连续稀释分离法 - 360文档中心

微生物的分离和纯培养无菌技术无菌技术

连续培养：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。连续培养理论基础：由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。
连续培养原理当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。

连续培养和单批培养的比较
连续流入新鲜培养液单批培养恒浊法
lg细胞数（个/ml）
4、选择性培养分离法为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。利用选择培养基进行直接分离富集培养
三、微生物的培养
1、好氧培养和厌氧培养好氧培养以空气为氧的来源。实验室的培养方法用平皿培养和斜面培养；工业生产时用自然对流和机械通风法来供氧；液体培养时微生物利用培养液中的溶解氧；液体三角瓶培养时利用摇床机达到供氧的目的；发酵罐培养时用通入无菌压缩空气达到供氧的目的。
微生物的分离和纯培养
一、无菌技术
无菌技术：是将微生物分离、转接及培养时防止被其它微生物污染的技术。 1、对使用的器皿及用具的灭菌 2、对培养基的灭菌通常使用的方法有高温蒸汽灭菌和高温干热灭菌，效果达到无菌（不含任何微生物)。
3、无菌的环境（1）在操作过程中的无菌要求：接种、分离过程的无菌效果（在火焰上部进行操作）。（2）在超净工作台、无菌室和无菌箱中进行操作。使用甲醛、紫外线、75%的乙醇等进行预处理及其他的必要措施。（3）如进行好氧培养需对空气进行处理，实验室用多层纱布、棉塞和硅胶塞过滤空气，工业中使用空气过滤器过滤空气。

四大类微生物菌落形态的比较和识别

四大类微生物菌落形态的比较和识别一、实验目的和内容目的：1 熟悉四大类微生物菌落的主要特征2 掌握识别四大类微生物菌落形态的依据和要点，并应用于识别未知菌落内容：1 观察已知的四大类微生物菌落特征2 辨认未知的四大类微生物菌落特征实验原理掌握识别四大类微生物菌落形态的要点对于从事菌种的筛选、杂菌的识别和菌种鉴定等项工作都有重要意义。

菌落是由某一微生物的少数细胞或孢子在固体培养基表面繁殖后所形成的子细胞群体，因此，菌落形态在一定程度上是个体细胞形态和结构在宏观上的反映。

由于每一大类微生物都有其独特的细胞形态，因而其菌落形态特征也各异。

在四大类微生物的菌落中，细菌和酵母菌的形态较接近，放线菌和霉菌形态较相似。

菌和酵母菌的异同细菌和多数酵母菌都是单细胞微生物。

菌落中各细胞间都充满毛细管水、养料和某些代谢产物，因此，细菌和酵母菌的菌落形态具有尖似的特征，如湿润、较光滑、较透明、易挑起、菌落正反面及边缘、中央部位的颜色一致，且菌落质地较均匀等。

它们之间的区别如下：细菌：由于细胞小，故形成的菌落也较小，较薄、较透明且有“细腻”感。

不同的细菌会产生不同的色素，因此常会出现五颜六色的菌落。

此外，有些细菌具有特殊的细胞结构，因此，在菌落形态上也有所反映，如无鞭毛不能运动的细菌其菌落外形较圆而凸起；有鞭毛能运动的细菌其菌落往往大而扁平，周缘不整齐，而运动能力特强的细菌则出现更大、更扁平的菌落，其边缘从不规则、缺刻状直至出现迁居性的菌落，例如变形杆菌属和菌种。

具有荚膜的细菌其菌落更粘稠、光滑、透明。

荚膜较厚的细菌其菌落甚至呈透明的水珠状。

有芽孢的细菌常因其折光率和其他原因而使菌落呈粗糙、不透明、多皱褶等特征。

细菌还常因分解含氮有机物而产生臭味，这也有助于菌落的识别。

酵母菌：由于细胞较大（直径约比细菌大10倍）且不能运动，故其菌落一般比细菌大、厚而且透明度较差。

酵母菌产生色素较为单一，通常呈矿蜡色，少数为橙红色，个别是黑色。

微生物分离纯化的方法

微生物分离纯化的方法微生物分离纯化的方法是一种将复杂微生物混合物分离为纯化菌株的过程。

这是研究微生物多样性，发现新的微生物物种，以及从微生物中获得新的代谢产物等研究领域的关键步骤之一、以下是几种常见的微生物分离纯化的方法：1.常规分离法：常规分离方法是一种最常用的微生物分离技术。

