基因工程抗体的应用

（二）人源化抗体
• 为了减少嵌合抗体中鼠源性序列，人们 又将鼠抗体V区（H、L链）中的3个超变 区基因插入人抗体的V区的框架（FR） 基因中，这样构建的抗体保留了鼠抗体 与抗原结合的特异性。这种抗体几乎百 分之百人源化了。目前针对不同抗原如 肿瘤相应抗原、细胞表面受体、细胞因 子等，已构建了许多种人源化基因工程 抗体。
(三)在植物中表达
1. 用Ti质粒组装后转染的L链基因植株和 Fd链基因植株有些杂交后的子代产生 rhAb 2. 用TΒιβλιοθήκη Baidu质粒将L链、Fd链导入根瘤菌，再 感染植物细胞，在植株体内含有rhAb
第四章
• • • • •
基因工程抗体
一、抗体的基因结构和重排 二、基因工程抗体的构建和类型 三、基因工程抗体的表达 四、导向药物 五、基因工程抗体的导向生物治疗
一、抗体的基因结构和重排
• （一）重链V区基因人类VH（119）-D （30）-J（9） • （二）轻链基因的结构和重排 如图19-2 κ链：Vκ（100）、Jκ（5）、Cκ（1） λ链： Vλ （100）Jλ（6） Cλ（6） • （三）重链C区基因 如图19-3 Cμ-Cδ-Cγ3Cγ1-Cε2-Cα1-Cγ2-Cγ4-Cε-Cα2
重组Fab片断
• 重组Fab片断是单价的VH-CH（Fd）和轻 链的VL-CL两个片断由二硫键连接而成。 它具有与抗体相同的抗原结合活性，其 特点是结构稳定，制作简便。细菌表达 的Fab与酶解Ig后所获得的Fab具有相同 的功能。
单域结构VH或VL
• 分别由单域VH或VL采用基因工程法构建的抗体 组成，该类抗体构建简便，鉴于在抗原结合部 位中，VH作用比VL大，大多数单独的VH保留 了较好的抗原结合能力和专一性，单独VL抗体 因只有一个功能区而没有抗原结合能力，无应 用价值，因此单域VH抗体在制备和应上有其优 点，然而由于暴露了原先与VL结合的疏水性， 使其特异性降低，还需对VH片断做一些结构改 造才能应用。
双特异性抗体
• 双特异性抗体：将两个抗体的重链和轻链V区 基因的重组体导入宿主细胞中表达，或用肽链 连接物连接两种不同特异性抗体的可变区基因， 构建单肽双特异性抗体。如：将抗肿瘤细胞 EGFR的Fab与抗T细胞CD3的Fab组成双特异性 抗体，有助于介导T细胞杀肿瘤（连接效-靶细 胞）（如图19-4）。抗纤维蛋白的ScFv-tPA基 因连接，有助于与血栓中的纤维蛋白结合，使 tPA定位溶解血栓，此外还可作为载体将毒素、 核酸、药物、定位于靶细胞，发挥治疗肿瘤和 心血管疾病。
RT-PCR制备cDNA
• 设计VH/VL或L链/Fd链基因上、下游引物 进行RT-PCR
抗体组合文库技术
• 将PCR产物VH/VL或L链/Fd链重组到粘粒 或杆状噬菌体载体中建立文库
噬菌体表面呈现技术（phage display technology）
• 将Fab或ScFv基因插入噬菌体外壳蛋白基 因的gⅢ或gⅤⅣ区先导序列下游，在噬 菌体外壳表面呈现基因表达蛋白，如图 19-5。
四、导向药物
• 导向药物是由单抗与放射性核素(诊断用)、 毒素或化学药物的偶合物，也可用破坏 细胞结构的酶、细胞因子等连接，称为 生物导弹，可特异地导向靶细胞的特定 位点，发挥特意诊断和治疗作用。
五、基因工程抗体的导向生物治疗
• 单克隆抗体作为诊断试剂，应用已相当普遍。 但单抗作为生物导弹的治疗剂，鼠源性单抗常 会因过敏反应而妖折，自基因工程抗体问世后， 成为最有前景的发展领域。常用于溶栓、杀肿 瘤、抗病毒感染、杀死耐药菌的生物治疗。甚 至可用抗HIV的ScFv基因来阻止HIV复制等。 随着噬菌体表面呈现技术的发展，抗体组合文 库技术的成熟和推广应用，单抗的生物导弹功 效将会有效发挥，其临床应用前景较为广阔， 市场是巨大的，必将会产生巨大的社会和经济 效益。
