氏体时效钢
离子减薄法
首先一般是用金刚石锯将块状样品切成0.5~1mm旳薄片 ，接下来用手工研磨旳措施将薄片研磨到50μm左右，然 后用小刀片将其划为略不大于3毫米旳小块，用树脂胶或 者A、B胶将小块样品粘于铜环或者钼环上，接着用手工 研磨旳措施将其研磨至不大于20μm之后，用挖坑仪将其 减薄至不大于10μm，然后用离子减薄仪将其减薄至穿孔 为止。离子减薄是采用高能量旳Ar离子轰击样品表面，把 样品表面上旳原子团或分子团剥离样品。
透射电镜的制样方法
透射电镜的制样方法一、超薄切片法。
1.1 取材。
这可是制样的头一遭，就像盖房子打地基一样重要。
取材的时候得特别小心，要选取咱们感兴趣的部位。
这部位得有代表性啊，不能瞎取。
比如说研究细胞结构的，就得找到细胞长得好、特征明显的那块组织。
而且动作要快，就像抢红包似的，手慢无。
为啥呢？因为组织一旦离开生物体，就开始发生变化了。
1.2 固定。
固定这一步可不能含糊。
就像给组织“定个型”，让它保持生前的状态。
通常会用到化学固定剂，像戊二醛啥的。
把组织泡在里面，就像把东西放在保险柜里一样，稳稳当当的。
这一步要是没做好，后面的观察就全乱套了，那可就是“一着不慎，满盘皆输”。
1.3 脱水。
脱水就像给组织“脱衣服”，把水分一点一点去掉。
用的是一系列不同浓度的乙醇或者丙酮。
这个过程得循序渐进，不能操之过急，不然组织就会被破坏。
这就好比爬山，得一步一个脚印，急不得。
1.4 浸透与包埋。
浸透呢，就是让包埋剂慢慢渗到组织里。
包埋就像给组织做个“小房子”，把它保护起来。
常用的包埋剂有环氧树脂之类的。
这一步就像给宝贝裹上一层保护膜，得仔仔细细的。
1.5 超薄切片。
这可是个精细活，切片要薄得像蝉翼一样。
用超薄切片机来切，切的时候得全神贯注，稍有不慎就会前功尽弃。
切出来的片子就像一片片小雪花，又薄又脆弱。
二、负染法。
2.1 样品准备。
先把要观察的样品处理好，比如说提纯之类的。
这就像把菜洗干净，准备下锅一样。
得把杂质去掉，让咱们想看的东西“干干净净”地呈现出来。
2.2 负染。
用重金属盐溶液来进行负染。
这就像给样品穿上一件深色的“衣服”，让它在电镜下更明显。
染的时候要控制好量，多了少了都不行，就像炒菜放盐，得恰到好处。
三、冷冻制样法。
3.1 冷冻固定。
直接把样品快速冷冻，让它瞬间定格。
这就像给样品来了个“急冻魔法”。
这样能最大程度地保持样品的原始状态，避免化学固定带来的一些变化。
3.2 冷冻超薄切片。
在冷冻的状态下进行超薄切片。
这可不容易，就像在冰上雕刻一样，需要特殊的设备和技术。
透射电镜样品的制备
第二节透射电镜样品的制备一、表面复型和萃取复型技术（一）复型样品成像原理复型样品是一种间接试样，是用中间媒介物（碳、塑料薄膜）把样品表面浮雕复制下来，通过对浮雕的观察间接地得到样品表面组织形貌。
一定能量的入射电子照射到样品上要受到样品内原子核与核外电子的作用，产生弹性散射与非弹性散射。
非晶体复型样品成像主要取决于入射电子与试样中原子相互作用所产生的电子散射。
电子束穿过样品时在样品厚的区域或原子序数大的区域受散射程度大，反之则小。
这就是所谓的质厚衬度效应。
如果在样品下方加一光阑，那么散射角大于光阑孔径角的电子被光阑挡住或吸收，而不能穿过光阑孔参与成像。
散射角小于或等于光阑孔径角的电子就能穿过光阑孔参与成像，因此在荧光屏上就形成了明暗不同的衬度，产生了样品的图像。
图5—10为复型样品成像示意图。
（二）复型样品制备技术1．对金相试样的要求电镜的高分辨本领使它能够显示出金属组织的微细特征。
为使组织微细特征不在制备试样时失真，对图5—10 复型样品成像示意图金相试样的制备要求严格。
否则会造成假像影响对观察结果的分析。
试样要细心磨制，仔细抛光，力求避免产生微小的磨痕及变形层。
浸蚀剂与做金相试样时所用的浸蚀剂相同，浸蚀应浅些，这样可保留组织细节。
如果浸蚀过重就可能引起相界、晶界的过浸蚀，导致失真、脱落，甚至会出现腐蚀坑等假象。
2．AC纸的制作AC纸就是醋酸纤维素薄膜，是用6%醋酸纤维素丙酮溶液制作的塑料薄膜。
为了使AC 纸质地柔软、渗透性强并具有蓝色，在所配制的溶液中再加入2%磷酸三苯脂和几粒甲基酯。
待醋酸纤维素在丙酮中溶解后将其倒在干净、平滑的玻璃板上，倾斜转动玻璃板，使溶液均匀展开。
然后用玻璃钟罩扣上，让钟罩下边与下板间留有一定间隙以便于丙酮挥发。
大约经过24小时后AC纸干透，用小刀片轻划AC纸边缘，小心揭下即可。
3．塑料—碳二级复型塑料—碳二级复型由于其制备过程不损坏金相试样表面，重复性好，供观察的第二级复型—碳膜导电、导热性好，在电子束照射下较为稳定，因而得到广泛的应用。