该方法基于微生物菌落形态和特性的观察和比较，通过选取和分离菌落来获取纯化的微生物。

常见的常规分离方法包括移植法、罐培养法和环扩散法等。

2.筛选培养基：筛选培养基是通过优化微生物的培养条件，选择能够选择性生长其中一特定微生物的培养基。

这种方法常用于分离特定类型的微生物，例如革兰氏阳性菌、细菌等。

常见的筛选培养基包括含有特定抗生素、特定营养物质或特定pH值的培养基。

3.稀释分离法：稀释分离法是一种通过连续稀释样品来使微生物单个分离的方法。

首先，将样品连续稀释，然后在培养基上接种稀释液，并进行培养。

稀释分离法适用于稀释样品中含有少量微生物的情况，可以帮助分离纯化微生物。

4.毛细管扩散法：这是一种通过毛细管将微生物分离到培养基上的方法。

首先，将培养基注入玻璃毛细管中，并将其将培养基表面用火焰加热，使其与空气接触。

然后，将毛细管插入样品中，微生物通过毛细管扩散到培养基中。

这种方法使用较少的培养基和试剂，能够直接从样品中获得纯化的微生物。

5.细胞分离技术：细胞分离技术是通过分离微生物细胞来纯化微生物的方法。

这种方法包括细胞离心、滤膜分离和凝胶过滤等。

通过这些方法，可以将微生物细胞从细胞混合物中分离出来，从而获得纯化的微生物。

以上是几种常见的微生物分离纯化的方法。

根据具体的实验目的和样品特点，可以选择合适的方法进行微生物的分离纯化。

这些方法在微生物研究和应用中起着至关重要的作用，有助于深入了解微生物的多样性和功能。

微生物菌种分离和鉴定技术

产生新的问题：将有越来越多的分类单元不能只以表型特征进行鉴别，必须结合基因型测定才能鉴定。
微生物菌种鉴定技术
表征（表型）特征形态特征生理和代谢特征生态特征
遗传（基因型）特征蛋白质比较核酸碱基组成核酸序列
分子标尺
多相鉴定技术 Polyphasic Identification
新型显色培养基：
利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物的培养基。
微生物快速分离、计数方法
Petrifilm Plate (3M)
微生物快速分离、计数方法
3M Petrifilm Plate
Aerobic Count Plate Coliform Count Plate Rapid Coliform Count Plate E. coli /Coliform Count Plate Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count Plate Staph. aureus Express Count Plate Environmental Listeria Plate
单细胞（孢子）分离
选择培养基分离
传统选择性培养基
血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标
本。中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制革兰阳性细菌，有选择地促进G-菌生长，
是较好的弱选择性培养基。麦康凯平板：具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。 SS琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。碱性琼脂：用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。血液增菌培养基：用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌

土壤、水质检测——放线菌、霉菌、大肠杆菌的分离方法

土壤、水质检测——放线菌、霉菌、大肠杆菌的分离方法微生物因为体积小、质量轻、适应性强、繁殖能力强等特点，广泛分布于自然界中。

它们存在于食品、化妆品、饲料、环境等人们能触及的各个角落中。

某些微生物对产品的污染，不仅影响到产品本身的质量，更严重的是它危及消费者的健康和安全。

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主要针对食品、医药、化妆品、农产品、一次性产品以及工业产品等进行微生物检测以及产品微生物污染分析。

以下介绍几种菌的分离方法：一、从土壤中分离放线菌1.制作高氏一号培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。

2.称取土壤10克，放入装有100毫升无菌水的锥形瓶中，并加入10%酚10滴，以抑制细菌生长。

振荡10分钟，制成10-1菌悬液。

按照连续稀释分离法，进一步制成10-3菌悬液。

3.用移液管吸取0.1毫升10-3菌悬液，注入平板培养基上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上。