（四）人源性单抗的抗体组合 文库技术（原理）
• • • • 1．mRNA的提取 2．RT-PCR制备cDNA 3．抗体组合文库技术 4．噬菌体表面呈现技术（phage display technology） • 5．阳性克隆的筛选
二、基因工程抗体的构建和类型
• • • • (一)嵌合抗体(Chimeric Antibody) (二)人源化抗体(Humaniged antibody) (三)小分子抗体 （四）人源性单抗的抗体组合文库技术
(一)在哺乳动物细胞（CHO） 中的表达
• 将含Fd和L链基因的重组载体转染CHO细 胞，分泌糖基化的rhAb（重组人抗体）， 可达50mg/L。
(二)在微生物(原核)细胞中的表 达
1. 分泌型：用pactac质粒重组后在E.coli 中 用IPTG诱导下分泌到胞膜腔中 2. 包涵体型：用 pAM1控温质粒30℃增殖， 42 ℃诱导产生rhAb包含体
免疫粘连素
• 抗体恒定区（C区）N-端基因连接人细胞受体 （CD4-FC）或粘附分子基因在真核细胞中表 达正确折叠的抗体样融合蛋白（称免疫粘连 素），，N端为同一种分子称为同源二聚体结 构。N端为两种不同的分子称异源二聚体结构。 一方面可发挥抗体效应，另一方面N端CD4为T 细胞亚类糖蛋白，又是HIV受体，CD4可与 HIV结合由FC活性杀灭HIV，可阻断HIV感染T 细胞。
（一）嵌合抗体
• 鼠Ig的V区与人Ig的恒定区（C区）基因重组后， 在原核细胞或真核细胞中表达，这种嵌合抗体 含75～80%人抗体，20%鼠抗体,注入人体后可 减少人抗鼠抗体的反应。其优点是减少了鼠单 抗的免疫原性，另外人抗体C区仍可有效地发 挥补体激活和与FC受体结合的生物学活性，在 构建时可以有目的地选择抗体类型，可有效地 发挥抗体的生物效应，已有多种针对不同抗原 的嵌合抗体的报道、但多为IgG1亚类。
阳性克隆的筛选
• 当抗体Fab或ScFv在噬菌体外壳表面呈现 后，可采用固相柱层吸附、洗脱、括增 的富集性选择法从抗体库中筛选出阳性 克隆（如图19-6），从中阳性克隆基因 与表达载体重组进行表达。
人源性单抗的抗体组合文库技 术的原理
• 原理：模拟抗体多样性机制，把人B淋巴 细胞谱中的L链基因和Fd基因以及VH-VL 基因片段克隆并随机组合到粘粒或杆状 噬菌体载体中建库
催化抗体
• 基因工程催化抗体是通过在轻链V区插入 能与金属离子结合的氨基酸序列，再与 重链V区重组，使重链V区识别抗原，并 选择性地结合底物，轻链则可通过促进 底物反应过渡态的形成而发挥催化作用。
三、基因工程抗体的表达
• • • • (一)在哺乳动物细胞（CHO）中的表达 (二)在微生物(原核)细胞中的表达 (三)在植物中表达 （四）在酵母中表达
(三)小分子抗体
• • • • • • （1）单链抗体(Single Chain Fv ScFv) （2）重组Fab片断 （3）单域结构VH或VL （4）双特异性抗体 （5）免疫粘连素 （6）催化抗体
单链抗体
• 单链抗体(Single Chain Fv ScFv);它是由抗 体重，轻链的可变区基因(VH、VL)之间 通过一段编码连接肽基因，拼接后表达 形成的重组蛋白。是一种具有抗原结合 能力的最小抗体片段，可在一些不需Fc 段效应功能的实际应用中开展研究和应 用。其优点是分子量小，易于穿透组织 到达靶器官发挥功效，易于构建和生产， 但易于被清除。