材料分析方法-15 透射电镜样品的制备
常用方法：胶粉混合法和支持膜分散粉末法 常用支持膜的材料见下表
Grid
Figure 1. Top: Overhead view of a grid, showing the mesh. Bottom: Side view of a carbon coated grid showing the relative
注意：磨制过程中，要平稳，用力不要过大，注意冷却。
研磨薄片用的支座
三脚抛光器
②化学减薄 将切好的试片放入配制好的化学试剂中，使其表面
腐蚀而减薄。
优点： • 表面无机械硬化层 • 速度快 • 厚度可控制在20-50 μm，有利于终减薄
（3） 终减薄
①电解减薄
目前使用最广、效率最高、操作最简便的方法是双喷电解抛光 法。
等离子体激发--主要发生在金属中。当入射电子通过电子云时，金属中自由
电子基体发生振动，这种振动在10-15s内就消失了，且该振动局限在纳米范围 内，这就是等离子体激发（Plasma excitation）。等离子体激发是入射电子引 起的，因此入射电子要损失能量，这种能量损失随材料的不同而不同。利用 测量特征能量损失谱进行分析，就是能量分析显微术。若选择有特征能量的 电子成像，就是能量损失电子显微术。
薄膜样品的组织结构必须和大块样品相同，在制备过 程中，组织结构不变化；
❖ 样品相对于电子束必须有足够的透明度；
薄膜样品应有一定强度和刚度，在制备、夹持和操作 过程中不会引起变形和损坏；
在样品制备过程中不允许表面产生氧化和腐蚀。
平面样品制备的工艺过程
（1）切（取）薄片样品
从实物或大块试样上切割厚度一般厚 约200-300 μm的薄片，切割方法一般 分两类 。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
（Cs—透镜色差系数，ΔE/E—成像电子束能量变化率）
电磁透镜的特点：
可变倍率，可变焦距； 景深长，焦长长。
第一节
透射电子显微镜
电子光学系统 透射电子显微镜结构及成像原理 操作要点
Ernst Ruska （1906-1988）
1931年发明电子显微镜
1986年获诺贝尔物理学奖
第一台真正的电子显微镜（1933年Ruska）
× × × × × × × ×
× × × × × × × ×
× × × × × × F × × × × × × × × × ×
× × × × v × × × × × × × × × × × ×
× × × × × × × ×
B
Vy V。
Vx
Vx=V。Cosθ V。 Vy=V。Sinθ
磁透镜——具有轴对称弯曲磁场的装置 构成的电磁透镜
思考题
1. 什么是分辨率？为什么电镜的分辨率比 光镜高？ 2. 透射电镜是如何成像的？（成像原理） 3. 透射电镜图像不清晰的原因有哪些？
第一章
透射电子显微镜
电子光学系统 透射电子显微镜结构及成像原理 操作要点
透射电镜操作要点
1. 2. 3. 高压、电流的稳定（电镜厂家） 排除外界场地磁场、电场、振动等因素（厂商安装） 灯丝对中、光路对中（聚光镜光阑等）（工作人员）
电镜观察人员必须掌握的操作 1. 样品的更换 2. 打开灯丝电流以及灯丝饱和点的调节 3. 样品感兴趣区的寻找、放大倍数的调节（中间镜） 4. 亮度的调节（聚光镜） 5. 物镜光阑的选择与对中 6. 像散的消除 7. 焦距的调节（物镜） 8. CCD照相 9. 数码图片的保存。
成像系统
样品室 物镜 中间镜 投影镜
观察室（荧光屏） 照像机构（CCD）
观察纪录系统
透射电镜成像原理
Specimen Objective lens
Electron Bean
Aperture
非弹性散射； 物镜光阑； 电磁透镜的聚焦放大。
Image plane
透射电镜基本构造
冷、热场电子枪
λ=
12.25
U
加述电压
( KV )
电子波长 (A)
(经相对论校正)
1 2 5 10 20 30 40 80 100 500 1000
0.388 0.224 0.173 0.122 0.0859 0.0698 0.0601 0.0418 0.0370 0.0142 0.00687
B
× × × × × × × ×
电子光学系统 透射电子显微镜结构及成像原理 操作要点
透镜成像原理
A
F B B’
F
o
A’
Z
L1 1 1 1 + = L1 L2 f
f
L2
A’B’ L2 M= = AB L1
A
A’
Ra
Airy斑
0.61λ Ra= M nSinα
r
A B