然后将培养皿倒置于25-30℃温箱中，培养7-10天，培养基上会出现微生物菌落。

如果菌落的硬度较大，干燥致密，且与基质紧密结合，不易被针挑起，这就是放线菌菌落。

4.挑取放线菌菌落，接种于斜面培养基上。

二、从土壤中分离霉菌1.制作豆芽汗葡萄糖培养基，并添加80%乳酸数滴，以抑制细菌生长。

将培养皿中，凝成平板，待用。

2.称取10克土壤，按上述分离放线菌的方法制成10-4或10-5的菌悬液。

3.取0.1毫升菌悬液注入培养皿内培养基上，用玻璃刮刀涂抹均匀。

然后将培养皿倒置于2 5-30℃温箱内培养3-4天。

培养基上会出现微生物菌落。

霉菌菌落常长成绒状、棉絮状或蜘蛛网状，可根据这一特征寻找霉菌菌落。

4.挑取培养皿内的霉菌菌落接种于斜面培养基上三、从饮水中分离大肠杆菌1.制作伊红美蓝培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。

2.用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1:10稀释。

菌落分离纯化的方法

菌落分离纯化的方法
菌落分离纯化是微生物学中常用的一种方法，用于从混合培养基中分离出纯种细菌。

以下是一些常见的菌落分离纯化方法：
1. 灭菌分液法，将混合培养基均匀涂布在琼脂平板上，培养后在形成的菌落中选择单个菌落，用接种环在无菌条件下转移到新的琼脂平板上，经过培养后得到纯种菌落。

2. 稀释分液法，将混合培养基连续稀释后，在琼脂平板上均匀涂布，使得每个菌落都来自于单个细胞，然后进行培养，最终得到纯种菌落。

3. 过筛法，将混合培养基均匀涂布在琼脂平板上，培养后用无菌玻璃珠滚动在菌落上，使得每个菌落只有一个细胞，然后用接种环转移到新的琼脂平板上培养，得到纯种菌落。

4. 挑拣法，在混合培养基上直接挑选出单个菌落，然后用接种环转移到新的琼脂平板上培养，得到纯种菌落。

这些方法都可以用于分离纯化菌落，选择合适的方法取决于具
体的实验要求和操作技能。

值得注意的是，在进行菌落分离纯化时，需要严格遵守无菌操作规范，以避免外源微生物的污染。

分离接种实验报告

一、实验目的1. 学习和掌握微生物分离接种的基本原理和方法；2. 熟悉微生物纯种培养技术；3. 提高无菌操作技能。

二、实验原理微生物分离接种是微生物学实验中的一项基本操作，其主要目的是从混杂的微生物群体中分离出所需的纯种微生物。

实验原理主要包括以下两个方面：1. 稀释分离法：通过将微生物群体在适宜的培养基上进行稀释，使每个稀释度内仅含有一个或几个微生物细胞，然后选取单菌落进行培养，从而达到分离纯化的目的。

2. 选择培养法：根据微生物对特定条件的适应性，选择合适的培养基和培养条件，使所需的微生物生长繁殖，而抑制其他微生物的生长，从而实现分离纯化。

三、实验材料1. 菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌等；2. 培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基、琼脂糖固体培养基、液体培养基等；3. 试剂：无菌水、无菌生理盐水、无菌酒精、无菌接种环等；4. 仪器：无菌操作台、酒精灯、接种环、接种针、显微镜等。

四、实验步骤1. 准备工作（1）将无菌操作台、酒精灯、接种环、接种针等实验器材进行消毒处理；（2）将牛肉膏蛋白胨固体培养基和琼脂糖固体培养基在无菌条件下进行配制，并倒入培养皿中，待凝固后备用；（3）将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌等菌种在无菌条件下进行复苏，并制备成菌悬液。

2. 微生物分离接种（1）稀释分离法① 取无菌接种环，蘸取菌悬液，在牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上进行划线；② 重复上述操作，使菌悬液在平板上形成一系列平行线；③ 将平板倒置，放入37℃恒温培养箱中培养24小时；④ 观察菌落生长情况，选取单菌落进行纯化培养。

（2）选择培养法① 将菌悬液接种于琼脂糖固体培养基平板上；②在平板上加入适量抗生素，使平板成为选择培养基；③ 将平板倒置，放入37℃恒温培养箱中培养24小时；④ 观察菌落生长情况，选取单菌落进行纯化培养。

3. 纯化培养（1）将单菌落挑取至新的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上；（2）将平板倒置，放入37℃恒温培养箱中培养24小时；（3）观察菌落生长情况，确认纯化成功。

微生物纯种的分离方法

微生物纯种的分离方法自然界中的微生物总是杂居在一起，即使一粒土或一滴水中也生存着多种微生物。

要研究其中的某一种微生物，首先必须将它分离出来。

下面介绍几种纯种微生物的分离方法。

平板划线分离将已经熔化的培养基倒入培养皿中制成平板，用接种环沾取少量待分离的材料，在培养基表面平行或分区划线(图5-5)，然后，将培养皿放入恒温箱里培养。

在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成纯种的单个菌落。

液体稀释法将待分离的样品经过大量稀释后，取稀释液均匀地涂布在培养皿中的培养基表面，培养后就可能得到单个菌落。

利用选择培养基进行分离不同的微生物对不同的试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特点可配制出适合某种微生物生长而限制其他微生物生长的选择培养基。

用这种培养基来培养微生物就可以达到纯种分离的目的。

菌丝尖端切割这种方法适于丝状真菌。

用无菌的解剖刀切取位于菌落边缘的菌丝的尖端，将它们移到合适的培养基上培养后，就能得到新菌落三、细菌的分离与计数（一）背景知识介绍1.细菌的分离与纯化自然界的细菌总是以杂居的方式存在，如土壤、水、空气等都分布着种类繁多的细菌。

我们如何知道这些杂居的细菌是哪种细菌呢？这就需要将这些带菌的材料中混杂的细菌，经过稀释，使其分散成单个存在的菌体，在固体培养基平板上，长成肉眼可见并具有一定特征的菌落。

这些菌落分离出来，进行纯培养。

所谓纯培养即在一个培养物中，所有的细菌都是由一个细菌分裂繁殖而产生的后代。

这种获得单一菌株纯培养的的方法称为细菌的分离。

常用的分离方法有稀释法和划线法。

（二）课题提出：我们的身体和周围的环境有大量的细菌，细菌与我们的生活和健康密切相关。

但是，自然存在的细菌都混杂在一起，我们要想研究和了解各种细菌的形态结构和功能，就要对其进行分离纯化，才能进行深入的研究。

如对一些致病菌的研究，食品卫生的研究，微生物工业的研究等。

在研究过程中，有时需要调查和检测细菌密度，则需要统计细菌的数量。

微生物分离原理

微生物分离原理
微生物分离是一种常用的实验方法，用于分离和培养单一的微生物菌株。

其原理主要包括以下几个方面。

1. 稀释法：通过将微生物污染物或样品进行一系列的稀释，依靠概率的随机分布，使微生物个体分散在培养基上。

然后，通过无菌的针筒或平板涂布法将其分散均匀后进行培养。

2. 针对性分离法：针对自然样品中特定的微生物，根据其特性选择特定的培养基，包括特异的生理反应、生长因子等，并结合不同的温度、pH等环境条件，使目标微生物菌株生长而其他的微生物不能生长。

3. 选择培养基法：针对特定微生物的特异性要求，设计配制一种特定的培养基，只有特定的微生物能够在该培养基上生长而其他的微生物不能生长。

4. 纯化分离法：通过连续传代培养，将混合培养物中的微生物不断分离纯化，直至获得单一的纯培养物。

5. 涂布法：通过将微生物样品均匀涂布在培养基表面，利用微生物的生长特点形成独立的菌落，从而分离出单一的微生物。

6. 降温法：依靠微生物的生长特性和温度敏感性，通过一定的温度处理，使目标微生物因为生长受到抑制而其他微生物得到排除。

通过以上不同的分离方法，可以有效地从混合的微生物中获取纯净的单一微生物菌株，为后续的实验研究提供可靠的基础。

植物病原菌的分离

植物病原菌的分离一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。

植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。

植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。

二、实验目的植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。

通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。

三、实验材料及准备1.分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。

2.分离用具：酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）0.1%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。