R r= M
B’
R
A’
δ
A B
分辨率是指能够 区分两个质点圆 心间的最小距离。 Ra δ= M =
-1
场发射 热场发射 ZrO/W<100> 0.1—1 1800 0.6—0.8 100 稳定 不需要 5×108 10-7 3—4 年 较贵 冷场发射 W<310> 0.01—0.1 300 0.3—0.5 20—100 不稳定 需要 5×108 10-8 约 5年 较贵
钨灯丝 W 50 2800 2.3 100 稳定 不需要 5×105 10-3 几个月 20
Vz=Vo.conθ
德国实验物理学家Busch，1926
Vr=Vo.sinθ
A’ B’ L2 M= = AB L1
1 + 1 = L1 L2
1
f
磁透镜的缺陷—
几何像差
由透镜磁场几何上的缺陷引起的
像差
色差
由电子波长或能量非单一性引起的
磁透镜的缺陷—
球差
几何像差
像差
像 散 像畸变 色差
由电子波长或能量非单一性引起的
单色器 聚光镜球差校正 电制冷100mm2 环境透射电镜(E-TEM) 物镜球差校正 聚光镜 电子枪
鲁斯卡（1939）
照明系统 Illumination System
能谱仪
物镜 中间镜 成像系统 Imaging System
电镜的原位观察 (电、磁、力等)
投影镜
CCD相机
照相系统 能损谱或能量过滤器
1938年Siemens和Halske仪器 样机（Ruska，Borries）
1939年“第一系列”电子显微镜 （100A）
战后第一台Siemens仪器， 1950UM-100型
1954年，著名的Elmiskop Ⅰ （10A）
电镜不同于光镜的特点：
光源 电镜 光镜 电子束 可见光 成像透镜 电磁透镜 玻璃透镜
成像系统
样品室 物镜 中间镜 投影镜
观察室（荧光屏） 照像机构
观察纪录系统
电 子 发 射 量
b
a
灯丝电流
灯丝电流达到饱和点是获得高质量图像的必要条件
各种电子枪的比较
热电子发射 电子枪种类 光源尺寸(µ m) 发射温度(K) 能量发散度(eV) 束流 束流稳定度 闪光处理(flash) 亮度(A· -2· cm str ) 真空度 使用寿命 电子枪费用(US$)
六硼化镧 LaB6 10 1800 1.5 20 较稳定 不需要 5×106 10-5 约1年 1,000
电子枪寿命：日本电子电子枪稳定、寿命长是显著特点之一（枪室的真空度高是原因之一） 200keV = 200,000eV ± 2.3eV; 200,000eV ± 0.3eV
电子光学系统 阴极（灯丝） 电子枪 栅极 照明系统 阳极 聚光镜
JEM-ARM1250超高压透射电子显微镜
第二节 TEM的结构与成像原理
电子光学系统
真空系统
电子学系统
高压发生器
电子学系统
稳压、稳流电路
自动控制线路 前级真空泵（机械泵）
真空系统
油扩散泵/离子泵/分子泵 真空管道及自动阀门系统 真空检测系统
电子光学系统 阴极（灯丝） 电子枪 栅极 照明系统 阳极 聚光镜
生物电子显微镜技术
The Biological Electron Microscopy
透射电子显微镜
扫描电子显微镜
透射电镜及制样设备
扫描电镜及制样设备
当前生物电镜应用的主要方向：
• 生物微结构形态研究 • 生化物质元素分析
• 结构生物学
第一章
透射电子显微镜
球差
最小散焦斑 P
ac
b
Δrs=1/4 Csα （Cs—球差系数， α—磁透镜的孔径半角）
物镜球差校正前光学衍射图(ODM)
光学衍射图是分别在电子束倾斜9mrad和18mrad情况下得到的
球差的校正过程
物镜球差校正后光学衍射图(ODM)
光学衍射图是分别在电子束倾斜9mrad和18mrad情况下得到的
像畸变
枕形畸变像
桶形畸变像
旋转畸变像
桶形畸变像 旋转畸变像 枕形畸变像 理想像 理想像
像散
弱聚焦方向
强聚焦方向
像散散焦斑
z
ΔrA=ΔfA α
ΔfA—由透镜磁场非旋转对称性产生的焦距差；
电磁消像散器原理
s
N N
s
N
N
s
s
s
N
N
s
N
N
s
s
色差
E电子轨迹 E-ΔE电子轨迹
z
色差散焦斑
.α ΔE Δrc=Cs
18%
B’
A’
0.61λ
nSinα
Ra
分辨率的理论极限
德国 Ernst Abbe
Ra δ= M
n=1.4~1.6 。 α= 90
=
0.61λ nSinα
≈
1 2
λ
第一节、电子光学系统
二、电子的波性及波长
h λ= mv
1 Mv2 = eU 2
V=
2eU m
λ=
h
2emu
h=6.62×10-34 J.S e=1.60×10-19 C m=9.11×10-31 Kg