四、实验方法及步骤（一）分离前的准备工作：1.工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。

若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。

在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。

工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。

常用的微生物分离纯化方法

(一) 常用的微生物分离纯化方法菌种分离纯化的方法有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养分离法等。

其中前三种方法最为常用,不需要特殊的仪器设备, 分离纯化效果好, 现分别简述如下1. 稀释混合倒平板法平板是指经熔化的固体培养基倒入无菌培养皿中, 冷却凝固而成的盛有固体培养基的平皿。

该法是先将待分离的含菌样品, 用无菌生理盐水作一系列的稀释(常用十倍稀释法, 稀释倍数要适当), 然后分别取不同稀释液少许(0.5-1.0ml)于无菌培养皿中, 倾入已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基, 迅速旋摇, 充分混匀。

待琼脂凝固后, 即成为可能含菌的琼脂平板。

于恒温箱中倒置培养一定时间后, 在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散的单个菌落。

每个菌落可能是由一个细胞繁殖形成的。

挑取单一个菌落, 一般再重复该法1-2次, 结合显微镜检测个体形态特征,便可得到真正的纯培养物。

若样品稀释时能充分混匀,取样量和稀释倍数准确,则该法还可用于活菌数测定。

图 4 混合倒平板操作法示意图图 5 涂布平板操作法示意图2. 稀释涂布平板法采用上述稀释混合倒平板法有两个缺点，一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间,缺乏溶氧而生长受影响,形成的菌落微小难于挑取；一是在倾入熔化琼脂培养基时，若温度控制过高,易烫死某些热敏感菌，过低则会引起琼脂太快凝固, 不能充分混匀。

在微生物学研究中, 更常用的纯种分离方法是稀释涂布平板法。

该法是将已熔化并冷却至约50℃(减少冷凝水)的琼脂培养基, 先倒入无菌培养皿中, 制成无菌平板。

待充分冷却凝固后,将一定量(约0.1 ml)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面, 再用三角形无菌玻璃涂棒涂布,使菌液均匀分散在整个平板表面, 倒置温箱培养后挑取单个菌落。

另一种简单快速有效的涂布平板法, 可省去含菌样品悬液的稀释, 直接吸取经振荡分散的样品悬浮液l滴加入1号琼脂平板上, 用一支三角形无菌玻璃涂棒均匀涂布, 用此涂棒再连续涂布2号、3号、4号平板(连续涂布起逐渐稀释作用，涂布平板数视样品浓度而定), 翻转此涂棒再涂布5号、6号平板, 经适温倒置培养后挑取单个菌落。

实验11环境微生物的检测_基础生物学实验（安徽大学研究生复试用,生物生命科学）

实验11环境微⽣物的检测_基础⽣物学实验（安徽⼤学研究⽣复试⽤,⽣物⽣命科学）实验⼗⼀环境微⽣物的检测⼀、实验⽬的1.学习从混杂的微⽣物群体中分离纯化微⽣物的⽅法，掌握分离纯化的基本操作技术；2.学会从菌落及培养特征辨别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌四⼤类微⽣物；3.学会好氧、厌氧的微⽣物平板及斜⾯培养的⽅法。

⼆、实验原理从杂居在⼀起的微⽣物群体中获得只含有某⼀种或某⼀株微⽣物的过程称为微⽣物的分离与纯化。

具体的⽅法有1.单细胞挑取法简易单孢⼦分离法是⼀种不需显微单孢操作器，可直接在普通显微镜下利⽤低倍镜分离单孢⼦的⽅法。

它采⽤很细的⽑细管吸取较稀的萌发的孢⼦悬浮液滴在培养⽫盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴，将只含有⼀个萌发孢⼦的微滴放⼀⼩块营养琼脂⽚上，使发育成微⼩菌落。

再将微⼩菌落转移到培养基中，即可获得仅由单个孢⼦发育⽽成的纯培养。

2.平板分离法该⽅法操作简便，普遍⽤于微⽣物的分离、纯化。

基本原理包括：（1）选择适合的待分离微⽣物的⽣长条件，例如营养条件、合适的酸碱度、温度和氧等要求或加⼊某种抑制剂造成只利于该微⽣物⽣长，⽽抑制其他微⽣物⽣长的环境，从⽽淘汰⼀些不需要的微⽣物。

（2）微⽣物在固体培养基上⽣长繁殖形成的单个菌落可以是由⼀个细胞繁殖⽽成的集合体。

可以通过挑取单菌落⽽获得⼀种纯培养，获取单个菌落的⽅法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术完成。

值得⼀提的是从微⽣物群体中经分离⽣长在平板上的单个菌落并不⼀定保证是纯培养。

纯培养的确定除了观察其菌落形态外，还要结合显微镜观察到的个体形态特征后才能确定，有些微⽣物的纯培养要经过⼀系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定⽅能得到。

⼟壤是微⽣物⽣活的⼤本营，它所含微⽣物⽆论是种类还是数量上都是极其丰富的。

因此⼟壤是微⽣物多样性的重要场所，是开发微⽣物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化得到许多有价值的微⽣物菌株。

本实验将采⽤以下不同的培养基从⼟壤中分离出不同类型的微⽣物。

微藻分离及保存

1用液体培养基分离培养的方法用液体培养基培养分离的藻种首先要配制培养液,液体培养基通常用消毒海水按常规配方(例如F/2培养基)配制,或者根据不同的微藻采用其专用的培养基配方。

分离和培养的工具、器皿要进行高温灭菌。

1.1样品系列稀释分离法1.1.1原理在无菌操作的条件下,对分离的样品采用逐步稀释的方法,边稀释,边在显微镜下镜检,直到视野中每滴样品只含1个细胞时,即停止稀释,开始分接培养。

1.1.2方法首先在第一个试管中加入要分离的藻液样品,其他试管中加入等量培养液,加入培养液的体积根据分离样品的具体情况而定(如10ml),从第一试管中吸取和培养液同体积的藻液样品(10mL)加到第二支试管中,充分振荡摇匀,此时藻液被稀释了2倍,再用一支新的消毒的移液管,吸取第二支试管中的稀释藻液(10mL)加入第三支试管中,如前振荡,使均匀稀释,此时藻液被稀释了4倍,以后的试管依次采用同样的方法稀释,直到镜检每滴稀释样品中只有1个细胞,可以用这样的稀释藻液进行培养,最终的稀释液种分装到不同的试管中,用棉塞塞好试管,把试管放在有漫射阳光的地方,每日轻轻摇动几次,发现试管中有藻色后进行镜检,如镜检到单种则表示分离成功,此时已达到了分离、纯化的目的,可进行扩大培养。

1.1.3应用概况样品系列稀释分离法设备简单,操作简便,工作量小,但是这个技术有很大的盲目性,分离的样品很可能来自两个或更多的细胞,分离的微藻单种不一定是目标种,但可能分离到其他种或新种,尤其对于从天然水域采取水样的初步分离非常适合,而且对于微藻的种类、大小没有限制。

1.2微吸管分离法1.2.1原理在无菌操作条件下,用极细的微吸管,在显微镜下把目标藻样从一个玻片移到另一个玻片,采用同样的方法反复操作,直到镜检水滴中只有目标单种为止。

1.2.2方法在微吸管的顶端套一条长约8cm的医用乳胶管,分离操作时,用手指压紧乳胶管以控制吸取动作。

将分离的水样置于载玻片上,在显微镜下把微吸管口对准要分离的藻细胞,放松手指,藻细胞被吸入微吸管;接着把吸出的水滴放在另一载玻片上,显微镜检查水滴中是否只吸到藻细胞,经过如此再反复操作,直至达到单种分离的目的。

5-7、土壤稀释分离

实验(五)－(七)
从土壤中稀释分离微生物
实验(五) ：配培养基、准备实验材料（此次不写实验报告）每4个同学组成1个大组，每大组准备如下物品： 1、配培养基： 1000mL / 大组，配方见实验书 A1-4、A5-8、B1-4、B5-8 组：牛肉膏蛋白胨培养基， C1-4、C5-8、D1-4、D5-8 组：马丁(Martin)－孟加拉红培养基配制方法：（1）药品称瓷量杯中(先称无机盐，后称有机物)，先加自来水500-600mL, 电炉加热，搅拌溶解后，牛肉膏培养基调pH至 7.0-7.2，马丁培养基每杯加孟加拉红？mL(此次不加链霉素)，再将两种培养基分别定容至1000mL。（2）琼脂粉先称至各个三角瓶中（必须用500mL三角瓶), 3.8 - 4克 / 瓶, 再装入培养基液体，200mL / 瓶, 5瓶 / 组。塞瓶塞，包报纸。 2、灭菌水：向？mL大蓝盖瓶加自来水100mL，并加玻璃珠8－10粒，1瓶 / 组。向？mL小蓝盖瓶加自来水100mL，不加玻璃珠， 1 瓶 / 组。 3、塑料耗材：每组用信封装 1.5mL塑料离心管12-14只，订书机封口。每组用塑料盒装 1mL 塑料吸头 (1mL tip) 1盒, 橡皮筋捆扎。 4、培养皿：每组用报纸包 5 筒培养皿，11皿 / 筒。以上物品放入大铁丝筐，送至？灭菌室，灭菌备用。
实验（六）从土壤中稀释分离微生物一、土壤悬液制备：每4个同学准备1瓶土壤悬液：称10克土壤放入带玻璃珠的90ml瓶装无菌水中，手摇振荡，使土样分散。二、悬液稀释：每2个同学做一套土样悬液的系列稀释，方法见下图：
每个皿加 0.1ml 稀释液
－1，－2，－3涂马丁－孟加拉红平板
－4，－5，－6涂牛肉膏蛋白胨平板
3，计算：活菌数目/每克土＝

植物病原菌分离方法

植物病原菌分离方法（综合版）植物病原细菌分离方法：分离培养基（NA）植物病原细菌的方法一般采用稀释分离法：1.取灭菌研钵加无菌水适量，切去4 mm大小病块组织，经过表面消毒和无菌水冲洗3次后放入研钵中研碎，静置10-15 min，使组织中的细菌进入水中制成悬浮液；2.配制不同稀释度的细菌悬浮液；准备3-5个灭菌培养皿，每个加200 µl无菌水；3.用灭菌移植环从第1个培养皿中移植1-2环细菌悬浮液到第2个培养皿中，充分混匀后再从第2个培养皿移植1-2环到第3个培养皿中，依次类推；4.平板划线分离，28℃培养2-3天；5.挑取单菌落划线再次纯化；菌落形态观察：1.形状和大小、颜色和光泽、表面是否隆起或凹陷、边缘的形状、透明度和粘度、培养基颜色的变化等；2.菌苔表面有光滑的、不平整的和皱褶的、易挑取、质地均匀3.菌苔颜色也不同，质地有粘质的、膜质的或蜡质的。

有透明的、半透明的或不透明的，表面有暗色或发亮的4.菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等特征注：1.若分离成功，平板上菌落形态和大小比较一致，即使出现几种不同形状的菌落，终有一种是主要的；2.如果菌落类型很多，且不分主次，很可能未分离到病原细菌，应考虑重新分离；3.如果不熟悉一种细菌菌落的性状，就应选择几种不同类型的菌落，分别培养后接种测定其致病性，最终确定病原菌；4.一种细菌病害一般由一种病原菌引起的，平板上出现几种不同类型的菌落实质上只有一种是真正的病原细菌；5.腐烂型的细菌病害即使是混合侵染的，但也有一种是主要的。

6.各种植物病原细菌生长快慢不同：假单胞菌属和欧文氏菌属1-2天土壤杆菌属细菌2-3天黄单胞菌属细菌3-4天棒杆菌属的细菌5-8天才出现明显的菌落植物病原细菌生长量测定法直接法测体积粗放的方法，将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心，然后观察沉降物的体积。

称干重采用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10%~20%。

稀释涂布平板法分离微生物的原理

稀释涂布平板法分离微生物的原理
稀释涂布平板法是一种用于分离和计数微生物（细菌、真菌等）的方法，通常用于环境样品、食品样品等的微生物学研究。

以下是该方法的基本原理：
1.样品的系列稀释：首先，将样品通过一系列的稀释，
例如10倍或100倍的稀释，以获得不同浓度的样品。

这样可
以确保在培养基上形成的菌落数量适中，以便进行计数。

2.涂布：将每个稀释样品取一定量涂布在培养基平板上，
然后使用均匀的涂布器将样品均匀涂布在平板表面。

3.培养：将涂布后的培养基平板放入恒温培养箱中，提
供适当的温度和湿度条件，促使微生物在培养基上生长。

4.菌落形成：在培养一段时间后，微生物开始在培养基
上形成可见的单个或聚集的菌落。

每个菌落代表了一个单独的
微生物个体。

5.计数：对于每个平板，使用计数器或计数方法，统计
菌落的数量。

由于进行了系列稀释，可以选择在每个平板上能
够清晰计数的菌落数量，以估算原始样品中微生物的数量。

6.计算浓度：最后，根据稀释倍数、培养基平板的面积
以及计数得到的菌落数量，计算出原始样品中微生物的浓度。

这种方法的优势在于可以得到相对准确的微生物计数，并且适用于分离和检测不同种类的微生物。

然而，需要注意的是，培养基的选
择和培养条件的控制对于不同类型的微生物有一定的影响，而且某些微生物可能不适合通过这种方法进行分离。

稀释分离法步骤

稀释分离法步骤
那咱就来说说稀释分离法的步骤哈。

稀释分离法呢，是个挺有趣的小实验方法哦。

咱先得准备好材料，就像要做饭得先把食材准备好一样。

要有需要分离的样品，这就像是咱们要分拣的小宝贝们，还得有合适的培养基，这培养基就像是小宝贝们的小床，能让它们在上面舒舒服服地生长。

然后就开始动手啦。

把样品放到一个有液体的容器里，这个液体呢，可以让样品均匀地分散开，就像把一群小豆子放到水里，让它们到处游一游。

接下来就是关键的稀释步骤啦。

取一些这个混合好的液体，放到新的装有液体的容器里，再搅拌均匀。

这一步就像是把一群小动物分成几个小群一样，越分越少啦。

这个稀释的倍数得根据实际情况来定哦，就像做菜放调料，得看自己的口味和食材的多少。

稀释完了之后呢，就把这些稀释后的液体取一点，放到培养皿里的培养基上。

这时候就像把小种子种到土里一样，要轻轻地、均匀地放好。

然后把培养皿盖上，放到合适的环境里，这个环境就像是小宝贝们的小屋子，温度啊、湿度啊都得合适。

过一段时间之后，就可以看到培养基上长出了不同的菌落啦。

这时候就像是看到小花园里开出了各种各样的花一样。

每个菌落就是由原来样品里的同一种微生物繁殖出来的。

这样呢，就通过稀释分离法把原来混在一起的微生物分开啦。

这就是稀释分离法的大概步骤啦，是不是还挺好玩的呀？。

连续梯度稀释

连续梯度稀释
连续梯度稀释是一种常见的生物学实验方法，用于分离和纯化蛋白质、DNA或其他生物大分子。

该方法基于不同密度的溶液在离心过程中的分层原理，通过在离心管中形成梯度，将大分子沉淀到梯度的不同位置，从而实现分离纯化的目的。

连续梯度稀释的优点在于可以在较短时间内得到高纯度的生物大分子，同时可以根据实验需求调整梯度的浓度和形状。

该方法广泛应用于生物学、生物化学和医学研究领域中，对于分离和研究生物大分子具有重要意义。

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